CN114507752A - 一种检测汉城型汉坦病毒的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药生物领域，涉及一种人畜共患病毒的检测，特别涉及汉城型汉坦病毒的检测和鉴定。本发明检测和鉴定病毒的的引物包括：第1组引物SEO‑S Assay和第2组引物SEO‑M Assay。

Description

一种检测汉城型汉坦病毒的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于医药生物领域，涉及一种人畜共患病毒的检测，特别涉及汉城型汉坦病毒的检测和鉴定。
背景技术
汉坦病毒(Hantavirus,HV)属布尼亚病毒科汉坦病毒属，是一种分节段的、单股、负链RNA病毒，其基因组由S(small)、M(medium)和L(large)三个片段组成。到目前为止，汉坦病毒至少可分为40个血清型/基因型，其中至少有22个型可引起人类疾病，且不同的汉坦病毒在致病性、疾病谱以及自然携带宿主上都各不相同。该病毒在临床上主要引起欧亚地区的肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS)和美洲的汉坦病毒肺综合征(Hantavirus Pulmonary Syndrome,HPS)。
我国是肾综合征出血热的高发国家，每年报告发病人数在2-5万，占世界该病总数的90％以上。长期以来，汉滩型(Hantaan,HTNV)和汉城型(Seoul,SEOV)病毒是存在于我国的两个主要血清型，其宿主分别为黑线姬鼠(Apodemus agrarius)和褐家鼠(Rattusnorvegicus)。至2003年，在东北棕背
Figure BDA0002983353700000011
中发现普马拉型汉坦病毒的存在；2007年，证实我国东北地区大林姬鼠携带Amur汉坦病毒，中国检科院于2009年亦在长白口岸鼠类证实Amur汉坦病毒的存在。
2019年我国北部重点口岸监测的鼠类动物自然感染病原体检测中，从葫芦岛口岸捕获的褐家鼠中检出肾综合征出血热病原体汉坦病毒核酸阳性4例(4/31)，均为汉城型病毒，带毒率为12.90％；从长白口岸的大林姬鼠肺组织检测出汉坦病毒核酸阳性5例(5/54)，为Amur型汉坦病毒，在大林姬鼠中汉坦病毒的带毒率为9.26％。
葫芦岛口岸2017、2018和2019年均从褐家鼠体内检测到汉城型汉坦病毒阳性。而病毒可通过宿主动物的血液、唾液、尿液及粪便排出，传播途径广泛，除加强鼠类密度监测外，还应对鼠携带病原体进行精准分型检测，以降低肾综合征出血热的传播风险。
目前汉坦病毒的检测方法主要有血清学检测方法(抗原检测、抗体检测)和核酸检测检测方法，包括免疫荧光法(IFA)、酶联免疫法(ELISA)、胶体金法、实时荧光RT-PCR法等。
免疫荧光法(IFA)是现行监测方案中推荐的宿主动物中汉坦病毒监测的方法，操作简便，但结果判断易受主观性因素影响，且存在不能用于高通量检测等问题；酶联免疫法具有较高的灵敏度，操作简单，适合高通量检测，便于临床日常检测与大规模的血清学流行病调查，但是其对汉坦病毒型别的判定存在不足；胶体金法具有简便、廉价等优点，适于基层单位和现场检测，但灵敏度低，只能定性，不能定量检测；RT-PCR法，具有高特异性、高灵敏度的优点，可以进行定量检测，并可进行型别判断，但其分析结果严重依赖循环阈值(Ct值)，无法准确检测低丰度样本。
本发明采用的数字PCR技术不依赖标准曲线和扩增循环阈值，可直接定量检测核酸，属于终点检测，某些程度上，扩增不会造成定量的偏倚，对PCR抑制剂更为耐受，在改善定量分析准确性和变异性上有较大优势；对于核酸含量极低的样品，检测灵敏度更高；并且通过微滴阅读和数据分析软件，可使微滴质控实现可视化，与RT-PCR法相比，更容易判断并剔除假阳性，提高了检测的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于汉城型汉坦病毒检测的引物。
本发明的引物包括：第1组引物SEO-S Assay和第2组引物SEO-M Assay，
第1组引物SEO-S Assay，包括：
SEO-S-3F AGGCAACCATAAACATAAC
SEO-S-3R TCGGAAGAAATCATCATTC
SEO-S-3P ATCAATCATACCTCAGACGCACAC
第2组引物SEO-M Assay，包括：
SEO-M-2F CCTGCAATGTATTCTGTG
SEO-M-2R CAGACACATTGGAGAAGTA
SEO-M-2P CTTATCAGGACCAGGTGCTTCAT
。
本发明的另一个目的在于提供一种用于汉城型汉坦病毒检测的试剂盒。
本发明的试剂盒，包含第1组引物SEO-S Assay和/或第2组引物SEO-M Assay。
本发明的另一个目的在于提供试剂盒在检测汉城型汉坦病毒中的应用。
试剂盒的应用同下述的检测方法。
本发明的目的在于提供一种汉城型汉坦病毒的检测方法。该方法具有灵敏度高、准确度高等特点。
本发明针对汉城型(Seoul,SEO)汉坦病毒的S、M片段设计多对引物和探针，并利用qPCR检测其特异性，确定了本发明中汉城型汉坦病毒检测用引物、探针组合，如下：
Figure BDA0002983353700000031
本发明优化了PCR反应条件，建立了多重数字PCR反应体系，可同时针对汉坦病毒的S、M片段进行检测，可防止因单个基因片段检测引起的漏检，检测结果更准确。本发明还加入了针对鼠源β-actin基因检测的引物和探针，对检测过程起到质控的作用，保证对检测结果做出准确判断。
本发明所述的一种非疾病的诊断和治疗目的的汉城型汉坦病毒的检测方法，包括以下步骤：
(1)样本中RNA提取，
(2)扩增体系配置，
(3)微滴阵列生成，PCR扩增，
(4)扩增结果分析。
具体的，本发明所述的汉城型汉坦病毒的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本RNA，提取方法属于现有技术，使用商品化提取试剂盒，提取人或动物的组织、细胞或血样中的RNA，-80℃储存备用；
(2)以待测样本RNA和cDNA为模板均可，检测所用特异性引物和荧光探针序列如下：
Figure BDA0002983353700000041
不同模板反应体系组成及配制方法如下：
(a)以待测样本RNA为模板反应体系如下：
试剂名称 加入体积(μL)1×
qScript<sup>TM</sup> XLT One-Step RT-qPCR ToughMix 12.5
Fluorescein sodium salt(1μM) 2.5
SEO-S Assay(25×)FAM 2
SEO-M Assay(25×)HEX 1
β-actin Assay(25×)CY5 1
H<sub>2</sub>O和RAN模板 6
总体积 25μL
qScriptTM XLT One-Step RT-qPCR ToughMix：一种即用型一步式RT-qPCR预混液。
Fluorescein sodium salt(1μM)：参比荧光钠盐。
SEO-S Assay(25×)FAM：汉城型汉坦病毒S片段检测用引物探针混合液，荧光报告基团为FAM。
SEO-M Assay(25×)HEX：汉城型汉坦病毒M片段检测用引物探针混合液，荧光报告基团为HEX。
β-actin Assay(25×)CY5：动物源基因β-actin检测用引物探针混合液，荧光报告基团为CY5。
RAN模板：以提取的RNA作为扩增的模板(b)以待测样本cDNA为模板反应体系如下：
试剂名称 加入体积(μL)1×
PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix,5× 5
Fluorescein sodium salt(1μM) 2.5
SEO-S Assay(25×)FAM 2
SEO-M Assay(25×)HEX 1
β-actin Assay(25×)CY5 1
H<sub>2</sub>O和待测cDNA样本 13.5
总体积 25μL
PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix,5×：多重qPCR反应预混液
Fluorescein sodium salt(1μM)：参比荧光钠盐
SEO-S Assay(25×)FAM：汉城型汉坦病毒S片段检测用引物探针混合液，荧光报告基团为FAM。
SEO-M Assay(25×)HEX：汉城型汉坦病毒M片段检测用引物探针混合液，荧光报告基团为HEX。
β-actin Assay(25×)CY5：动物源基因β-actin检测用引物探针混合液，荧光报告基团为CY5。
待测cDNA样本：提取的RNA经反转录后生成cDNA，以此作为多重qPCR的模板。
(3)上述体系配制完成后，加入Sapphire Chip中，每孔25μL，将芯片放入CrystalDigital PCR System中进行PCR扩增，
(4)PCR反应完成后，将芯片取出，放置于NaicaTM prism微滴阅读分析系统扫描芯片、分析数据。
优选的，本发明所述的汉城型汉坦病毒的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本RNA，提取方法属于现有技术，使用商品化提取试剂盒，提取人或动物的组织、细胞或血样中的RNA，-80℃储存备用；
(2)以待测样本RNA和cDNA为模板均可，检测所用特异性引物和荧光探针序列如下：
Figure BDA0002983353700000051
Figure BDA0002983353700000061
不同模板反应体系组成及配制方法如下：
(a)以待测样本RNA为模板反应体系如下：
试剂名称 加入体积(μL)1×
qScript<sup>TM</sup> XLT One-Step RT-qPCR ToughMix 12.5
Fluorescein sodium salt(1μM) 2.5
SEO-S Assay(25×)FAM 2
SEO-M Assay(25×)HEX 1
β-actin Assay(25×)CY5 1
H<sub>2</sub>O和RAN模板 6
总体积 25μL
(b)以待测样本cDNA为模板反应体系如下：
试剂名称 加入体积(μL)1×
PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix,5× 5
Fluorescein sodium salt(1μM) 2.5
SEO-S Assay(25×)FAM 2
SEO-M Assay(25×)HEX 1
β-actin Assay(25×)CY5 1
H<sub>2</sub>O和待测cDNA样本 13.5
总体积 25μL
(3)上述体系配制完成后，加入Sapphire Chip中，每孔25μL，将芯片放入CrystalDigital PCR System中进行PCR扩增，反应条件如下：
Figure BDA0002983353700000062
(4)PCR反应完成后，将芯片取出，放置于NaicaTM prism微滴阅读分析系统扫描芯片、分析数据。
本发明建立汉坦病毒汉城型数字PCR基因分型检测技术，分为四个步骤：首先进行引物探针设计，汉坦病毒-汉城型特异性引物探针，针对汉城型病毒S基因片段、汉城型M基因片段设计引物，每个基因片段设计两组引物，用染料法qPCR验证其特异性，选出后续试验用引物；然后根据选出的引物设计检测用探针，并进行引物探针组合特异性验证及条件优化，用已知的阳性样本和阴性样本测试特异性；进而设计数字PCR方法体系，包含单重、双重和三重组合型干扰性验证、拷贝数浓度对比验证等三重探针组合型验证及条件优化；最后对50个未知样本进行检测。最终建立起汉城型汉坦病毒数字PCR基因分型检测技术。
本发明的试剂盒和检测方法对于检测汉坦病毒(汉城型)具有非常好的灵敏度和准确性。数字PCR技术通过将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器(微滴)中，在每个微反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子，实现了单分子模板PCR扩增，对于核酸含量极低的样品，检测灵敏度更高；通过微滴阅读和数据分析软件进行数据自动化分析，使微滴质控实现可视化，与RT-PCR法相比，检测结果准确性高；数字PCR技术不依赖标准曲线和扩增循环阈值，可直接定量检测核酸，属于终点检测，某些程度上，扩增不会造成定量的偏倚，对PCR抑制剂更为耐受，在改善定量分析准确性和变异性上有较大优势。
说明书中出现的术语：
Sapphire Chip：Sapphir芯片，一种油相内置的数字PCR芯片
Crystal Digital PCR System：全自动微滴芯片数字PCR仪系统
NaicaTM prism：微滴阅读分析系统
CFX96TM Real-Time System：CFX96型荧光定量PCR系统
iQTM
Figure BDA0002983353700000071
Green Supermix：一种染料法qPCR预混液
5×iScript Reaction mix：一种反转录试剂预混液
iScript Reverse transcriptase：一种反转录酶
RNA template：RNA模板
Bio-Rad SYBR mix：Bio-Rad品牌的一种染料法荧光定量PCR试剂混合液
附图说明
图1、引物对SEO-S-1F/R检测阳性HLD-F-10-cDNA样本(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图2、引物对SEO-S-3F/R检测阳性HLD-F-10-cDNA样本(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图3、引物对SEO-M-2F/R检测阳性HLD-F-10-cDNA样本(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图4、引物对SEO-M-3F/R检测阳性HLD-F-10-cDNA样本(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图5、引物对SEO-S-1F/R检测阴性样本YSFH-F-5(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图6、引物对SEO-S-3F/R检测阴性样本YSFH-F-5(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图7、引物对SEO-M-2F/R检测阴性样本YSFH-F-5(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图8、引物对F/R-actin检测样本YSFH-F-5(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图9、汉坦病毒汉城型探针组合检测样品HLD-F-10(cDNA)一维图(A为汉城型S片段检测结果，B为汉城型M片段检测结果，C为动物源基因检测结果)注：阈值线以上是阳性微滴，即含有靶基因的微滴；阈值线以下是阴性微滴，即不含有靶基因的微滴。图10、汉坦病毒汉城型探针组合检测样品SYFH-F-28(cDNA)一维图(A为汉城型S片段检测结果，B为汉城型M片段检测结果，C为动物源基因检测结果)
注：阈值线以上是阳性微滴，即含有靶基因的微滴；阈值线以下是阴性微滴，即不含有靶基因的微滴。
图11、汉城型探针组合检测样品HLD-F-10(RNA)一维图(A为汉城型S片段检测结果，B为汉城型M片段检测结果，C为动物源基因检测结果)
注：阈值线以上是阳性微滴，即含有靶基因的微滴；阈值线以下是阴性微滴，即不含有靶基因的微滴。
图12、汉城型探针组合检测样品HLD-F-10(cDNA)一维图(A为汉城型S片段检测结果，B为汉城型M片段检测结果，C为动物源基因检测结果)
注：阈值线以上是阳性微滴，即含有靶基因的微滴；阈值线以下是阴性微滴，即不含有靶基因的微滴。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
实施例1、汉坦病毒(汉城型)引物探针设计
(一)目的
对汉城型引物组进行验证。
(二)材料、试剂与仪器
1、主要仪器设备
仪器名称 厂家
CFX96<sup>TM</sup> Real-Time System Bio-Rad
2、主要试剂
Figure BDA0002983353700000091
3、实验材料
Figure BDA0002983353700000092
4、引物合成
Figure BDA0002983353700000093
(三)实验流程
1、cDNA合成体系和流程
Figure BDA0002983353700000094
Figure BDA0002983353700000101
2、cDNA样本处理：将上述20μL cDNA模板补水至200μL，并分装备用。
3、PCR体系和流程：
Figure BDA0002983353700000102
(四)检测结果
1、针对汉城型(Seoul,SEO)的S片段检测结果
(1)Ct值
样品名称 引物组合 Ct值(Mean)
HLD-F-10-cDNA SEO-S-1F/R 22.67
NTC SEO-S-1F/R NA
HLD-F-10-cDNA SEO-S-3F/R 22.35
NTC SEO-S-3F/R NA
(2)扩增曲线
如图1和图2所示。
2、针对汉城型(Seoul,SEO)的M片段检测结果
(1)Ct值
样品名称 引物组合 Ct值(Mean)
HLD-F-10-cDNA SEO-M-2F/R 22.79
HLD-F-10-cDNA SEO-M-3F/R 22.43
(2)扩增曲线
如图3和图4所示。
(五)结果描述与结论
1、针对汉城型汉坦病毒(Seoul,SEO)的S片段设计并合成两对引物，在HLD-F-10-cDNA样本中均获得扩增，两对引物Ct值相一致，并且溶解曲线是单峰，表明产物单一，可用于汉城型汉坦病毒检测。
2、针对汉城型汉坦病毒(Seoul,SEO)的M片段设计并合成两对引物，在HLD-F-10-cDNA样本中均获得扩增，两对引物Ct值相一致，与针对S片段设计的引物Ct值也相一致；并且溶解曲线是单峰，表明产物单一。但引物对SEO-M-2F/R的扩增曲线呈“S”型，要优于引物对SEO-M-3F/R，因此选择SEO-M-2F/R设计探针用于后续实验。
实施例2、汉城型引物在“阴性样本”中的特异性验证
(一)目的
汉城型引物在“阴性样本”中的特异性验证。
(二)材料、试剂与仪器
1、主要仪器设备
仪器名称 厂家
CFX96<sup>TM</sup> Real-Time System Bio-Rad
2、主要试剂：
Figure BDA0002983353700000111
3、实验材料
名称 来源 类型 A260 A260/A280 浓度(ng/μL)
YSFH-F-5 鼠肺组织 RNA 6.68 2.12 267.1
4、引物
所用引物对：SEO-S-1F/R、SEO-S-3F/R、SEO-M-2F/R。动物源检测用引物探针序列如下：
名称 序列(5′to3′) 荧光标记 引物新 病毒信息
F_B-actin GGCTCYATYCTGGCCTC 动物源
R_B-actin GCAYTTGCGGTGSACRATG 动物源
P_B-actin TACTCCTGCTTGCTGATCCACATC Cy5 R/F_B-actin 动物源
(三)实验流程
1、cDNA合成体系和流程
Figure BDA0002983353700000121
2、cDNA样本处理
将上述20μL cDNA模板补水至200μL，并分装备用。
3、PCR体系和流程
Figure BDA0002983353700000122
(四)检测结果
1、Ct值检测结果：
Primer名称 病毒基因型 待检样本 样本类型 退火温度 Ct值 备注
SEO-S-1F/R 汉城型S片段 YSFH-F-5 汉城型阴性 55℃ 35.05 未检出
SEO-S-3F/R 汉城型S片段 YSFH-F-5 汉城型阴性 55℃ 37.60 未检出
SEO-M-2F/R 汉城型M片段 YSFH-F-5 汉城型阴性 55℃ 30.59 检出
F/R-B-actin 动物源 空白 NTC 55℃ 38.13 未检出
F/R-B-actin 动物源 YSFH-F-5 汉城型阴性 55℃ 22.41 检出
2、扩增曲线和溶解曲线：
参见图5-8。
(五)结果描述与结论
1、对于S片段的引物SEO-S-1F/R和SEO-S-3F/R在YSFH-F-5中Ct值都大于35，可认为未检出，表明引物特异，两对引物可随机选择，但是根据溶解曲线结果，SEO-S-3F/R特异性更优，因此选SEO-S-3F/R作为后续实验用引物。
2、对于M片段的引物SEO-M-2F/R在YSFH-F-5中Ct＝30.59，可认为被检出，可能是该对引物不特异，升高退火温度至60℃重新检测，Ct为38.02，结果可认为未检出，表明引物特异，结果如下所示：
Primer名称 病毒基因型 待检样本 样本类型 退火温度 Ct值 备注
SEO-M-2F/R 汉城型M片段 YSFH-F-5 汉城型阴性 55℃ 38.02 未检出
SEO-M-2F/R 汉城型M片段 空白 NTC 55℃ N/A 未检出
综上可知，可选择SEO-S-3F/R，SEO-M-2F/R设计探针进行后续研究。
实施例3、汉坦病毒(汉城型)数字PCR方法的建立
(一)目的
汉坦病毒(汉城型)数字PCR方法的验证。
(二)材料、试剂与仪器
1、主要仪器设备
仪器名称 厂家
Naica<sup>TM</sup> Crystal Digital PCR System Stilla
2、主要试剂、材料
名称 货号 厂家
PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix,5× 95147 Quantabio
Fluorescein sodium salt AK200000 Apexbio
Sapphire Chip C14012 Stilla Technologies
SEO-S-3F/R,3P(FAM) —— Apexbio
SEO-M-2F/R,2P(HEX) —— Apexbio
F/R_Actin,P_Actin(CY5) —— Apexbio
3、实验材料
试验用样本信息如下：
名称 来源 类型 含病毒类型
HLD-F-10 鼠肺组织 cDNA 汉城型
SYFH-F-28 鼠肺组织 cDNA 汉滩型
试验用引物、探针如下：
Figure BDA0002983353700000131
Figure BDA0002983353700000141
(三)实验流程
1、数字PCR反应
Figure BDA0002983353700000142
上述体系配制完成后，加入Sapphire Chip中，每孔25μL，将芯片放入CrystalDigital PCR System中进行PCR扩增。
2、数据分析
PCR反应完成后，将芯片取出，放置于NaicaTM prism微滴阅读分析系统扫描芯片、分析数据。
(四)检测结果
1、数字PCR检测结果：
Figure BDA0002983353700000143
2、数字PCR检测一维图展示：
参见图9、10。
(五)结果描述与结论
1、由“数字PCR检测结果”表格和图9、10可知，汉城型探针组合仅在阳性样本HLD-F-10中被检出(SEO-S-3和SEO-M-2浓度分别为：138.8和372copies/μL)，而阴性样本SYFH-F-28未检到。
2、由图9可知，SEO-S-3组合阳性微滴弥散，与SEO-M-2相比拷贝数浓度低2.7倍(这与qPCR的检测结果相一致)。
3、针对动物源actin阳性微滴呈弥散状，可能是由于该引物探针组合是兼容所有动物的actin基因，以及DNA和RNA水平，并存在兼并碱基等所致，这通过引物片段的调整实验进行优化改进。
综上可知：针对汉坦病毒汉城型S和M片段设计和挑选的引物探针组合特异，能够准确检测到汉城型病毒，可用于未知样本检测。
实施例4、汉城型引物探针组合数字PCR验证-RNA样品测试
(一)目的
汉城型引物探针组合检测RNA样本数字PCR方法验证。
(二)材料、试剂与仪器
1、主要仪器设备
仪器名称 厂家
Naica<sup>TM</sup> Crystal Digital PCR System Stilla
2、主要试剂
名称 货号 厂家
qScript<sup>TM</sup> XLT One-Step RT-qPCR ToughMix 95132 Quantabio
PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix,5× 95147 Quantabio
Fluorescein sodium salt AK200000 Apexbio
Sapphire Chip C14012 Stilla Technologies
SEO-S-3F/R,3P(FAM) —— Apexbio
SEO-M-2F/R,2P(HEX) —— Apexbio
F/R_Actin,P_Actin(CY5) —— Apexbio
3、实验材料
实验用样本信息如下：
名称 来源 类型 含病毒类型
HLD-F-10 鼠肺组织 RNA(稀释10倍，11.56ng/μL) 汉城型
HLD-F-10 鼠肺组织 cDNA 汉城型
汉城型引物探针组合同实施例3，更换了动物源Actin检测用引物探针，序列如下；
Primer名称 序列(5′to 3′) 荧光标记
F_Actin CCTCACTGTCCACCTTC
R_Actin AACGCAGCTCAGTAACA
P_Actin TACTCCTGCTTGCTGATCCACATC 5′CY5,3′BHQ2
(三)实验流程
1、数字PCR反应体系
Figure BDA0002983353700000161
上述体系配制完成后，加入Sapphire Chip中，每孔25μL，将芯片放入CrystalDigital PCR System中进行PCR扩增。
2、数据分析
PCR反应完成后，将芯片取出，放置于NaicaTM prism微滴阅读分析系统扫描芯片、分析数据。
(四)检测结果
1、数字PCR检测结果：
Figure BDA0002983353700000162
2、数字PCR检测一维图展示：
参见图11、12。
(五)结果描述与结论
1、更换成RNA样本后，所选引物探针组合能够检出汉城型病毒和动物源的存在，只是样本浓度太高，无法计算拷贝数浓度，见图11。
2、针对动物源actin，更换引物后，阳性微滴不在呈弥散状，但拷贝数浓度降低，这可能是引物更换引物后特异性增强的结果。
综上可知：针对汉城型S和M段设计和挑选的引物探针组合特异，能够准确检测到汉城型病毒。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种检测汉城型汉坦病毒的试剂盒及其检测方法
<160> 12
<210> 1
<211> 核苷酸19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（19）
<223> 上游引物
<400>1
AGGCAACCATAAACATAAC
<210> 2
<211> 核苷酸19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（19）
<223> 下游引物
<400>2
TCGGAAGAAATCATCATTC
<210> 3
<211> 核苷酸24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（24）
<223> 特异性探针
<400>3
FAM-ATCAATCATACCTCAGACGCACAC-BHQ1
<210> 4
<211> 核苷酸98
<212> DNA
<213> 汉城病毒（Seol virus）
<220>
<222> 核苷酸序列（1104）...（1201）
<223> 目的片段
<400>4
1 tcggaagaaa tcatcattct atcaatcata cctcagacgc acacagtcaa tgggaataca
61 actggatcag aggataattg ttatgtttat ggttgcct
<210> 5
<211> 核苷酸18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（18）
<223> 上游引物
<400>5
CCTGCAATGTATTCTGTG
<210> 6
<211> 核苷酸19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（19）
<223> 下游引物
<400>6
CAGACACATTGGAGAAGTA
<210> 7
<211> 核苷酸23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（23）
<223> 特异性探针
<400>7
HEX-CTTATCAGGACCAGGTGCTTCAT-BHQ1
<210> 8
<211> 核苷酸95
<212> DNA
<213> 汉城病毒（Seol virus）
<220>
<222> 核苷酸序列（1164）...（1258）
<223> 目的片段
<400>8
1 cctgcaatgt attctgtgtc ttatcaggac caggtgcttc atgtgaagcc ttttcagaag
61 gaggtatttt caatattact tctccaatgt gtctg
<210> 9
<211> 核苷酸17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（17）
<223> 上游引物
<400>9
CCTCACTGTCCACCTTC
<210> 10
<211> 核苷酸17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（17）
<223> 下游引物
<400>10
AACGCAGCTCAGTAACA
<210> 11
<211> 核苷酸24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（24）
<223> 特异性探针
<400>11
CY5-TACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-BHQ2
<210> 12
<211> 核苷酸112
<212> DNA
<213> 鼠属（Mus）
<220>
<222> 核苷酸序列（1154）...（1265）
<223> 目的片段
<400>12
1 cctcactgtc caccttccag cagatgtgga tcagcaagca ggagtacgat gagtccggcc
61 cctccatcgt gcaccgcaag tgcttctagg cggactgtta ctgagctgcg tt

Claims (7)

1.一种用于汉城型汉坦病毒检测的引物，其特征在于，包括：第1组引物SEO-S Assay和第2组引物SEO-M Assay，
第1组引物SEO-S Assay，包括：
SEO-S-3F：AGGCAACCATAAACATAAC
SEO-S-3R：TCGGAAGAAATCATCATTC
SEO-S-3P：ATCAATCATACCTCAGACGCACAC
第2组引物SEO-M Assay，包括：
SEO-M-2F：CCTGCAATGTATTCTGTG
SEO-M-2R：CAGACACATTGGAGAAGTA
SEO-M-2P：CTTATCAGGACCAGGTGCTTCAT。
2.一种用于汉城型汉坦病毒检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物。
3.权利要求2所述的试剂盒在检测汉城型汉坦病毒中的应用。
4.一种非疾病的诊断目的的汉城型汉坦病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样本RNA，使用商品化提取试剂盒，提取人或动物的组织、细胞或血样中的RNA，-80℃储存备用；
(2)以待测样本RNA和cDNA为模板均可，检测所用特异性引物和荧光探针序列如下：
Figure FDA0002983353690000011
(3)上述体系配制完成后，加入Sapphire Chip中，每孔25μL，将芯片放入CrystalDigital PCR System中进行PCR扩增，
(4)PCR反应完成后，将芯片取出，放置于NaicaTM prism微滴阅读分析系统扫描芯片、分析数据。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，
以待测样本RNA和cDNA为模板均可，检测所用特异性引物和荧光探针序列如下：
Figure FDA0002983353690000021
不同模板反应体系组成及配制方法如下：
(a)以待测样本RNA为模板反应体系如下：
试剂名称 加入体积(μL)1× qScript<sup>TM</sup> XLT One-Step RT-qPCR ToughMix 12.5 Fluorescein sodium salt(1μM) 2.5 SEO-S Assay(25×)FAM 2 SEO-M Assay(25×)HEX 1 β-actin Assay(25×)CY5 1 H<sub>2</sub>O和RAN模板 6 总体积 25μL
(b)以待测样本cDNA为模板反应体系如下：
试剂名称 加入体积(μL)1× PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix,5× 5 Fluorescein sodium salt(1μM) 2.5 SEO-S Assay(25×)FAM 2 SEO-M Assay(25×)HEX 1 β-actin Assay(25×)CY5 1 H<sub>2</sub>O和待测cDNA样本 13.5 总体积 25μL
。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，(c)上述体系配制完成后，加入Sapphire Chip中，每孔25μL，将芯片放入Crystal Digital PCR System中进行PCR扩增，反应条件如下：
Figure FDA0002983353690000031
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样本RNA，使用商品化提取试剂盒，提取人或动物的组织、细胞或血样中的RNA，-80℃储存备用；
(2)以待测样本RNA和cDNA为模板均可，检测所用特异性引物和荧光探针序列如下：
Figure FDA0002983353690000032
不同模板反应体系组成及配制方法如下：
(a)以待测样本RNA为模板反应体系如下：
Figure FDA0002983353690000033
Figure FDA0002983353690000041
(b)以待测样本cDNA为模板反应体系如下：
试剂名称 加入体积(μL)1× PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix,5× 5 Fluorescein sodium salt(1μM) 2.5 SEO-S Assay(25×)FAM 2 SEO-M Assay(25×)HEX 1 β-actin Assay(25×)CY5 1 H<sub>2</sub>O和待测cDNA样本 13.5 总体积 25μL
(3)上述体系配制完成后，加入Sapphire Chip中，每孔25μL，将芯片放入CrystalDigital PCR System中进行PCR扩增，反应条件如下：
Figure FDA0002983353690000042
(4)PCR反应完成后，将芯片取出，放置于NaicaTM prism微滴阅读分析系统扫描芯片、分析数据。
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