CN111748649A

CN111748649A - 一种同时检测人流感病毒与新型冠状病毒的荧光定量检测试剂盒

Info

Publication number: CN111748649A
Application number: CN202010552644.7A
Authority: CN
Inventors: 吴兰; 周奇; 章意星
Original assignee: Shanghai Homogene Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Homogene Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-13
Filing date: 2020-06-13
Publication date: 2020-10-09

Abstract

本发明涉及一种同时检测人甲型流感病毒、乙型流感病毒、以及新型冠状病毒的荧光定量检测试剂盒，属于核酸检测技术领域。所述检测试剂盒具体包括：四组特异性引物对与探针、阴性质控品、阳性质控品、及荧光定量PCR反应体系；所述四组特异性引物对与探针分别为检测甲型流感病毒与乙型流感病毒各一对特异性引物与一条探针、检测新型冠状病毒的两对特异性引物与两条探针；所述阳性质控品为一条人工合成的靶序列，阴性质控品为去离子水；所述荧光定量PCR反应体系为进行PCR反应的各组分及反应条件。本发明试剂盒在病毒序列的保守位点处设计特异性引物对与探针，可实现单管同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒与新型冠状病毒，检测特异性强、灵敏度高，能够准确快速地从人群中将流感与新冠肺炎患者区别开来，从而做到早发现、早隔离、早治疗。该试剂盒在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。

Description

一种同时检测人流感病毒与新型冠状病毒的荧光定量检测试剂盒

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种同时检测人流感病毒与新型冠状病毒的荧光定量检测试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒(2019 Novel coronavirus，2019-nCoV)是一种正义单链RNA冠状病毒，是一类以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。人感染了新型冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。流行病学调查显示，病例多可以追踪到与确诊的病例有过近距离密切接触的情况。确诊病例需有病原学证据阳性结果，即实时荧光PCR检测新型冠状病毒核酸阳性。

越来越多的事实表明，不少新冠肺炎患者本身无症状，或仅有轻微症状，但是他们却能够将病毒传染给他人。初步估算，这些隐性病例可能占所有感染病例的60％左右，这些新冠感染者无症状或者症状轻微，但他们传播病毒的能力并不低，这些隐性感染者可能会引发新一轮的疫情大爆发。如何从人群中将这些隐性病例分辩出现，从而遵循“早诊断、早治疗、早隔离”的原则，或许是解决这一难题的前提条件。

新冠肺炎防控的另一个难点在于，其部分症状(尤其是轻症)与流感的症状相似，这种“季节性”与“症状类似性”的重叠，使得针对新型冠状病毒的防控更加困难。再者，有临床研究报告了部分出院后检测又恢复阳性的案例。有观点认为新冠肺炎可能会成为长期感染的慢性病，疫情也可能“长期化”。因此，快速、准确地诊断新型冠状病毒是疾病防控的重中之重。

对于呼吸道病毒感染的诊断，病毒分离培养法，是病毒诊断的“金标准”，但其费力费时、生物安全风险较高，无法应付暴发性流行病。免疫学检查是临床门诊检验常用的方法，但对于新型冠状病毒及流感病毒这种RNA病毒，会因为病毒抗原发生变异而出现假阴性结果。基于实时定量PCR的分子生物学诊断方法，灵敏度高，特异性强，可以同时检测多种病毒，是一种经济、快速、高效、简便的呼吸道病毒的多病原体检测方法，可以满足疾病监测、卫生防疫、临床诊断、传染病流行病学研究的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时检测人流感病毒与新型冠状病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法，将新冠肺炎患者与流感患者区别开来、将新冠肺炎患者从隐性感染中鉴定出来。解决了现有诊断手段中针对不同病毒需要多次重复检测的问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种基于TaqMan探针荧光定量PCR方法同时检测人流感病毒与新型冠状病毒，所述人流感病毒包括甲型流感病毒与乙型流感病毒，所述新型冠状病毒为2019-nCoV，所述检测试剂盒包括：四组特异性引物对与探针、阳性质控品、阴性质控品、PCR反应体系。

每组特异性引物对与探针包含一对特异性引物与一条特异性探针，阳性质控品为一条人工合成的基因序列，阴性质控品为去离子水。

基于人甲型流感病毒M2e区高度保守，人乙型流感病毒HA1区高度保守，人新型冠状病毒E基因与N基因区高度保守，分别设计了针对这四个保守区的荧光定量PCR特异性引物对与探针，具体的引物与探针序列信息如下：

针对人甲型流感病毒，特异性引物对包括引物1和引物2，引物1的序列如SEQ IDNo.1，引物2的序列如SEQ ID No.2；探针1的序列如SEQ ID No.3；

针对人乙型流感病毒，特异性引物对包括引物3和引物4，引物3的序列如SEQ IDNo.4，引物4的序列如SEQ ID No.5；探针2的序列如SEQ ID No.6；

针对人新型冠状病毒，特异性引物对包括引物5和引物6，引物5的序列如SEQ IDNo.7，引物6的序列如SEQ ID No.8；探针3的序列如SEQ ID No.9；

针对人新型冠状病毒，特异性引物对包括引物7和引物8，引物7的序列如SEQ IDNo.10，引物8的序列如SEQ ID No.11；探针4的序列如SEQ ID No.12。

其中，四条探针的5’端采用不同的荧光色(FAM、ROX、Cy5、VIC)进行标记，探针的3’端进行标记的淬灭基团为MGB。

进一步地，探针1的5’端标记FAM荧光基团，探针2的5’端标记ROX荧光基团，探针3的5’端标记Cy5荧光基团，探针4的5’端标记VIC荧光基团。

所述基于TaqMan探针荧光定量PCR方法单管同时人流感病毒和新型冠状病毒的引物，在检测人流感病毒(包括甲型流感病毒与乙型流感病毒)和新型冠状病毒中的应用在本发明的保护范围之内。

具体信息如表1所示：

表1

其中，阳性质控品靶序列中包含了一段人甲型流感病毒M2e保守区174bp的片段(覆盖特异性引物对及探针)，一段人乙型流感病毒HA1保守区200bp的片段(覆盖特异性引物对及探针)，一段人冠状病毒E基因保守区161bp的片段(覆盖特异性引物对及探针)，一段人冠状病毒N基因保守区113bp的片段(覆盖特异性引物对及探针)；上述阳性质控品序列由人工合成；具体阳性质控品序列如SEQ ID No.13，序列信息如下：

其中，采用四重荧光定量PCR检测试剂盒进行检测，具体方法如下：

1)核酸样本的提取：取待检样品，抽取总RNA；

2)qRT-PCR反应：在检测管中分析加入四组特异性引物对与探针、2×反应液、逆转录酶、DNA聚合酶、及步骤1)中提取的RNA配置反应体系；取阴性质控品与阳性质控品分别配置与待检样本一致的反应体系；将上述三个反应体系进行qRT-PCR反应；

3)qRT-PCR反应条件如下：42℃ 10min，95℃ 5min；随后按照94℃ 15s，56℃ 20s条件进行30个cycles，检测荧光信号。

4)结果判读：通过步骤2)阴性质控品的荧光信号设置阈值，控制阳性质控品在四个检测通过均有S型扩增曲线，将待检样本所得扩增曲线与阳性质控品进行比对，读取结果(见表2)。

表2

荧光通道	FAM	ROX	Cy5	VIC
					人甲型流感	阳性(+)	阴性(-)	阴性(-)	阴性(-)
人乙型流感	阴性(-)	阳性(+)	阴性(-)	阴性(-)
					新冠肺炎	阴性(-)	阴性(-)	阳性(+)	阴性(-)
新冠肺炎	阴性(-)	阴性(-)	阴性(-)	阳性(+)

本发明的有益效果：本发明可快速同时将新冠肺炎患者与流感患者区别开来、将新冠肺炎患者从隐性感染中鉴定出来，解决了现有诊断手段中针对不同病毒需要多次重复检测的问题；该试剂盒具有检测灵敏度高、特异性强、可实现多重快速检测、操作简单、应用方便等突出的优点，为疾病监测、卫生防疫、临床诊断、传染病流行病学研究的需要。

附图说明

图1为实施例1样本扩增曲线图。

图2为实施例2样本扩增曲线图。

图3为实施例3样本扩增曲线图。

图4为实施例4样本扩增曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于详细说明本发明，以便更好地理解本发明，然而，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

待测样品：咽拭子。

对照表3进行结果判断，具体扩增曲线如图1所示。

如图1，阴性质控品对照无扩增曲线，阳性质控品在FAM，ROX，Cy5，VIC四个荧光通道均有S型扩增曲线，待检样品仅在FAM荧光通道有S型扩增曲线，Ct值≤36，因此判定该检测样品为甲型流感阳性。

实施例2

待测样品：咽拭子。

对照表3进行结果判断，具体扩增曲线如图2所示。

如图2，阴性质控品对照无扩增曲线，阳性质控品在FAM，ROX，Cy5，VIC四个荧光通道均有S型扩增曲线，待检样品仅在ROX荧光通道有S型扩增曲线，Ct值≤36，因此判定该检测样品为乙型流感阳性。

实施例3

待测样品：疑似新冠肺炎患者样本cDNA。

对照表3进行结果判断，具体扩增曲线如图3所示。

如图3，阴性质控品对照无扩增曲线，阳性质控品在FAM，ROX，Cy5，VIC四个荧光通道均有S型扩增曲线，待检样品在Cy5，VIC两个荧光通道有S型扩增曲线，Ct值≤36，因此判定该检测样品为新冠肺炎阳性。

实施例4

选择与人流感病毒核酸序列具有同源性、易引起相似临床症状的其他病原体，如呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒为待检样本，用本发明试剂盒进行检测，操作严格按照试剂盒说明书进行，扩增曲线如图4所示，检测结果均为阴性，表明本发明试剂盒具备较好检测特异性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.单管同时检测人甲型流感病毒、乙型流感病毒、及新型冠状病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征是：通过在NCBI基因序列库中比对多种人甲型流感病毒(及乙型流感病毒、新型冠状病毒)的基因序列，在保守位点处设计特异性引物对和探针；所述检测试剂盒具体包括：分别针对人甲型流感病毒、乙型流感病毒、及新型冠状病毒的四组特异性引物对和探针；阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为一条人工合成的靶序列，阴性质控品为去离子水；荧光定量PCR反应条件。

2.如权利要求1所述同时检测人甲型流感病毒、乙型流感病毒、及新型冠状病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征是：

针对人甲型流感病毒，特异性引物对包括引物1和引物2，引物1的序列如SEQ ID No.1，引物2的序列如SEQ ID No.2；探针1的序列如SEQ ID No.3；

针对人乙型流感病毒，特异性引物对包括引物3和引物4，引物3的序列如SEQ ID No.4，引物4的序列如SEQ ID No.5；探针2的序列如SEQ ID No.6；

针对人新型冠状病毒，特异性引物对包括引物5和引物6，引物5的序列如SEQ ID No.7，引物6的序列如SEQ ID No.8；探针3的序列如SEQ ID No.9；

3.如权利要求2所述同时检测人甲型流感病毒、乙型流感病毒、及新型冠状病毒荧光定量检测试剂盒，其特征是：

采用不同的荧光色对所述四条探针序列进行荧光标记。

4.如权利要求3所述同时检测人甲型流感病毒、乙型流感病毒、及新型冠状病毒荧光定量检测试剂盒，其特征是：

对所述探针序列的5’端进行标记的荧光基团具体为FAM、ROX、Cy5、VIC，对3’端进行标记的淬灭基团为MGB。

5.如权利要求1所述同时检测人甲型流感病毒、乙型流感病毒、及新型冠状病毒荧光定量检测试剂盒，其特征是：所述阳性质控品靶序列中包含了一段人甲型流感病毒M2e保守区174bp的片段(覆盖特异性引物对及探针)，一段人乙型流感病毒HA1保守区200bp的片段(覆盖特异性引物对及探针)，一段人冠状病毒E基因保守区161bp的片段(覆盖特异性引物对及探针)，一段人冠状病毒N基因保守区113bp的片段(覆盖特异性引物对及探针)；上述阳性质控品序列由人工合成。

6.如权利要求5所述同时检测人甲型流感病毒、乙型流感病毒、及新型冠状病毒荧光定量检测试剂盒，其特征是：所述具体阳性质控品序列如SEQ ID No.13。

7.采用四重荧光定量检测试剂盒进行检测，具体方法如下：

1)核酸样本的提取：取待检样，抽取总RNA；

3)结果判读：通过步骤2)阴性质控品的荧光信号设置阈值，控制阳性质控品在四个检测通过均有S型扩增曲线，将待检样本所得扩增曲线与阳性质控品进行比对，读取结果。

8.如权利要求8所述四重荧光定量检测试剂盒进行检测，具体反应条件如下：42℃10min，95℃ 5min；随后按照94℃ 15s，56℃ 20s条件进行30个cycles，检测荧光信号。