CN116121439A - 一种多重定量pcr检测真菌的方法以及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用多重定量PCR技术同时鉴定真菌的方法。本发明针对烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和微小根毛霉四种重要真菌，设计特异性引物和探针，利用多重荧光定量PCR，一次性同时鉴定临床样本中是否存在烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和微小根毛霉感染，减少重要真菌的检测周期、降低检测成本，有效实现真菌感染的快速诊断。

Description

一种多重定量PCR检测真菌的方法以及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术及分子诊断领域，具体涉及一种利用多重定量PCR技术同时鉴定四种重要真菌的方法。
背景技术
大多数真菌在环境中无处不在，人们通过吸入孢子或小型酵母细胞会暴露在真菌中。在过去的几十年中，由于免疫功能低下的患者数量不断增加，真菌疾病的临床相关性显著增加。据不完全估计，我国约7100万人患有真菌病，除HIV/AIDS或血液系统恶性肿瘤外，多种新的宿主风险因素，尤其是COPD、哮喘和肺癌，均与真菌病有关。根据既往的研究表明，机会性真菌感染的死亡率超过50％，而在感染曲霉菌的骨髓移植受者中，死亡率高达95％。常见的真菌病包括曲霉菌病、毛霉菌病和肺隐球菌病等。
烟曲霉是人类曲霉病的主要原因。在全球范围内，每年约有480万例过敏性支气管肺曲霉病、300万例慢性肺曲霉病和25万例侵袭性曲霉病患者。除此之外，烟曲霉已经成为严重免疫功能低下患者感染性死亡的最常见原因之一。近年来，毛霉病的发病率在全球范围内呈上升趋势，尤其是在印度和中国未控制的糖尿病患者中的发病率非常高。毛霉菌病进展迅速，难以诊断，主要影响免疫功能低下的患者和糖尿病患者。许多病例由于难以从深层组织收集样本和诊断测试的敏感性低而仍未得到诊断。而微小根毛霉感染引起的正是毛霉病，通常在免疫系统较弱的患者的肺部发现，并且通常会导致致命的后果。新型隐球菌是一种普遍存在的机会性酵母菌。由新型隐球菌引起的隐球菌病在世界范围内广泛分布，绝大多数有症状的播散性感染患者具有已确定的潜在免疫功能低下状况。大多数新型隐球菌感染发生在肺部，但是真菌性脑膜炎，特别是作为艾滋病患者的继发感染，通常是由新型隐球菌引起的。除此之外，随着近年来mNGS的广泛应用，诊断为由耶氏肺孢子菌感染引起的耶氏肺孢子菌肺炎也越来越多。它是一种条件性肺部感染性疾病。鉴于耶氏肺孢子菌肺炎的病情进展快、致死率高，耶氏肺孢子菌的快速鉴定有利于及时的抗感染治疗、改善预后。
目前临床上对于真菌检测技术包括形态学检查、培养、鉴定、药敏试验、免疫学检测等。但这些方法或是培养时间长，或是特异性低。耶氏肺孢子菌却是不典型的真菌，没法通过在培养基上培养进行检测。而分子生物学技术则具有检测特异性高、操作简单且方便、价格低廉等特点，在真菌检测方面具有一定的应用。但由于传统的qPCR只能检测单个物种，若检测多个物种时，则需要重复操作，不仅实验过程耗时长、而且检测成本高，无法满足临床快速诊断病原的需求。因此，开发一种能够快速鉴定多种常见真菌的方法显得十分重要。
发明内容
本发明提供一种利用多重定量PCR技术同时鉴定四种常见真菌的方法，能够一次性同时检测烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和微小根毛霉四种重要真菌，具有灵敏度高、特异性强、检测周期短、效率高、成本低等优势，体现出更高的可行性与应用前景。
一种多重定量PCR检测真菌的试剂盒，其中包括有用于多重定量PCR反应对真菌进行检测的引物组合，所述的引物组合包括：
用于对烟曲霉进行进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；
用于对新型隐球菌进行进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；
用于对耶氏肺孢子菌进行烟曲霉进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ IDNO.7-8所示；
用于对进行微小根毛霉进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.10-11所示。
所述的试剂盒中还包括分别对扩增产物进行报告的探针组合；所述的探针组合包括：
用于对烟曲霉扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
用于对新型隐球菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
用于对耶氏肺孢子菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
用于对微小根毛霉扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
所述探针的5’端修饰有报告基团，所述报告基团为FAM、HEX、ROX和Cy5；四种探针采用不同的报告基团修饰。
所述探针的3’端修饰有淬灭基团，所述猝灭基团为BHQ1和BHQ2；SEQ ID NO.3所示核苷酸序列与SEQ ID NO.6所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ1修饰，SEQ ID NO.9所示核苷酸序列与SEQ ID NO.12所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ2修饰。
一种多重定量PCR检测真菌的方法，其采用上述的试剂盒进行多重定量PCR反应对烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和微小根毛霉进行鉴定。
所述的方法中，还包括对样本进行多重PCR反应的步骤。
所述的样本包括但不限于肺泡灌洗液、痰液、血液、脑脊液、心包积液、胸水、尿液、脓液、拭子和组织等。
多重定量PCR反应中的试剂包括：2×Hieff
Figure BDA0004008347520000021
Universal TaqManmultiplex qPCR master mix 12.5μL，Primer Mix(10uM)的终浓度为0.2μM，Probe Mix(10uM)的终浓度为0.1μM，10ng/μL的DNA模板1μL，无酶水补充25μL。
所述多重定量PCR扩增的反应程序为95℃预变性5min；95℃变性15s；58.5℃退火30s；扩增40个循环。
所述的方法中，如果FAM荧光修饰探针有明显的S型扩增曲线时，说明待检样本中存在烟曲霉；如果HEX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct＜40说明待检样本中存在新型隐球菌；如果ROX荧光修饰探针有明显的S型扩增曲线时，说明待检样本中存在耶氏肺孢子菌；如果Cy5荧光修饰探针有明显的S型扩增曲线时，说明待检样本中存在微小根毛霉。
有益效果
本发明的利用多重定量PCR技术同时鉴定四种重要真菌的方法，其中的检测引物组特异性强，与其它病原体的序列无法比对上。该方法可操作性高，能够在同一个反应体系中一次性鉴定烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和微小根毛霉四种重要真菌，大大简化了检测的操作复杂性，有效的缩短了临床对于这四种重要真菌的检测时间及成本，更好地提高临床对于病原菌的检测效率，具有较强的应用价值。
附图说明
图1为当FAM、HEX、ROX、Cy5荧光修饰探针均有扩增曲线时，且满足HEX的Ct＜40时，说明检测样本中存在烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和微小根毛霉四种真菌；
图2为特异性探针灵敏度扩增曲线图，A为烟曲霉，B为新型隐球菌，C为耶氏肺孢子菌，D为微小根毛霉；(2860、286、29、14、7、4、0copies、NTC)
图3为特异性验证扩增曲线结果图
图4为临床阳性样本的检测结果图
图5为临床阴性样本的检测结果图
具体实施方式
为了便于更好地理解本发明，下面将结合相关附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了对本发明作进一步解释，不对其内容进行限定。
本发明中所用实验材料、试剂仪器如下：
实验材料：烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和微小根毛霉阳性质粒、临床感染患者血液或体液样本。
实验试剂：磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(Tiangen：DP710-T2或QIAampCirculating Nucleic Acid Kit(50)：55114)；探针和引物合成(南京金斯瑞生物公司)；Hieff 
Figure BDA0004008347520000042
Universal TaqMan multiplex qPCR master mix(翌圣：11211ES08)。
实验仪器：荧光定量PCR仪(Bio-Rad：CFX384)；微孔板迷你离心机(其林贝尔：BE-6100)。
实施例1
特异性引物探针的设计及优化
1、探针引物设计
下载物种的全部基因组序列，筛选出其共有序列，在基因组序列上滑动窗口，按照参数引物设计模板窗口长度100-500bp、窗口滑动长度10-50bp，生成物种的备选引物设计模板序列；并将其与其它物种的基因组序列进行比对，以评估引物设计模板序列的特异性。除此之外，还需要满足引物设计基本原则：GC含量在30-60％之间；引物F与R的退火温度相同，均在60℃左右，而引物P的退火温度需在65℃左右；引物之间不存在引物二聚体。
基于以上的筛选原则，我们筛选出烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、新型隐球菌(Crytococcus Neoformans)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)和微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)特异性的基因序列作为引物设计的模板，设计的引物及探针核苷酸序列见表1。
表1引物及探针的核苷酸序列
Figure BDA0004008347520000041
2.阳性质粒合成
将烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子虫和微小根毛霉的PCR产物序列克隆至pUC57载体上，获得4种真菌阳性质粒，插入的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示：
Figure BDA0004008347520000051
3.标准品制备
将合成质粒浓度稀释为1ng/μL，其片段大小为3546bp，拷贝数＝(6.02×1023)×1ng/μL×10-9)/(3546bp×660)＝2.57×108copies/μL。将质粒按照10倍梯度稀释至2.57×105copies/μL，以该浓度合成质粒为模板，进行多重荧光定量PCR检测。
4.多重荧光定量PCR检测
按照表2配制qPCR反应体系：
表2qPCR反应体系
Figure BDA0004008347520000052
Figure BDA0004008347520000061
按照表3设置qPCR反应程序，在退火/延伸此步骤收集荧光。
表3 qPCR反应程序
Figure BDA0004008347520000062
结果分析：多重荧光定量PCR扩增曲线如图1所示，表示了四种荧光的强度与扩增循环数的关系。四个靶标均为S型扩增曲线，退火温度为58.5℃时检测效果最佳。四种荧光扩增曲线结果见图1。
实施例2
多重实时荧光方法验证
1.灵敏性验证
(1)标准品制备
取2.57×105 copies/μL的质粒进行10倍梯度稀释，获得浓度分别为2570、257、26、13、7、4 copies/μL的阳性合成质粒作为DNA模板，每个反应孔加入1 μL模板，每个梯度设置3个重复。
(2)多重荧光定量PCR检测
以实施例1步骤1中针对烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子虫和微小根毛霉的检测引物和检测探针作为引物和探针，按照实施例1中步骤4进行多重荧光定量PCR检测。结果如图2所示，2570、257、26、13和7 copies的扩增曲线为S型，且3个重复均可检出。因此，本发明的四种真菌多重荧光定量PCR的检测下限为7 copies/反应。四个物种的灵敏度验证扩增曲线结果见图2。
2. 特异性验证
(1)样本DNA提取
采用磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒或QIAamp Circulating Nucleic AcidKit对体液样本进行DNA提取，具体操作步骤见试剂盒说明书。
(2)多重荧光定量PCR检测
分别以黄曲霉、米曲霉mNGS阳性样本验证烟曲霉探针引物的特异性；以加特隐球菌VGII型mNGS阳性样本验证新型隐球菌的特异性；以米氏假根毛霉mNGS阳性样本验证微小根毛霉的特异性；耶氏肺孢子虫无注释同属菌，未进行该测试。以实施例1步骤1中针对烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子虫和微小根毛霉的检测引物和检测探针作为引物和探针，按照实施例1中步骤4进行多重荧光定量PCR检测。结果见表4和图3，结果表明本发明设计的探针引物具有很强的特异性。
表4特异性验证实验结果
Figure BDA0004008347520000071
实施例3
临床样本检测
1.样本DNA提取
以本发明所建立的同时针对烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子虫和微小根毛霉的多重实时荧光PCR检测方法对12份临床感染患者的样本进行检测，样本类型包括肺泡灌洗液和血液。采用磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒或QIAamp Circulating Nucleic AcidKit对体液样本进行DNA提取，具体操作步骤见试剂盒说明书。
2.多重荧光定量PCR检测
以实施例1步骤1中针对烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子虫和微小根毛霉的检测引物和检测探针作为引物和探针，按照实施例1中步骤4进行多重荧光定量PCR检测。结果见表5，结果显示本发明所建立的方法与mNGS测序结果完全一致，本发明准确、可靠。部分临床阳性样本与阴性样本的检测结果见图4与图5。
表5临床样本检测结果荧光定量PCR检测Ct值
Figure BDA0004008347520000081
以上所述实施例仅为本发明的几种优选实施方式，并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种多重定量PCR检测真菌的试剂盒，其特征在于，其中包括有用于多重定量PCR反应对真菌进行检测的引物组合，所述的引物组合包括：
用于对烟曲霉进行进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；
用于对新型隐球菌进行进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；
用于对耶氏肺孢子菌进行烟曲霉进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ IDNO.7-8所示；
用于对进行微小根毛霉进行检测的正反向引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.10-11所示。
2.根据权利要求1所述的多重定量PCR检测真菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括分别对扩增产物进行报告的探针组合；所述的探针组合包括：
用于对烟曲霉扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
用于对新型隐球菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
用于对耶氏肺孢子菌扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
用于对微小根毛霉扩增产物进行报告的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
3.根据权利要求1所述的多重定量PCR检测真菌的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端修饰有报告基团，所述报告基团为FAM、HEX、ROX和Cy5；四种探针采用不同的报告基团修饰。
4.根据权利要求1所述的多重定量PCR检测真菌的试剂盒，其特征在于，所述探针的3’端修饰有淬灭基团，所述猝灭基团为BHQ1和BHQ2。
5.根据权利要求4所述的多重定量PCR检测真菌的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列与SEQ ID NO.6所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ1修饰，SEQ ID NO.9所示核苷酸序列与SEQ ID NO.12所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ2修饰。
6.一种多重定量PCR检测真菌的方法，其特征在于，其采用上述的试剂盒进行多重定量PCR反应对烟曲霉、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌和微小根毛霉进行鉴定。
7.根据权利要求6所述的多重定量PCR检测真菌的方法，其特征在于，所述的方法中，还包括对样本进行多重PCR反应的步骤。
8.根据权利要求6所述的多重定量PCR检测真菌的方法，其特征在于，所述的样本包括但不限于肺泡灌洗液、痰液、血液、脑脊液、心包积液、胸水、尿液、脓液、拭子和组织等。
9.根据权利要求6所述的多重定量PCR检测真菌的方法，其特征在于，多重定量PCR反应中的试剂包括：2×Hieff 
Figure FDA0004008347510000011
Universal TaqMan multiplex qPCR master mix 12.5μL，Primer Mix(10uM)的终浓度为0.2μM，Probe Mix(10uM)的终浓度为0.1μM，10ng/μL的DNA模板1μL，无酶水补充25μL。
10.根据权利要求6所述的多重定量PCR检测真菌的方法，其特征在于，所述多重定量PCR扩增的反应程序为95℃预变性5min；95℃变性15s；58.5℃退火30s；扩增40个循环；所述的方法中，如果FAM荧光修饰探针有明显的S型扩增曲线时，说明待检样本中存在烟曲霉；如果HEX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct＜40说明待检样本中存在新型隐球菌；如果ROX荧光修饰探针有明显的S型扩增曲线时，说明待检样本中存在耶氏肺孢子菌；如果Cy5荧光修饰探针有明显的S型扩增曲线时，说明待检样本中存在微小根毛霉。
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