KR102207965B1 - 한탄 바이러스 및 서울 바이러스를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 한탄 바이러스 및 서울 바이러스의 검출방법 - Google Patents

한탄 바이러스 및 서울 바이러스를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 한탄 바이러스 및 서울 바이러스의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 프라이머 세트는 한탄 및 서울 바이러스를 동시에 검출할 수 있게 디자인한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 PCR 수행 시 현재 보고되어 있는 한탄 및 서울 바이러스를 한 번의 반응으로 검출할 수 있고, 민감도가 우수하고 타 균주와의 교차반응이 없으며 실제 임상 검체로부터 한탄 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 확인하였으므로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 한타바이러스 중 병원성이 있는 한탄 및 서울바이러스를 검출 및 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

한탄 바이러스 및 서울 바이러스를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 한탄 바이러스 및 서울 바이러스의 검출방법{Primers and probes for detection of Hantaan virus and Seoul virus and detecting method for Hantaan virus and Seoul virus using the same}
본 발명은 한탄 바이러스 및 서울 바이러스를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 한탄 바이러스 및 서울 바이러스의 검출방법에 관한 것이다.
신증후군출혈열(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)은 신부전, 출혈, 혈소판감소증, 쇼크를 특징으로 하는 급성 발열질환이며, Hantaviridae과의 한타바이러스(Hantavirus)속에 속하는 한탄(Hantaan), 서울(Seoul), 도브라바(Dobrava), 푸말라(Puumala) 바이러스 등에 의해 유발되는 설치류 매개 질환으로, 영국 등 외국에서는 인수공통감염병으로 분류하고 있다.
Hantaviridae과의 한타바이러스(Hantavirus)는 직경 80~110nm인 구형의 형태를 가지고, 음성 단일가닥 RNA 바이러스, 중심부 RNA 유전자 3개와 이를 둘러싼 단백으로 구성된 리보핵산 단백질(ribonucleoprotein, RNP) 구조가 있고, 이 RNP 구조를 5nm의 지질이중층(lipid bilayer)과 당단백질인 Gn, Gc가 둘러싸고 있다. RNA는 large (L), medium (M), small (S)의 3개 분절로 구성되어 있다.
세계적으로 한타바이러스 속에는 21종류의 혈청형과 30종 이상의 유전형이 알려져 있으나 모두 질병을 유발하는 것은 아니다. 대표적으로 한탄, 서울, 도브라바, 푸말라는 신증후군출혈열을 유도하며, 신놈브레(Sin Nombre), 안데스(Andes)등의 바이러스는 폐증후군(hantavirus pulmonary syndrome, HP)을 유도한다.
국내에서는 주로 한탄(Hantaan), 서울(Seoul) 바이러스가 신증후군출혈열을 유도한다고 알려져 있으며 최근에는 매개체에서 한타바이러스 속 신종 바이러스인 무주(Muju), 수청(Soochong), 임진(Imjin), 제주(Jeju) 등이 최근까지 발견되었으나 병원성 및 사람에서의 발병 여부는 아직까지 확인된 바 없다.
1990년부터 한탄바이러스 약독화 백신인 한타박스가 사용되고 있으며 생활환경이 크게 변화하였음에도 불구하고 최근 약 10년간 평균 350여명의 환자와 10명 이내의 사망환자가 꾸준히 발생되고 있다. 국외의 경우 서울, 도브라바 등의 한타바이러스 속 병원체에 의해 연간 150,000여명의 신증후군출혈열 환자발생이 추정되며 우리나라를 비롯하여 중국, 러시아 등 동북아시아와 유럽 등 세계적인 분포를 보인다.
질병관리본부(바이러스분석과) 및 시ㆍ도 보건환경연구원에서는 한탄바이러스 항원슬라이드를 이용한 간접면역형광항체법(Indirect Immunofluorescence Assay, 이하, IFA)을 이용하여 환자 혈청으로 실험실 진단을 수행하여 IgG 항체역가가 1:512 이상인 경우 양성으로 판단하며, 항체역가가 1:512 이하인 경우(1차 항체가) 회복기 혈청(2차 항체가)을 요구하여 2차 항체가가 1차에 비하여 4배 이상 증가되는 경우 양성으로 최종 진단한다.
질병관리본부 외의 민간 진단 기관(녹십자, 고려대학교 등)에서도 한타바이러스 항원 슬라이드를 이용한 IFA법으로 IgG 항체가를 통해 진단하고 있다. 가을철 한타 바이러스로 감염으로 인한 발열성 환자가 다수 발생하여 진단이 반드시 필요하지만 민간에서는 진단제제 관련 연구 및 생산이 경제성 등의 이유로 이뤄지지 않고 있어 계속해서 이전의 방법인 IFA법으로만 진단되고 있다. 다만, IFA 법은 양성 검체에 대해서도 음성으로 진단되는 사례가 빈번하게 발생하고 있어, IFA 방법만으로 진단하는 경우 조기치료를 놓침으로 인해 합병증 등에 의한 사망으로 이어질 수 있다.
최근 약 10년간 생활환경의 개선과 백신 접종에도 불구하고 신증후군출혈열 환자(`01~`14년 평균: 397명) 및 사망자가 꾸준히 발생하고 있어, 예상치 못한 유행 대비를 위한 체계적인 감시와 효율성 높은 진단법 개발이 필요하다. 기존의 진단법(IFA)의 실험방법의 객관성, 교차반응, IgM 확인의 한계 등의 문제로 진단법 개선 및 새로운 진단법 개발이 필수적이다.
한타 바이러스 감염 진단 방법에 관한 선행기술로는 서울바이러스의 감염을 진단하기 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 키트 및 방법을 개시한 대한민국 공개특허 10-2019-0021734호, 한타바이러스 감염의 진단에 관해 개시한 Expert Rev. Anti Infect. Ther. Early online, 1-8 (2015)가 있다.
이에, 본 발명자들은 신증후군출혈열을 유발하는 한탄 및 서울 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 duplex 실시간 RT-PCR 용 프라이머 및 프로브 세트를 디자인하고, 상기 프라이머 및 프로브 세트가 분석적 민감도가 우수하고, 다른 발열성 질환 검체와 교차반응이 나타나지 않으며, 혈청학적 진단법인 ELISA에서 음성으로 분석된 검체에서도 양성반응이 나타남을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 한탄 및 서울 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 한탄 및 서울 바이러스 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 한탄 및 서울 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머; 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머;로 이루어진 한탄 및 서울 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 한탄 및 서울 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 한탄 및 서울 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 한탄 및 서울 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 한탄 및 서울 바이러스를 동시에 검출할 수 있게 디자인한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 PCR 수행시 현재 보고되어 있는 한탄 및 서울 바이러스를 한 번의 반응으로 검출할 수 있고, 민감도가 우수하고 타 균주와의 교차반응이 없으며 실제 임상 검체로부터 한탄 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 확인하였으므로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 한타바이러스 중 병원성이 있는 한탄 및 서울바이러스를 검출 및 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 5종 한타바이러스(한탄, 서울, 임진, 무주, 수청)에 특이적인 프라이머를 S segment의 핵 단백질(Nucleoprotein) 또는 S segment를 타겟으로 디자인한 것을 나타낸 도이다.
도 2는 제조한 5종 한타바이러스의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시 양성 대조군으로 사용되는 RNA 유전자를 합성하는 과정과, 각 RNA 유전자를 발현하는 플라스미드를 제한효소로 절단한 것과 절단하지 않은 산물의 전기영동 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 제조한 5종 한타바이러스의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행하여 분석적 민감도를 측정한 것으로, 각각의 프라이머 및 프로브 세트는 34 내지 37의 Ct 값을 가지고, 101 내지 102 copies/㎕의 최소검출한계를 가짐을 나타낸 도이다.
도 4는 제조한 5종 한타바이러스의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행하여 교차반응이 있는지 여부를 확인한 것으로, 각각의 프라이머 및 프로브 세트는 다른 종류의 한타바이러스에는 반응하지 않아 교차반응이 없음을 확인한 도이다.
도 5는 한탄 및 서울 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트로 duplex 실시간 RT-PCR을 수행한 결과, 간섭반응이 일어나지 않으며, 101 copies/㎕의 최소검출한계를 가짐을 나타낸 도이다.
도 6은 한탄 및 서울 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트로 duplex 실시간 RT-PCR을 수행한 결과, Ct 값을 나타낸 것으로, 101 copies/㎕의 최소검출한계를 가짐을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머; 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머;로 이루어진 한탄 및 서울 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 한탄 및 서울 바이러스의 S segment 영역을 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 상기 S segment 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머 쌍일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머, 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 한탄 및 서울 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 한탄 및 서울 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머는 한탄 바이러스의 S segment의 핵 단백질(Nucleoprotein, NP) 영역, 서울 바이러스의 S segment 영역을 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 상기 S segment의 핵 단백질(NP) 영역 또는 S segment 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머 쌍일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머, 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.
상기 조성물은 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 프로브 및 서열번호 6의 염기서열로 기재되는 프로브를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 한탄 및 서울 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM일 수 있다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 소광자는 BHQ1일 수 있다.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 및 프로브 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머, 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머, 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 프로브 및 서열번호 6의 염기서열로 기재되는 프로브를 제작하고(표 1, 표 2 및 도 1 참조), 이를 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-time reverse transcrption-polymerase chain reaction, 실시간 RT-PCR)의 민감도를 분석한 결과, 최소검출한계가 101 내지102 copies/㎕임을 확인하였다(도 3 참조). 또한, 상기 프라이머 및 프로브가 한탄 및 서울 바이러스만을 특이적으로 검출하고(도 4 참조), 타 균주와의 교차반응이 없음을 확인하였다(표 4 및 표 5 참조). 또한, 한탄 바이러스 항체 역가가 확인된 검체 중 IFA 법으로 음성으로 판별된 검체에서 본 발명의 한탄 바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트는 한탄 바이러스를 검출하였다(표 7 참조). 또한, 한탄 및 서울 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 한꺼번에 넣어 duplex 실시간 RT-PCR을 수행한 결과, 최소검출한계가 101 copies/㎕임을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조).
따라서, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 PCR 수행 시 현재 보고되어 있는 한탄 및 서울 바이러스를 한 번의 반응으로 검출할 수 있고, 민감도가 우수하고 타 균주와의 교차반응이 없으며 실제 임상 검체로부터 한탄 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 확인하였으므로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 한타바이러스 중 병원성이 있는 한탄 및 서울바이러스를 검출 및 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 한탄 및 서울 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물을 포함하는 한탄 및 서울 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트를 제공한다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머, 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머로 이루어진 한탄 및 서울 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 프로브 및 서열번호 6의 염기서열로 기재되는 프로브를 더 포함할 수 있고, 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된 것일 수 있다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 한탄 바이러스의 S segment의 핵 단백질(NP) 영역 및 서울 바이러스의 S segment 영역에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계;
2) 상기 검체로부터 분리한 핵산을 주형으로 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 증폭 산물을 형광측정을 통해 검출하는 단계;를 포함하는 한탄 및 서울 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머는 한탄 바이러스의 S segment의 핵 단백질(NP) 영역 및 서울 바이러스의 S segment 영역을 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 상기 S segment의 핵 단백질 영역 또는 S segment 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머 쌍일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머, 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 한탄 바이러스 및 서울 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브의 제작
한탄 바이러스 및 서울 바이러스를 포함하여 5종의 한타바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 제작하였다.
5종의 한타바이러스 균주를 탐색한 후 미국국립생물정보센터(NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 균주들의 염기서열을 수집하였다(표 1). 수집된 염기서열을 이용하여 유전자를 정렬(alignment)하였고, 한탄, 임진, 무주 및 수청 바이러스는 S segment의 핵 단백질(Nucleoprotein, NP) 유전자를 표적으로, 서울 바이러스는 S segment 전체 유전자를 표적 유전자로 하여 5종의 한타바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하였다(도 1 및 표 2). 프로브의 5' 말단에는 리포터 FAM(6-carboxyfluorescein)를 결합시켰으며, 3' 말단에는 소광자 BHQ(black hole quencher) 1를 결합시켰다.
제작된 프라이머 서열을 NCBI 등록된 서열 확인(BLAST)을 통해 다른 바이러스들의 서열에 반응하지 않는 것을 확인하여, 각 바이러스 특이적 프라이머로 디자인된 것을 확인하였다.
바이러스 균주(Strain)
한탄(Hantaan) 바이러스 Family Hantaviridae
Genus Hantavirus
Species Hantaan
서울(Seoul) 바이러스 Family Hantaviridae
Genus Hantavirus
Species Seoul
임진(Imjin) 바이러스 Family Hantaviridae
Genus Hantavirus
Species Imjin
무주(Muju) 바이러스 Family Hantaviridae
Genus Hantavirus
Species Muju
수청(Soochung) 바이러스 Family Hantaviridae
Genus Hantavirus
Species Soochung
바이러스 서열(5'→3') 서열번호
한탄(Hantaan) 바이러스 정방향 프라이머 GGTGGTCCTGCAACAAACAG 서열번호 1
역방향 프라이머 TCTCCATATTGCCTAATGCCACTTG 서열번호 2
프로브 CCGCTGCCGTAAGTAG 서열번호 3
서울(Seoul) 바이러스 정방향 프라이머 GGATGGAGCCAAAGGAATTTCAAG 서열번호 4
역방향 프라이머 TCAACTAGTGTACATCCAGCATCCT 서열번호 5
프로브 CCCTACGGCAACATT 서열번호 6
임진(Imjin) 바이러스 정방향 프라이머 CAACTAGCCAGTCATCAATCCAAGA 서열번호 7
역방향 프라이머 GGAGGAGTCCTGAGACAATTGTTC 서열번호 8
프로브 CACCAGGCAGATTCA 서열번호 9
무주(Muju) 바이러스 정방향 프라이머 AGGTGCATTCTTCTCAATCCTTCAG 서열번호 10
역방향 프라이머 GACGATTTCTTCTTCAGCTTTTCTTCAG 서열번호 11
프로브 ATGGCATCCAAAACTG 서열번호 12
수청(Soochung) 바이러스 정방향 프라이머 GGTGTCCTGCAACTAATAGAGATT 서열번호 13
역방향 프라이머 GCGGATTGCTTTTGACTCCTTAG 서열번호 14
프로브 AAGCTGCCTGCCTTTG 서열번호 15
<실험예 1> 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 RT-PCR의 분석적 민감도 확인
실시예 1에서 제조한 5종 한타바이러스의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시, 프라이머 및 프로브 세트의 최소검출한계(limit of detection, LoD)를 측정하여 민감도를 분석하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 프라이머 제작의 표적이 된 핵 단백질 또는 S segment를 코딩하는 유전자를 발현하는 플라스미드를 제작하고, 제한효소로 절단한 후 mMESSAGE mMACHINE T7kit(Ambion,Austin,TX,USA)를 이용하여 시험관 내 전사(in vitro transcription(T7))를 진행하고, TURBO DNase 분해로 남은 주형 DNA를 제거한 후, RNA 정제하여 양성 대조군으로 사용되는 RNA 유전자를 합성하였다(도 2).
합성한 5종의 한타바이러스에 대한 양성 대조군을 1×107 copies/㎕부터 1×101 copies/㎕까지 10-fold 희석하여 각각 농도에서 5종 한타바이러스의 합성된 RNA 3 ㎕, 2x 마스터 믹스(Master mix) 5 ㎕, 프라이머 프로브 믹스(primer probe mix) 1 ㎕ 및 PCR이 잘 수행되었는지 확인하는 내부 양성 대조군(Internal positive control) 1 ㎕을 혼합한 후, 하기 표 3과 같은 반응 조건으로 실시간 RT-PCR의 반응을 수행하였다(AgPath RT-PCR kit, Ambion).
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 한탄바이러스(Ct=35.48), 서울바이러스 (Ct=34.49), 임진바이러스(Ct=36.35), 무주바이러스(Ct=35.17), 그리고 수청바이러스(Ct=34.94)로 확인되었고, 5종의 한타바이러스의 S segment 또는 S segment의 핵 단백질을 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 세트는 서울 바이러스의 경우 102 copies/㎕의 최소검출한계를, 나머지 바이러스는 101 copies/㎕의 최소검출한계를 나타내, 민감도가 우수함을 알 수 있었다(도 3).
온도 시간 사이클
45℃ 10분 1
95℃ 10분 1
95℃ 15초 50
60℃ 45초
<실험예 2> 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 RT-PCR의 분석적 특이도 확인
실시예 1에서 제조한 5종 한타바이러스의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시, 다른 종의 한타바이러스 및 다른 균주에 대해 교차반응이 나타는지 여부를 분석하고자 하였다.
<2-1> 다른 한타바이러스와의 교차반응 여부 확인
제작한 5종의 한타바이러스 특이적인 프라이머 및 프로브 세트의 특이도를 하기의 방법으로 검증하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1에서 제조한 5종의 한타바이러스 유전자 합성 산물을 1×105 copies/㎕의 농도로 혼합하여 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 5종의 한타바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 세트는 각각의 한타바이러스만 검출하고 다른 검체와는 반응하지 않음을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 양성 대조군 모두 특정 바이러스 특이적으로 감지되었고 서로 교차반응이 나타나지 않은 것을 제시한다.
<2-2> 타균주와의 교차반응 여부 확인
총 46주의 병원체 유전자 및 질병관리본부에서 제공받은 전사체(transcript)를 사용하여 교차반응 여부를 확인하였다. 한타 바이러스 유전자 대신 동량의 상기 병원체 유전자 합성 산물 및 바이러스 RNA를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다.
Family Genus Species Strain sample 농도 한탄 서울 임진 무주 수청
Nairoviridae Orthonairovirus Crimean congo hemorrhagic fever virus Bagdad12 10^
6
 - - - - -
Martin - - - - -
Afg09-2990 - - - - -
C68031 - - - - -
Drosdov - - - - -
AP92 - - - - -
Kashmanov - - - - -
ArD8194 - - - - -
UG3010 - - - - -
IbAr10200 - - - - -
China-79121 S segment IVT - - - - -
Phenuiviridae Phlebovirus Rift-valley fever virus ZH501 M segment, S segment IVT 10^6 - - - - -
Kenya21445 - - - - -
ANK3837 - - - - -
OS1 - - - - -
Entebbe - - - - -
2269/74 - - - - -
SA51 - - - - -
Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus KADGH viral RNA - - - - -
KAGWT - - - - -
Family Genus Species Strain sample 농도 한탄 서울 임진 무주 수청
Arenaviridae Arenavirus Lassa virus Pinneo S segment IVT 10^6 - - - - -
LP - - - - -
803213 - - - - -
Nig08-A41 - - - - -
GA391(Nigeria) - - - - -
Josiah - - - - -
AV - - - - -
Filoviridae Ebola virus Zaire NP IVT 2ng/㎕ - - - - -
Sudan - - - - -
Bundibugyo - - - - -
Reston - - - - -
Ivory coast - - - -
Marburg virus Marburg Marburg NP IVT 10^7 - - - - -
Ravn - - - - -
Filaviviridae Filavivirus Zika virus PRVABC Viral RNA - - - - -
MR766 - - - - -
#1 - - - - -
#2 - - - - -
#12 - - - - -
#15 - - - - -
WestNile virus B956 Viral RNA - - - - -
385-99 - - - - -
Coronaviridae Betacoronavirus MERS-CoVirus EMC(표준주) Viral RNA - - - - -
KNIH002 - - - - -
국내분리주 4종 - - - - -
그 결과, 표 4 및 표 5에 나타난 바와 같이, 상기 병원체 유전자 및 전사체에서는 RT-PCR 증폭이 나타나지 않았으며, 이는 대조 병원체에서 교차반응이 나타나지 않아 한타바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있음을 제시한다.
<실험예 3> 임상검체에 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 적용하여 실시간 RT-PCR 수행
실험실에서 합성한 RNA가 아닌 실제 한타바이러스 감염이 의심되는 임상 검체를 이용하여 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트가 한탄 또는 서울 바이러스를 검출할 수 있는지 여부를 확인하였다.
하기 표 6과 같이, 질병관리본부와 시도 보건환경연구원으로 접수된 진단의뢰 잔여검체 중 IFA법으로 한탄바이러스 항체 역가가 확인된 검체 총 120개를 선별하였으며, IgG IFA 양성 및 음성검체 120건을 대상으로 한탄 또는 서울 바이러스의 프라이머 및 프로브 세트를 적용 검증하였다. 대상검체로부터 RNA를 분리하고, primer/probe와 혼합하여 Real time RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 하기 표 7에 나타난 바와 같이, 120건의 검체 중 2건의 검체로부터 Ct 값 27에서 한탄 바이러스가 검출되었고, 2건은 Ct 값 31에서 검출되었으며, 1건은 Ct 값 34에서 검출되었다. 검출이 확인된 5건의 검체를 대상으로 서울 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트에 의한 실시간 RT-PCR의 수행결과 음성반응으로 확인되었다.
특히 #113의 시료는 IgG IFA법에 의해서는 한탄 바이러스가 음성인 것으로 확인되었으나, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트로 실시간 RT-PCR을 수행한 결과, 한탄 바이러스 양성으로 판정되었다. 상기 결과는 IFA법에 의해서 위음성으로 판단될 수 있는 검체도 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하면 실제 임상 검체로부터 민감하게 한탄 바이러스를 검출할 수 있는 효과가 있음을 제시한다.
IgG IFA의 혈청학적 역가 시험된 환자의 혈청의 개수
2014 2015 2016 전체
<1:32 10 7 6 23
1:32 5 3 8 16
1:64 6 7 7 20
1:128 3 8 10 21
1:256 4 3 5 12
1:512 3 0 3 6
1:1024 0 0 2 2
1:2048 0 0 2 2
>1:4096 8 2 4 14
전체 40 32 48 120
시료 IgG IFA Ct 값(실시간 RT-PCR)
혈청학적 역가 결과 한탄 서울
#2 1:4096 이상 양성 27.18 -
#22 1:2048 양성 27.28 -
#15 1:2048 양성 31.47 -
#1 1:4096 이상 양성 31.79 -
#113 1:32 이상 음성 34.43 -
<실험예 4> 한탄 및 서울 바이러스의 duplex 실시간 RT-PCR 확립
한탄 및 서울 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 duplex 실시간 RT-PCR 양성대조군을 대상으로 민감도를 검증하였다. 한탄 및 서울 바이러스에 대한 양성대조군을 각각 1×107 으로부터 1×101 까지 10배씩 단계적으로 희석하여 하기 표 8의 조건으로 실시간 RT-PCR의 의해 민감도를 확인하였다.
그 결과, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 한탄바이러스 (Ct=32.49), 서울바이러스(Ct=34.43)로 확인되었다. 그리고 각 프라이머 및 프로브 세트는 한탄 및 서울 바이러스 모두 101 copies/㎕ 까지 검출하였다.
온도 시간 사이클
45℃ 30분 1
95℃ 10분 1
95℃ 15초 45
60℃ 45초
<110> Korea Centers for Disease Control and Prevention <120> Primers and probes for detection of Hantaan virus and Seoul virus and detecting method for Hantaan virus and Seoul virus using the same <130> 2019P-11-025 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hantaan virus forward primer <400> 1 ggtggtcctg caacaaacag 20 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hantaan virus reverse primer <400> 2 tctccatatt gcctaatgcc acttg 25 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hantaan virus probe <400> 3 ccgctgccgt aagtag 16 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seoul virus forward primer <400> 4 ggatggagcc aaaggaattt caag 24 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seoul virus reverse primer <400> 5 tcaactagtg tacatccagc atcct 25 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seoul virus probe <400> 6 ccctacggca acatt 15 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> imjin virus forward primer <400> 7 caactagcca gtcatcaatc caaga 25 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> imjin virus reverse primer <400> 8 ggaggagtcc tgagacaatt gttc 24 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> imjin virus probe <400> 9 caccaggcag attca 15 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> muju virus forward primer <400> 10 aggtgcattc ttctcaatcc ttcag 25 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> muju virus reverse primer <400> 11 gacgatttct tcttcagctt ttcttcag 28 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> muju virus probe <400> 12 atggcatcca aaactg 16 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> soochung virus forward primer <400> 13 ggtgtcctgc aactaataga gatt 24 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> soochung virus reverse primer <400> 14 gcggattgct tttgactcct tag 23 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> soochung virus probe <400> 15 aagctgcctg cctttg 16

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머;
    서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머;
    서열번호 4의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머; 및
    서열번호 5의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머;로 이루어진 한탄 및 서울 바이러스 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 한탄 및 서울 바이러스 검출용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 프로브 및 서열번호 6의 염기서열로 기재되는 프로브를 더 포함하는, 한탄 및 서울 바이러스 검출용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단에 리포터가 추가로 접합된 것인, 한탄 및 서울 바이러스 검출용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 프로브는 3' 말단에 소광자가 추가로 접합된 것인, 한탄 및 서울 바이러스 검출용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 한탄 및 서울 바이러스 검출용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 한탄 및 서울 바이러스 검출용 조성물.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 한탄 및 서울 바이러스 검출용 키트.
  9. 1) 분리된 검체로부터 핵산을 분리하는 단계;
    2) 상기 검체로부터 분리한 핵산을 주형으로 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 증폭 산물을 형광측정을 통해 검출하는 단계;를 포함하는 한탄 및 서울 바이러스를 검출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는, 한탄및 서울 바이러스를 검출하는 방법.

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