KR102260264B1

KR102260264B1 - 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)의 SARS-CoV-2에 대한 실험실-안전 및 저비용 검출 프로토콜

Info

Publication number: KR102260264B1
Application number: KR1020200043297A
Authority: KR
Inventors: 이창준; 원종하; 이솔지; 박명선; 김태영; 박민구
Original assignee: 기초과학연구원
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-04-09
Publication date: 2021-06-03

Abstract

본 발명은 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공방법, 코로나바이러스 감염여부 진단용 프라이머, 상기 프라이머를 포함하는 코로나바이러스 감염여부 진단용 조성물 및 상기 프라이머 또는 조성물을 포함하는 감염여부 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공 방법은 안전하고 저렴하면서도, 빠르고 정확하게 무증상 대상에 대한 SARS-CoV-2와 같은 바이러스 감염 여부를 진단할 수 있다. 나아가, 본 발명의 코로나바이러스 감염여부 진단용 프라이머는 기존의 SARS-CoV-2 RNA 검출 프라이머에 비해 현저히 뛰어난 감도 및 정확도를 가지고 있어, SYBR Green 기반 RT-PCR과 같은 저렴하고 빠른 검출 방법을 이용한 SARS-CoV-2 RNA 검출 또는 SARS-CoV-2 감염여부 진단에 유용하다.

Description

코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)의 SARS-CoV-2에 대한 실험실-안전 및 저비용 검출 프로토콜{A Laboratory-safe and Low-cost Detection Protocol for SARS-CoV-2 of the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19)}

본 발명은 코로나바이러스 감염여부의 진단방법, 코로나바이러스 감염여부 진단용 프라이머, 상기 프라이머를 포함하는 코로나바이러스 감염여부 진단용 조성물 및 상기 프라이머 또는 조성물을 포함하는 감염여부 진단용 키트에 관한 것이다.

2019년 12월경 중국 우한에서 출현한 치명적인 급성 호흡기 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 전세계로 빠르게 확산되었으며 WHO는 해당 바이러스에 감염된 질환을 COVID-19로 명명하였다. 최근 보고에 따르면, 일반적인 증상으로 발열(98.6%), 피로감(69.6%), 마른 기침(59.4%), 림프구감소증(70.3%), 프로트롬빈 시간의 연장(58%), 및 젖산 탈수소효소의 증진(39.9%)이 있다(Wang, D., et al., JAMA, 2020). 상기 코로나바이러스는 기침과 재채기로 생성된 호흡기 비말을 통한 사람과 사람의 접촉 또는 기침 또는 재채기를 하는 사람들에 의해 오염된 물체 표면을 통해 주로 전염되는 것으로 보고되었다(CDC, C.f.d.c.a.p., How COVID-19 Spreads. Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), 2020).

심지어 상기 코로나바이러스는 무증상 감염이 가능한 것으로 보고된 바 있다. 사이언스 얼럿 (Science Alert)에 따르면, 20세 여성이 SARS-CoV-2로 진단된 한 사례에서, 가족 전체가 확진된 것으로 분류된 달 동안, 증상이 나타나지 않은 것으로 보고되었다(Bendix, A., Science alert, 2020). 또한, 2020년 2월 1일 중 국 우한에서 독일로 파견된 126명의 독일인 중 114명의 환자가 증상이 없었지만 SARS-CoV-2 양성으로 나타났으며, 이는 증상 기반의 코로나바이러스 감염 여부의 선별 과정만으로는 충분히 효과적이지 않을 수 있음을 의미한다(Hoehl, S., et al., N Engl J Med, 2020). 무증상의 가족이 다른 가족에게 바이러스를 전파시킨 무증상 전염도 보고되고 있다(Yu, P., et al., J Infect Dis, 2020). 이러한 최신의 보고들은 열, 기침 및 인후염과 같은 SARS-CoV-2의 전형적인 증상을 보이지 않는 바이러스 전파자가 있음을 명확하게 보여준다. 또한 이러한 보고들은 바이러스에 감염된 사람이 증상을 발현하기 전에 상기 바이러스가 전염될 가능성이 높다는 것을 의미한다.

최근 SARS-CoV-2의 사례가 급증하면서, WHO는 1월 30일 '국제적 공중보건 비상사태'(PHEIC)를 선포했으며, 코로나바이러스 감염 확진자가 전 세계에서 속출하자 WHO는 3월 11일 홍콩독감(1968), 신종플루(2009)에 이어 사상 세 번째로 코로나19에 대해 팬데믹(세계적 대유행)을 선포했다. 2020년 3월 24일을 기준으로 전세계적으로 약 37만명의 환자가 발생하고, 약 16000명이 사망했으며, 매일 수만명의 확진환자가 추가되어, 환자의 증가세에 있다. 한국에서도, 약 9000명의 환자가 확진되었으며, 120명의 사망자가 보고되었다. 2020년 3월 6일 기준 한국 정부가 지원하는 무료 진단 검사 자격은 다음과 같다. 1) 중국 방문 후 14일 이내에 열, 기침 및 인후염과 같은 호흡기 증상이 있는 사람; 2) SARS-CoV-2 환자와 밀접한 접촉 후 14일 이내에 열 또는 호흡기 증상이 있는 환자; 3) SARS-CoV-2 감염이 의심된다는 의사의 의견이 있는 환자(Welfare, M.o.H.a., South Korea policy briefing, 2020). 상기한 기준을 충족하지 않는 사람은 국가에서 지원하는 검사가 거부되며, 개인의 비용으로 검사를 받아야 하며, 1회 검사에 수십만원의 비용이 필요하다.

상기한 것과 같이, 바이러스에 감염된 환자의 수가 급증함에 따라 무증상 집단에서의 진단검사도 매우 중요하게 요구되고 있다. 그러나, 의심 환자의 수가 급격히 증가함에 따라 검사 인력 및 시설이 매우 부족한 실정이다(Ahn, S., Coronavirus test cost. LawTalk News, 2020; Yu, E., Lack of medical personnel following the corona spread, dongA.com, 2020). 특히, SARS-CoV-2는 현재 음압시설이 구비된 생물안전성 레벨III 실험실에서만 실험이 가능하다(CDC, C.f.d.c.a.p., Coronavirus Disease 2019(COVID-19), 2020). 설상가상으로 바이러스에 감염된 양성 환자가 확인되면, 확인된 환자 근처에 있는 건물, 기관, 사무소 또는 학교 등이 전부 폐쇄되어 의료진과 시설 자체가 무력화된다. 따라서, 무증상 환자가 쉽게 이용할 수 있는 자가 진단 검사 절차가 필요하며, 검사 대상자가 SARS-CoV-2 감염여부에 음성이거나 잠재적인 양성인지 여부를 검사할 수 있어야 한다.

한편, 유전정보로 RNA를 가지는 바이러스인 SARS-CoV-2의 현재 이용 가능한 검출 도구 및 키트는 RNA를 통한 상보적 DNA 변환(cDNA)을 이용하여, TaqMan 기반의 실시간 중합효소 연쇄반응(real time polymerase chain reaction; RT-PCR)에 의한 RNA 검출의 개념을 기반으로 한다(Corman, V.M., et al., Euro Surveill, 2020. 25(3)). 다시 말해, 잠재적인 감염자로부터, 인두 표본(Swab)(인후 표본) 및/또는 가래가 수집되고, 수집된 샘플로부터 RNA를 정제하여, 역전사 효소를 사용하여 cDNA로 변환하고, SARS-CoV-2의 게놈 서열에 대한 특정 프라이머 쌍을 사용하여, RT-PCR에 의해 카피 수를 측정하기 위한 프로세스를 통해 처리된다(Corman, V.M., et al., Euro Surveill, 2020. 25(3)). SARS-CoV-2에 대한 가이드라인 및 특정 프라이머 쌍은 현재 미국 질병 대조군 센터(CDC)를 통해 이용 가능하다(CDC, C.f.d.c.a.p., Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), 2020). 그러나, 현재의 SARS-CoV-2 검출방법은 샘플의 채취 및 이동과정에서, 바이러스 유출 및 감염의 위험성이 있고, 현재 SARS-CoV-2의 RNA 검출을 위한 프라이머의 종류는 현저히 부족하며 보다 나은 특이성 및 검사효율성을 가지는 프라이머의 개발이 필요하다. 특히 현재의 RT-PCR을 이용한 검출방법은 12시간 이상의 오랜 시간 및 수십만원의 높은 비용이 들어 감염 의심자가 빠르게 늘어가는 현재 추세에서, 저비용 및 안전하고 빠르게 SARS-CoV-2 감염여부를 진단할 수 있는 방법 및 시료의 개발이 요구된다.

이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 안전하고 저렴하면서도, 빠르고 정확하게 무증상 대상에 대한 SARS-CoV-2 감염 여부의 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 트리졸(Trizol) 기반의 샘플 보관 및 RNA 추출방법을 통해, 충분한 품질을 가지는 RNA를 가지고 생물안전성 레벨 II의 실험실에서 진단이 가능하도록 하였고, 코로나바이러스 RNA 및 내부 대조군 RNA의 동시 검출, 감염 양성 판단기준의 완화, 및 감염 음성의 판단기준의 강화를 통해, 신속하고 저렴하게 SARS-CoV-2 감염 여부를 더욱 정확히 진단할 수 있는 방법을 개발하였으며, 본 방법에 적합한 SARS-CoV-2 감염여부 진단을 위한 프라이머 쌍을 동정하고 특이성 및 검출효율성을 검증하고 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 생물안전성 레벨 II의 실험실에서도 높은 정확도 및 감도로 코로나바이러스 감염여부를 확인할 수 있는 저렴하고 신속한 코로나바이러스 감염여부의 진단방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 적합한 코로나바이러스 감염여부 진단용 프라이머 쌍 및 이를 포함하는 바이러스 감염여부의 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대상으로부터 분리된 샘플로부터 전체 RNA를 추출하는 단계 및 상기 추출된 전체 RNA로부터 코로나바이러스 RNA 및 내부 대조군(internal control) RNA를 검출하는 단계를 포함하는 대상의 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, RNA-의존 RNA 중합효소 유전자(RNA-dependent RNA polymerase gene), 스파이크 단백질 유전자(Spike protein gene), 피막 단백질 유전자(Envelope protein gene) 및 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(Nucleocapsid protein gene)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 특이적으로 증폭하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 쌍을 포함하는 코로나바이러스 감염여부 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 코로나바이러스 감염여부 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 코로나바이러스 감염여부의 진단방법은 안전하고 저렴하면서도, 빠르고 정확하게 무증상 대상에 대한 SARS-CoV-2와 같은 바이러스 감염 여부를 진단할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 코로나바이러스 감염여부의 진단방법은 1~10 바이러스 입자의 높은 정확도와 감도한계를 나타내며, 인건비를 제외한 진단 비용은 15달러 미만으로 4시간안에 코로나감염 여부에 대한 결과를 제공한다.

또한, 본 발명의 방법은 트리졸(Trizol)기반의 RNA 추출방법을 사용하여 보다 안전한 추출 및 보관이 가능하여, 생물안전성 레벨 II의 실험실에서도 코로나바이러스 감염여부를 확인할 수 있다. 나아가, SARS-CoV-2 감염 양성에 대한 임계 값을 낮추고, SARS-CoV-2 감염 음성에 대한 임계 값을 높여 특히 무증상 대상에 대한 SARS-CoV-2와 같은 바이러스의 감염 음성을 확인하고, 추가적인 양성 검진을 위한 비감염자 및 감염 의심자를 구분하는 1차적 선별과정에 특히 유용하다.

나아가, 본 발명의 코로나바이러스 감염여부 진단용 프라이머는 기존의 SARS-CoV-2 RNA 검출 프라이머에 비해 현저히 뛰어난 감도 및 정확도를 가지고 있어, SYBR Green 기반 RT-PCR과 같은 저렴하고 빠른 검출 방법을 이용한 SARS-CoV-2 RNA 검출 또는 SARS-CoV-2 감염여부 진단에 유용하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 수행된 인두 면봉 또는 인후 면봉을 통한 샘플의 자가 수집 절차를 나타낸 것이다. 상기 절차는 PCR에 의한 그룹 A Streptociccus 검사에 대한 자가 수집 절차 설명하는 이전의 보고에 기반한 것이다(Murray, M.A., et al., J Clin Microbiol, 2015. 53(2): p.573-8).
도 2는 본 발명의 SARS-CoV-2 감염여부 진단방법의 개략도이다.
도 3은 인간 조직 샘플링 및 전체 RNA 추출 방법을 나타낸 것이다.
도 3A는 인두 면봉 또는 인후 면봉을 통해 대상 스스로 자신의 조직 샘플을 수집하는 방법을 나타내며, 도 1의 절차에 따른다.
도 3B는 상기 면봉에 수집된 인간샘플을 DMEM에 용해시키고 트리졸(Trizol)을 포함하는 튜브로 옮기는 과정을 나타낸 것이다.
도 3C는 트리졸(Trizol) 기반의 전체 RNA 추출 방법을 나타내며, 추출후 RNA가 추가로 처리되었다.
도 4는 렌티바이러스(Lentivirus)를 이용한 RT-PCR 시스템의 검출 효율 및 한계를 측정한 결과이다.
도 4A는 Ct 대 유전자 복제 수의 표준 곡선으로, LTR 표적 프라이머 쌍 및 이미 알려진 LTR의 유전자 복제 수로부터 RT-PCR 결과에 기반하여 생성된 것이다.
도 4B는 QIAmp 키트 또는 트리졸(Trizol) 기반으로 추출된 RNA에 대한 RT-PCR 결과이다. 알려진 수의 렌티바이러스를 상기 두 가지 방법으로 테스트했다.
도 4C는 QIAmp 및 트리졸(Trizol) 기반의 방법에 대한 평균 Ct값을 비교한 것이다.
도 5는 한국 최초의 환자로부터 얻은 서열로 생성한 SARS-CoV-2 도메인 맵이다. 각 프라이머 쌍의 위치가 표시되어 있으며, CDC로부터 얻은 프라이머 쌍은 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(N)를 표적으로 한다. 본 발명의 프라이머는 RNA-의존적 RNA 중합효소 유전자(RdRP), 스파이크 단백질 유전자(S), 외피 단백질 유전자(E) 또는 N을 표적으로 한다.
도 6은 주형이 없는 조건에서 CDC 프라이머 쌍을 사용하여 RT-PCR동안 발생한 예기치 않은 증폭을 나타낸 것이다.
도 6A는 주형이 없는 조건에서 표 1의 모든 프라이머 쌍을 사용한 정량적 RT-PCR 결과이다. 표 1의 모든 프라이머를 시험하였으며, 데이터는 CDC_N2 및 CDC_N3 프라이머 쌍을 제외하고 흑색 선으로 나타내었다.
도 6B는 주형이 없는 조건에서 CDC_N2 및 CDC_N3 프라이머 쌍에 의한 증폭을 확인한 젤 전기영동 결과이다.
도 7은 본 발명에서 동정한 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 쌍을 이용하여 SARS-CoV-2 RNA 를 대상으로 SYBR-Green 기반 RT-PCR 결과이다. dRN은 상대적 형광값을 의미한다.
도 8은 본 발명에서 동정한 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 쌍 중 SARS-CoV-2_IBS_RdRP1, SARS-CoV-2_S1, SARS-CoV-2_E1, SARS-CoV-2_N1을 혼합하여 한 튜브에서 SYBR-Green 을 기반으로 한 RT-PCR 결과이다. 보라색 선은 SARS-CoV-2를 대상으로 증폭된 유전자의 그래프이며, 하늘색 선은 표적 유전체(cDNA) 없이 진행한 음성 대조군 실험 결과이다. dRN은 상대적 형광값을 의미한다.
도 9는 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 검출용 프라이머 쌍 중 비특이적 반응이 적은 프라이머 쌍을 PCR 기법을 통하여 선별하고 이를 확인한 결과이다. SARS-CoV-2_IBS_RdRP2, SARS-CoV-2_IBS_S2, SARS-CoV-2_IBS_E2, SARS-CoV-2_IBS_ N1을 사용하여 SARS-Cov-2 바이러스 특이적인 유전자를 확인한 결과 각 100bp 근처에서 PCR 산물의 검출이 확인되었으며, 사람 유래의 세포주인 HEK-293T 샘플에서는 PCR 산물이 검출되지 않았다. GAPDH 유전자는 신뢰도 검증을 위한 내부 대조군으로 사용하였다.
도 10은 본 발명의 SARS-CoV-2 RNA 검출용 프라이머 쌍 중 비특이적 반응이 적은 프라이머 쌍을 RT-PCR 기법을 사용하여 검증한 결과이다. 상단의 그래프는 실시간 증폭을 나타내는 형광 값을 나타낸 것이며, 하단의 그래프는 비특이적 반응여부를 확인하기 위한 PCR 산물의 용융 곡선(melting curve) 분석결과이다. A-D는 각각 SARS-CoV-2_IBS_RdRP, S, E, N 유전자를 타겟으로 하는 프라이머를 사용한 RT-PCR 결과이며, E는 내부 대조군으로서, GAPDH 유전자 프라이머를 사용한 결과이다.
도 11A는 Multiplex PCR용 프라이머 쌍(SARS-CoV2_IBS_m_RdRP1, SARS-CoV2_IBS_m_RdRP2, SARS-CoV2_IBS_m_S1, SARS-CoV2_IBS_m_S2, SARS-CoV2_IBS_m_N1, SARS-CoV2_IBS_m_N2)의 검출효율을 검증한 결과이다. 내부 대조군 프라이머 인 GAPDH, 18s rRNA, IBS_m_ACTB1, IBS_m_ACTB2, IBS_m_TBP1 및 IBS_m_TBP2도 함께 검증하였다.
도 11B는 선정된 프라이머 쌍(SARS-CoV2_IBS_m_RdRP1, SARS-CoV2_IBS_m_S1, SARS-CoV2_IBS_m_N1)을 사용하여 SARS-CoV-2 및 대조군(HEK-293T 및 NTC)을 대상으로 Multiplex PCR을 수행한 결과이다. SARS-CoV-2를 대상으로는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 쌍 각각에 대한 4개의 밴드가 검출되었으며, HEK-293T 및 NTC에서는 밴드가 관찰되지 않았다. 내부 대조군 프라이머 쌍(GAPDH, 18s rRNA, IBS_m_ACTB1, IBS_m_TBP1)을 이용한 Multiplex PCR 결과는 NTC를 제외한 대조군에서 밴드를 나타내어 신뢰도를 검증하였다.
도 12는 본 발명의 SARS-CoV-2 검출 프라이머 쌍의 다음의 각각의 대상에 대한 정량적 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다: (A) 양성 대조군: SARS-CoV-2; (B) 지원자 11; 및 (C) 주형 없음. 좌측 그래프는 SARS-CoV-2 특이적 프라이머를 이용한 증폭결과를 나타내고, 우측 패널은 인간 내부 대조군 특이적 프라이머를 이용한 증폭 결과를 나타낸다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

급성 호흡기 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 전세계로 빠르게 확산되었으며 WHO는 해당 바이러스에 감염된 질환을 COVID-19로 명명하였다. 전세계적으로 SARS-CoV-2의 감염 사례가 급증하면서, WHO는 2020년 1월 30일 '국제적 공중보건 비상사태'(PHEIC)를 선포했으며, 2020년 3월 11일 코로나19에 대해 팬데믹(세계적 대유행)을 선포했다. 2020년 3월 24일을 기준으로 전세계적으로 약 37만명의 환자가 발생하고, 약 16000명이 사망했으며, 매일 수만명의 확진환자가 추가되어, 환자의 증가세에 있다.

SARS-CoV-2 감염(COVID-19)에 따른 COVID-19의 예방 백신, 치료제 또는 치료방법이 전무한 상황이기 때문에, SARS-CoV-2의 조기진단 및 자가격리가 SARS-CoV-2의 전파 및 감염 예방을 위한 유일한 대책에 해당한다. 그러나, 일반적인 감기, 독감과 증상이 유사하며, 여러 사례에서 무증상 감염이 가능한 것으로 보고되어 COVID-19와 유사한 증상을 호소하는 의심자가 국내에서만 수십만 이상에 달한다.

이러한 SARS-CoV-2 감염여부 진단의 중요성 및 엄청난 수요에도 불구하고, SARS-CoV-2는 현재 음압시설이 구비된 생물안전성 레벨III 실험실에서만 실험 및 검사가 가능하다. 또한, SARS-CoV-2의 검출에 주로 사용되는 TaqMan방식의 RT-PCR은 높은 정확도에도 불구하고, 12시간 이상의 오랜 시간 및 수십만원의 높은 비용이 요구되어 검사 인력 및 시설이 매우 부족한 실정이다(Ahn, S., LawTalk News, 2020, Yu, E., dongA.com, 2020. 따라서, 무증상 환자가 저렴하고 쉽게 이용할 수 있는 자가 진단 검사 절차가 필요하며, 검사 대상자가 SARS-CoV-2 감염여부에 음성이거나 잠재적인 양성인지 여부를 검사할 수 있는 방법이 필요하다.

의학에서는 각종 박테리아나 바이러스들을 생물안전성 레벨(Biosafety Level)로 구분하여 관리하며, 각 레벨에 따라 관리 방식이 크게 달라진다. 국내에서는 '감염병예방법 제 23조' 및 '유전자변형생물체법 23조'에서 생물 안전도와 그에 적합한 시설 기준 등을 규정하고 있다. 코로나바이러스의 경우, 현재 생물안전성 레벨 III의 실험실에서만 실험 또는 진단이 가능한데, 생물안전성 레벨 III의 실험실은 약 60여개만이 존재하여 코로나바이러스의 진단 및 연구의 필요성에 비해 그 수가 매우 부족하다. 생물안전성 레벨 II의 경우 1000개 이상의 실험실이 존재하므로, 보다 낮은 생물안전성 레벨의 실험실에서 연구 및 진단이 가능하도록 하는 것이 중요하다.

이러한 현실적 요구에 부응하여, 본 발명은 바이러스의 감염성이 비활성화되어 생물안전성 레벨 II의 실험실에서도 검사가 가능하고, 시간적/비용적으로 경제적인 새로운 코로나바이러스 감염여부 진단방법 및 코로나바이러스 감염여부 진단용 프라이머, 상기 프라이머 쌍을 포함하는 코로나바이러스 감염여부 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 검사 대상에 의한 조직샘플의 자체수집을 통해 검사자와의 불필요한 접촉을 피해 안전성을 확보하였으며, 트리졸(Trizol)기반의 샘플 보관 및 RNA 추출방법을 사용하여 감염성을 비활성화하여, 안전성 수준을 더욱 향상시킴으로써, 생물안전성 레벨 II의 실험실에서도 검사가 가능하도록 하였다.

또한, 다른 실시예에서, 상기한 트리졸(Trizol) 기반의 RNA 추출 방법으로 추출된 RNA가 시판되는 바이러스 RNA 추출 키트와 유사한 품질을 가짐을 확인 했으며, 상기 RNA를 대상으로 SYBR Green 기반 RT-PCR을 사용한 SARS-CoV-2 RNA 검출 방법을 사용하여 저비용 및 짧은 시간 안에 무증상 지원자를 대상으로 SARS-CoV-2의 음성을 확인할 수 있음을 입증하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 진단방법에 CDC로부터 얻은 기존의 SARS-CoV-2 RNA 검출용 프라이머를 사용하면, 위양성 신호를 나타낼 수 있음을 확인하였으며, 이에 민감도 및 특이성이 높은 새로운 SARS-CoV-2 RNA 검출용 프라이머 쌍 15쌍을 동정하고, 상기 동정된 프라이머 쌍을 사용하는 경우 위양성이 나타나지 않고 더욱 민감하고 정확하게 SARS-CoV-2의 검출이 가능함을 검증하였다.

또 다른 실시예에서, 본 발명의 진단방법은 감염 양성에 대한 판단 기준을 완화하고 감염 음성에 대한 판단 기준을 강화하여, 무증상자를 대상으로 잠재적 감염 양성과 감염 음성을 빠르고 정확하게 확인할 수 있음을 입증하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 대상으로부터 분리된 샘플로부터 전체 RNA를 추출하는 단계 및 상기 추출된 전체 RNA로부터 코로나바이러스 RNA 및 내부 대조군(internal control) RNA를 검출하는 단계를 포함하는 대상의 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, 대상으로부터 분리된 샘플로부터 전체 RNA를 추출하는 단계 및 상기 추출된 전체 RNA로부터 코로나바이러스 RNA 및 내부 대조군(internal control) RNA를 검출하는 단계를 포함하는 대상의 코로나바이러스 감염여부의 진단방법에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것을 의미한다. 본 발명에서 상기 진단은 코로나바이러스에 감염되었는지 여부를 판정하는 것을 의미하며, 바람직하게는 SARS-CoV-2에 감염되었는지 여부를 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "대상"은 바이러스 감염여부의 진단 대상을 의미한다. 상기 대상은 동물뿐 아니라, 세포, 조직, 기관과 같은 코로나바이러스에 감염될 수 있는 모든 대상을 의미한다. 바람직하게는 상기 대상은 인간이다. 바람직하게는 본 발명은 인간의 코로나바이러스 감염 양성 또는 감염 음성의 진단을 위한 정보를 제공하는데 사용될 수 있으며, 본 발명의 방법을 사용하여 코로나바이러스 이외의 바이러스 또는 세균의 RNA를 검출하여 감염여부를 진단하는 데 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게 자명하다 할 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 대상은 무증상인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 무증상이란 코로나바이러스 감염여부에 관계없이 코로나바이러스에 감염된 경우 또는 감염이 의심되는 대상에 나타나는 일반적인 증상, 예를 들어, 발열, 오한, 소화불량, 구토, 어지러움, 두통, 피로감, 마른 기침, 가래, 콧물, 림프구감소증, 프로트롬빈 시간의 연장, 및 젖산 탈수소효소의 증진 등이 발현되지 않는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 샘플은 진단 대상으로부터 유래한 유전자를 포함하는 샘플이면 모두 이용가능하며, 상기 유전자는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 대상으로부터 유래한다는 의미는 혈액, 조직샘플, 대변, 소변 및 객담 등 환자로부터 분리된 환자의 신체 또는 분비물의 전체 도는 또는 이의 일부를 의미한다. 상기 환자로부터 분리된 환자의 신체 또는 분비물 전체 또는 이의 일부는 환자의 신체로 다시 돌려주지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서, 지원자의 샘플은 감염여부를 검사하는 실험실로부터 분리된 공간에서, 인두 또는 인후 면봉(swab)을 사용하여 지원자 스스로 편도선으로부터 채취하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 샘플은 RNA를 검출하는 단계가 수행되는 장소로부터 공간적으로 분리된 곳에서 채취하는 것을 특징으로 할 수 잇다.

본 발명에 있어서, 상기 샘플은 당업계에 알려진 방법을 통하여 대상으로부터 수득할 수 있다. 바람직하게는 대상의 기관지, 인후 또는 인두를 통해 샘플을 얻는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대상의 편도로부터 샘플을 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 샘플을 트리졸(Trizol)에 보관하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 대상이 자체 수집한 샘플을 직접 트리졸(Trizol)에 용해하여 보관하고, 보관된 샘플에서 검사자가 전체 RNA를 추출하는 단계; 및 추출된 전체 RNA로부터 코로나바이러스 RNA 및 내부 대조군(internal control) RNA를 검출하는 단계를 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 확인한 것과 같이, 기존에 생물안전성 레벨 III에서만 코로나바이러스를 이용한 검사가 가능한 것과 비교하여, 수득한 샘플을 트리졸(Trizol)에 보관하는 경우, 바이러스 및 조직 샘플의 감염성을 비활성화하여, 안전성 수준을 더욱 향상시킴으로써, 생물안전성 레벨 II의 실험실에서도 검사가 가능하다는 것을 확인하였다(Blow JA, Dohm DJ, Negley DL, Mores CN (2004) Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods 119:195-198.).

본 발명의 일 실시예에서, 수집된 조직 샘플 유래의 전체 RNA를 트리졸(Trizol) 또는 시판되는 RNA 추출키트인 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Lot #: 52904, Qiagen, USA)로 추출한 뒤, 각 방법으로 추출된 RNA의 품질, 검출 효율, 검출 한계를 확인한 결과, QIAmpt와 트리졸(Trizol) 사이에 바이러스 감염 세포로부터 RNA를 추출하는 능력 및 추출 민감성이 실질적으로 큰 차이가 없음을 확인하였으며(도 4B, 4C), 특히 SYBR Green 기반의 RT-PCR을 수행하여 코로나바이러스 RNA 및 내부 대조군 RNA를 검출하는데 충분한 품질을 가지고 있다는 것을 입증하였다. 트리졸(Trizol)이 시판되는 키트에 비해 매우 저렴하고, 상기 샘플의 보관에서도 사용될 수 있음을 고려하면, 트리졸(Trizol) 기반의 RNA 추출방법이 코로나바이러스의 RNA를 추출하는데 경제적/시간적/절차적으로 현저히 효과적이라는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 샘플로부터 전체 RNA를 추출하는 단계는 당업계에 알려진 다양한 방법 또는 시판되는 RNA 추출키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, 효소, 계면활성제, 카오트로픽(chaotropic agent)제 등에 의해 생체시료를 처리한 후, 페놀 또는 페놀·클로로포름, 이온교환 수지, 유리필터, 유리비즈, 자기비즈(magnetic beads) 또는 단백 응집작용을 갖는 시약 등을 사용하여 RNA를 추출할 수 있고, 바람직하게는 트리졸(Trizol)을 사용하여 전체 RNA를 추출하는 것을 특징으로 할 수 있다.

예를 들어, RNA의 추출 및 정제법은 촘친스키(Chomczynski) 및 사치(Sacchi), 「애널리티컬·바이오케미스트리(Analytical Biochemistry)」, 1987년, 제162권, p. 156-159.(애시드·구아니디늄·티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출(acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)법: AGPC법)이나 조셉·샘브룩(Joseph. Sambrook) 및 데비드·W·러셀(David W. Russell), 「분자 클로닝: 실험실 매뉴얼 제3판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Edition)」 2001년 등에 기재되어 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 지원자의 조직 샘플로부터 추출된 전체 RNA를 cDNA로 역전사한 뒤, SYBR Green 기반의 RT-PCR을 사용하여 코로나바이러스 RNA 및 내부 대조군(internal control) RNA를 검출하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 RNA를 검출하는 단계는 당업계에 알려진 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 RNA의 검출을 위해 전기영동, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification), 마이크로 어레이(microarray), RNA-DNA 하이브리드화(DNA-RNA hybridization) 등이 있으며, Tian, T., Wang, J., & Zhou, X. (2015). Org Biomol Chem, 13(8) 및 Cissell, K. A., & Deo, S. K. (2009). Trends in microRNA detection. Anal Bioanal Chem. 등의 문헌에 상세히 기재되어 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 RNA를 검출하는 단계는 RT-PCR을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 실시간 RT-PCR(real time RT-PCR) 또는 정량 RT-PCR(quantitative RT-PCR)일 수 있고, 발색 기질은 형광기반의 검출용 발색 기질을 모두 사용할 수 있으나, 바람직하게는 발색 기질로 SYBR Green을 사용하는 SYBR Green 기반의 RT-PCR인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 RNA의 검출은 각각의 프라이머 쌍을 사용한 여러 번의 PCR 또는 한번의 PCR에서 여러 프라이머 쌍을 사용하여 여러 유전자를 동시에 증폭하는 multiplex PCR이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "SYBR Green 기반의 RT-PCR"이란, 실시간 PCR에 주로 사용되는 SYBR Green이라는 비대칭 사이아닌 시약을 사용하여 cDNA의 증폭을 검출하는 RT-PCR을 의미한다. SYBR Green은 이중가닥 DNA에 결합하며, DNA와 결합하여 복합체를 형성하는 경우 청색광(497nm)을 흡수하고 녹색광(520nm)을 방출한다. 실시간 PCR 또는 정량 PCR에 사용되는 주로 사용되는 TaqMan 방법(TaqMan 프로브 사용 PCR)과 비교하여, 비교적 낮은 정확도를 가지나 SYBR Green기반의 PCR은 프로브를 사용하지 않아 단가가 낮으며 다양한 종류의 염색약을 사용하여 multiplex가 가능한 장점이 있다.

본 발명에 있어서, SYBR Green 기반의 RT-PCR을 사용함으로써, 코로나바이러스의 진단 단가를 현저히 낮출 수 있고, 이에 소요되는 시간을 절약할 수 있다는 장점이 있다. 본 발명의 일 실시예에서 확인한 것과 같이, SYBR Green 기반의 RT-PCR을 이용하면서, 엄격한 수준의 감염 음성 판단기준의 설계를 통해 정확도 높은 감염여부의 진단이 가능하다.

또한, 본 발명에 있어서, RNA를 검출을 위해, 프라이머, 프로브, 앱타머 등 표적 RNA를 특이적으로 인식, 증폭, 하이브리드화 할 수 있는 물질이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 프라이머 또는 프로브가 사용될 수 있고, 가장 바람직하게는 프라이머가 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성될 수 있다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 표적 RNA의 cDNA 서열에 혼성화하여 표적으로 하는 RNA의 cDNA를 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 프라이머는 코로나바이러스의 감염여부의 진단용 조성물 또는 키트나 진단방법에 사용될 수 있다. 상기 프라이머는 일반적으로 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 표적 RNA 특이적 (target RNA-specific)일 수 있으며, 이는 표적 RNA에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 표적은 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 종래 보고된 SARS-CoV-2의 프라이머 쌍 (CDC_N1, CDC_N2 및 CDC_N3)의 특이성 확인을 통한 코로나바이러스 검출 효율을 검증하였다. 상기 3종의 프라이머 쌍 중 2개의 프라이머 쌍(CDC_N2 및 CDC_N3)는 주형(tamplate)인 cDNA가 없는 경우에도, SYBR Green 기반 RT-PCR에서 각각 20.266 및 21.129의 유의미한 Ct 값(Ct 값<37)을 나타내어 위양성 신호(false positive signal)를 생성하는 것을 확인하였으며, 이는 검출 감도가 감도가 프라이머의 특이성에 의존할 때, 상기 프라이머를 사용할 수 없음을 의미한다.

따라서 본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명자들은 SARS-CoV-2 바이러스의 RNA 의존 RNA 중합효소 유전자(RdRP; RNA-dependent RNA polymerase gene), 스파이크 단백질 유전자(S; spike protein gene), 외막 단백질 유전자(E; envelope protein gene) 및 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(N; nucleocapsid protein gene)를 표적으로 하는 총 15개의 프라이머 쌍(총 30개의 프라이머)를 동정하였으며, 상기 CDC로부터 얻은 프라이머와 동일한 조건(주형 cDNA 없는 조건)에서, 위양성 신호를 나타내지 않아(ct 값 > 37) 특이성 및 검출 감도가 매우 높음을 확인 하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 코로나바이러스 RNA는 RNA-의존 RNA 중합효소 유전자(RNA-dependent RNA polymerase gene), 스파이크 단백질 유전자(Spike protein gene), 피막 단백질 유전자(Envelope protein gene) 및 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(Nucleocapsid protein gene)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 RNA 또는 이에 상보적인 RNA인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 코로나바이러스 RNA를 검출하기 위해 프라이머가 사용될 수 있으며, 상기 코로나바이러스 RNA 검출용 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 30로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28, 및 서열번호 29 및 서열번호 30의 서열을 포함하는 각각의 프라이머 쌍으로 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 코로나바이러스 RNA의 검출을 위해, RNA-의존 RNA 중합효소 유전자(RNA-dependent RNA polymerase gene; RdRP), 스파이크 단백질 유전자(Spike protein gene; S), 피막 단백질 유전자(Envelope protein gene; E) 및 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(Nucleocapsid protein gene; N)를 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프라이머 쌍을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 RNA-의존 RNA 중합효소 유전자의 RNA는 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 9 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12, 서열번호 19 및 서열번호 20, 및 서열번호 21 및 서열번호 22로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 스파이크 단백질 유전자(Spike protein gene)의 RNA는 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 13 및 서열번호 14, 서열번호 23 및 서열번화 24, 및 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피막 단백질 유전자(Envelope protein gene)의 RNA는 서열번호 5 및 서열번호 6, 및 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(Nucleocapsid protein gene)의 RNA는 서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 17 및 서열번호 18, 서열번호 27 및 서열번호 28, 및 서열번호 29 및 서열번호 30으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어, "프라이머 쌍"은 정방향 프라이머(5`->3`) 및 역방향 프라이머(3`->5`)로 구성된 프라이머의 쌍을 의미한다. 일반적으로 중합효소 연쇄반응을 통한 DNA 또는 RNA의 증폭에 있어서, 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 쌍으로 사용되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 "서열번호 X 및 서열번호 Y의 서열을 포함하는 프라이머 쌍"은 하기 표 1에서 도시하는 바와 같이, 프라이머 쌍의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머가 각각 서열번호 X 및 서열번호 Y의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 하기 표 1의 서열로 구성된 프라이머를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 하기 표 1의 서열을 포함하는 프라이머도 본 발명의 목적하는 효과를 나타낼 수 있는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 RNA-의존 RNA 중합효소 유전자(RNA-dependent RNA polymerase gene; RdRP), 스파이크 단백질 유전자(Spike protein gene; S), 피막 단백질 유전자(Envelope protein gene; E) 및 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(Nucleocapsid protein gene; N)를 특이적으로 증폭할 수 있는 각각의 프라이머 쌍을 하나 이상 사용하여 검출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 임의의 조합으로 사용이 가능하다.

본 발명의 용어 "RNA-의존 RNA 중합효소 (RNA-dependent RNA polymeras)", "스파이크 단백질(Spike protein)", "피막 단백질 유전자(Envelope protein)" 및 "뉴클레오캡시드 단백질 유전자(Nucleocapsid protein)"는 각각 바이러스의 필수 구성 단백질을 의미하며, 코로나바이러스에서 해당 구조에 대한 내용은 Cascella, M., Rajnik, M., Cuomo, A., Dulebohn, S. C., & Di Napoli, R. (2020). Features, Evaluation and Treatment Coronavirus (COVID-19). In StatPearls. Treasure Island (FL)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 용어, "내부 대조군 RNA"이란, 코로나바이러스 RNA 검출의 양성 또는 음성결과에 신뢰도를 부여하기 위한 것으로, 코로나바이러스 RNA의 검출의 내부 대조군으로 사용되는 RNA를 의미한다. 코로나바이러스 감염여부와 무관하게 샘플이 공통적으로 갖는 유전자의 RNA라면, 본 발명의 내부 대조군으로 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 코로나바이러스 감염 양성의 기준을 완화하고 감염 음성의 기준을 강화하였기 때문에, 코로나바이러스 RNA 중 어느 하나 이상이 검출되는 경우 대상을 감염 양성으로 분류할 수 있으나, 코로나바이러스 RNA가 전혀 검출되지 않는 경우에는 내부 대조군 RNA 중 어느 하나 이상이 검출되어야 감염 음성으로 대상을 분류할 수 있고, 내부 대조군 RNA도 전혀 검출되지 않는 경우 검사결과를 신뢰할 수 없어, 재검사 대상으로 분류하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 내부 대조군 역할을 하는 인간 RNA 특이적 프라이머 쌍을 동정하였다. tRNA를 합성하는 인간의 모든 세포 및 세포 구성의 유비퀴터스 효소(ubiquitous enzyme)인 인간 리보뉴클라아제 P(Ribonuclease P; RNase P) 단백질 유전자를 표적으로 동정하였으며(Gopalan, V., A. Vioque, and S. Altman, RNase P: variations and uses. J Biol Chem, 2002. 277(9): p. 6759-62), 각각 RPP 서브유닛 30 및 40을 표적으로하는 IBS_RPP30 및 IBS_RPP40 프라이머 쌍을 선택하였다. 또한, 동일한 RNase P 단백질을 표적으로 하는 내부대조군 프라이머 쌍인 CDC_RNAse P를 CDC로부터 얻어 사용하였다.

본 발명의 다른 실시예에서, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH) RNA, 18s rRNA, 베타-엑틴(ACTB) RNA, TATA 박스 결합 단백질(TBP) RNA를 내부 대조군으로 하여, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH) 및 18s rRNA는 종래 알려진 프라이머를 사용하였고, 베타-엑틴(ACTB) 및 TATA 박스 결합 단백질(TBP)은 새롭게 동정한 프라이머를 사용하여, 코로나바이러스 검출 여부를 검사하였다.

본 발명에 있어서, 상기 내부 대조군(internal control) RNA는 대상의 감염 양성 또는 감염 음성 여부에 관계 없이 대상으로부터 분리된 샘플에 공통적으로 존재하는 RNA라면 제한없이 내부 대조군 RNA로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 RNase P 단백질 RNA, GAPDH, 18S rRNA, 베타-엑틴(ACTB) RNA 및 TATA 박스 결합 단백질(TBP) RNA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 RNA인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 내부 대조군(internal control) RNA를 검출 하기 위해, 인간 RNase P 유전자, GAPDH 유전자, 18S rRNA 유전자, 베타-엑틴(ACTB) 유전자 또는 TATA 박스 결합 단백질(TBP) 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 인간 RNase P 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍은 서열번호 37 및 서열번호 38, 서열번호 39 및 서열번호 40, 및 서열번호 41 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 GAPDH 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍은 서열번호 43 및 서열번호 44의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 18S rRNA 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍은 서열번호 45 및 서열번호 46의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 베타-엑틴(ACTB) 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍은 서열번호 47 및 서열번호 48, 또는 서열번호 49 및 서열번호 50의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 TATA 박스 결합 단백질(TBP) 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍은 서열번호 51 및 서열번호 52, 또는 서열번호 53 및 서열번호 54의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 가장 바람직하게는 감염 음성의 판단 기준 강화를 위해, 서열번호 37 및 서열번호 38, 서열번호 39 및 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50, 서열번호 51 및 서열번호 52, 및 서열번호 53 및 서열번호 54의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 쌍 중 둘 이상을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기한 프라이머의 서열은 다음 표 1과 같다.

대상	표적 유전자	프라이머 이름	정방향 프라이머 (5'-3')	역방향 프라이머 (5'-3')
SARS-CoV-2 (본 발명)	RdRP 15441-15558	SARS-CoV-2_IBS_RdRP1	CATGTGTGGCGGTTCACTAT (서열번호 1)	TGCATTAACATTGGCCGTGA (서열번호 2)
	S 23114-23213	SARS-CoV-2_IBS_S1	CTACATGCACCAGCAACTGT (서열번호 3)	CACCTGTGCCTGTTAAACCA (서열번호 4)
	E 26259-26365	SARS-CoV-2_IBS_E1	TTCGGAAGAGACAGGTACGTT (서열번호 5)	CACACAATCGATGCGCAGTA (서열번호 6)
	N 28732-28849	SARS-CoV-2_IBS_N1	CAATGCTGCAATCGTGCTAC (서열번호 7)	GTTGCGACTACGTGATGAGG (서열번호 8)
	RdRP 15092-15193	SARS-CoV-2_IBS_RdRP2	AGAATAGAGCTCGCACCGTA (서열번호 9)	CTCCTCTAGTGGCGGCTATT (서열번호 10)
	RdRP 14015-14127	SARS-CoV-2_IBS_RdRP3	TCTGTGATGCCATGCGAAAT (서열번호 11)	ACTACCTGGCGTGGTTTGTA (서열번호 12)
	S 22340-22447	SARS-CoV-2_IBS_S2	GCTGGTGCTGCAGCTTATTA (서열번호 13)	AGGGTCAAGTGCACAGTCTA (서열번호 14)
	E 26259-26374	SARS-CoV-2_IBS_E2	TTCGGAAGAGACAGGTACGTTA (서열번호 15)	AGCAGTACGCACACAATCG (서열번호 16)
	N 28736-28855	SARS-CoV-2_IBS_N2	GCTGCAATCGTGCTACAACT (서열번호 17)	TGAACTGTTGCGACTACGTG (서열번호 18)
	RdRP 15355-15556	SARS-Cov2_ IBS_m_RdRP 1	GCTCGCAAACATACAACGTG (서열번호 19)	CATTAACATTGGCCGTGACA (서열번호 20)
	RdRP 15167-15365	SARS-Cov2_ IBS_m_RdRP 2	TGAAATCAATAGCCGCCACT (서열번호 21)	TGTTTGCGAGCAAGAACAAG (서열번호 22)
	S24048-24338	SARS-Cov2_ IBS_m_S 1	CAGATGCTGGCTTCATCAAA (서열번호 23)	GGTTGGCAATCAATTTTTGG (서열번호 24)
	S24137-24436	SARS-Cov2_ IBS_m_S 2	ACTGTTTTGCCACCTTTGCT (서열번호 25)	AGCTTGTGCATTTTGGTTGA (서열번호 26)
	N29121-29520	SARS-Cov2_ IBS_m_N 1	AAGGAAATTTTGGGGACCAG (서열번호 27)	GAGTCAGCACTGCTCATGGA (서열번호 28)
	N 28982-29375	SARS-Cov2_ IBS_m_N 2	AAAGGCCAACAACAACAAGG (서열번호 29)	GCTCTGTTGGTGGGAATGTT (서열번호 30)
SARS-CoV-2 (CDC 제공)	N 28287-28358	CDC_N1	GACCCCAAAATCAGCGAAAT (서열번호 31)	TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG (서열번호 32)
	N 29164-29230	CDC_N2	TTACAAACATTGGCCGCAAA (서열번호 33)	GCGCGACATTCCGAAGAA (서열번호 34)
	N 28681-28752	CDC_N3	GGGAGCCTTGAATACACCAAAA (서열번호 35)	TGTAGCACGATTGCAGCATTG (서열번호 36)
IPC	RNase P	CDC_RNAse P	AGATTTGGACCTGCGAGCG (서열번호 37)	GAGCGGCTGTCTCCACAAGT (서열번호 38)
	RPP30	IBS_RPP30	CTATTAATGTGGCGATTGACCGA (서열번호 39)	TGAGGGCACTGGAAATTGTAT (서열번호 40)
	RPP40	IBS_RPP40	CTTGGCATAAAACAGGTTCAGAA (서열번호 41)	GAGATCTCTCAACGTGCTCAG (서열번호 42)
	GAPDH	GAPDH	CAATGACCCCTTCATTGACC (서열번호 43)	TTGATTTTGGAGGGATCTCG (서열번호 44)
	18S rRNA	18S rRNA	CGGCTACCACATCCAAGGAA (서열번호 45)	GCTGGAATTACCGCGGCT (서열번호 46)
	ACTB	IBS_m_ACTB1	CTCCTGAGCGCAAGTACTCC (서열번호 47)	GTCACCTTCACCGTTCCAGT (서열번호 48)
	ACTB	IBS_m_ACTB2	AGAGCTACGAGCTGCCTGAC (서열번호 49)	AGTACTTGCGCTCAGGAGGA (서열번호 50)
	TBP	IBS_m_TBP1	GTTCTGGGAAAATGGTGTGC (서열번호 51)	GGAGGCAAGGGTACATGAGA (서열번호 52)
	TBP	IBS_m_TBP2	AATATGGTGGGGAGCTGTGA (서열번호 53)	GGCACTTACAGAAGGGCATC (서열번호 54)

IPC: 내부 대조군RdRP: RNA-의존 RNA 중합효소 유전자

S: 스파이크 단백질 유전자

E: 피막 단백질 유전자

N: 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(Nucleocapsid protein gene)

GAPDH: 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH),

ACTB: 베타-액틴,

TBP: TATA 박스 결합 단백질

본 발명의 일 실시예에서, 비용적/시간적 효율을 극대화하고, 특히 코로나바이러스 감염진단을 위한 1차 선별에 더욱 적합하도록 만들기 위해, 상기 내부 대조군 RNA는 코로나바이러스 감염 양성의 판단 기준을 완화하고, 코로나바이러스 감염 음성의 판단 기준을 강화하여, 특히 무증상 대상의 코로나바이러스 감염 음성의 진단의 정확도를 높였다. 구체적인 감염 양성 및 음성의 판단기준은 다음 표 2와 같다. 아래 표의 판단기준을 기반으로 지원자 1 내지 12의 코로나바이러스 감염여부를 진단한 결과, 내부 대조군 RNA의 미검출로 판정불가로 판정된 지원자 9를 제외하고는 모두 정확하게 감염 음성을 진단했다.

SARS-CoV-2_ IBS_RdRP1	SARS-CoV-2_ IBS_S1	SARS-CoV-2_ IBS_E1	SARS-CoV-2_ IBS_N1	IBS_ RPP30	IBS_ RPP40	CDC_ RNase P	결과 해석
+	+	+	+	+	+	+	SARS-CoV-2 검출 (잠재적 감염 양성)
적어도 하나의 +				+	+	+	SARS-CoV-2 검출 (잠재적 감염 양성)
-	-	-	-	+	+	+	SARS-CoV-2 비검출 (감염 음성)
-	-	-	-	적어도 하나의 +			SARS-CoV-2 비검출 (감염 음성)
-	-	-	-	-	-	-	판단 불가 (재검사)

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 코로나바이러스 RNA가 하나 이상 검출되는 경우, 상기 대상을 코로나바이러스 감염군으로 동정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 대상이 코로나바이러스 감염군으로 동정되는 경우, 보다 정확한 검사를 위해서, 높은 정확도를 가지는 코로나바이러스 진단 조성물, 키트 또는 진단방법을 사용한 추가적인 코로나바이러스 감염검사가 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 코로나바이러스 RNA가 검출되지 않고, 상기 내부 대조군 RNA가 하나 이상 검출되는 경우, 상기 대상을 코로나바이러스 비감염군으로 동정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 상기 코로나바이러스 RNA 및 내부 대조군 RNA가 검출되지 않는 경우, 상기 대상으로부터 분리된 새로운 샘플에 대해 (a) 및 (b) 단계를 다시 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 코로나바이러스 감염여부 진단을 위한 정보제공방법을 사용하는 경우, 기존의 방법 대비 현저히 저렴한 비용과 시간으로도 생물안전성 레벨 II의 실험실에서, 대상, 특히 무증상 대상으로부터 감염 음성을 매우 높은 정확도로 선별할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 종래 보고된 SARS-CoV-2의 프라이머 쌍 (CDC_N1, CDC_N2 및 CDC_N3)의 특이성 확인을 통한 코로나바이러스 검출 효율을 검증하였다. 상기 3종의 프라이머 쌍 중 2개의 프라이머 쌍(CDC_N2 및 CDC_N3)는 주형(tamplate)인 cDNA가 없는 경우에도, SYBR Green 기반 RT-PCR에서 각각 20.266 및 21.129의 유의미한 Ct 값(Ct 값<37)을 나타내어 위양성 신호(false positive signal)를 생성하는 것을 확인하였으며, 이는 검출 감도가 프라이머의 특이성에 의존할 때, 상기 프라이머를 사용할 수 없음을 의미한다.

따라서 본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명자들은 SARS-CoV-2 바이러스의 RNA 의존 RNA 중합효소 유전자(RdRP; RNA-dependent RNA polymerase gene), 스파이크 단백질 유전자(S; spike protein gene), 외막 단백질 유전자(E; envelope protein gene) 및 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(N; nucleocapsid protein gene)를 표적으로 하는 총 15개의 프라이머 쌍(총 30개의 프라이머)를 동정하였으며, 상기 CDC로부터 얻은 프라이머와 동일한 조건(주형 cDNA 없는 조건)에서, 위양성 신호를 나타내지 않아(ct 값 > 37) 특이성 및 검출 감도가 매우 높음을 확인 하였으며, BetaCoV/Korea/KCDC03/2020 바이러스 감염 Vero 세포의 전체 RNA에서, 코로나바이러스 RNA를 정확하게 검출해 내는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명은 다른 관점에서, RNA-의존 RNA 중합효소 유전자(RNA-dependent RNA polymerase gene), 스파이크 단백질 유전자(Spike protein gene), 피막 단백질 유전자(Envelope protein gene) 및 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(Nucleocapsid protein gene)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자 또는 이와 상보적인 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 코로나바이러스 감염여부 진단용 또는 코로나바이러스 검출용 프라이머 쌍에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 RNA-의존 RNA 중합효소 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 9 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12, 서열번호 19 및 서열번호 20, 및 서열번호 21 및 서열번호 22로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 스파이크 단백질 유전자(Spike protein gene)를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍은 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 13 및 서열번호 14, 서열번호 23 및 서열번화 24, 및 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피막 단백질 유전자(Envelope protein gene)를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍은 서열번호 5 및 서열번호 6, 및 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성된 군에서 선택되는 서열 쌍을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(Nucleocapsid protein gene)를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍은 서열번호 7 및 서열번호 8, 및 서열번호, 서열번호 17 및 서열번호 18, 서열번호 27 및 서열번호 28, 및 서열번호 29 및 서열번호 30으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28, 및 서열번호 29 및 서열번호 30으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 프라이머 쌍을 포함하는 코로나바이러스 감염여부 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 내부 대조군 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머 쌍을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 내부 대조군(internal control) 유전자는 RNase P 유전자, GAPDH 유전자, 18S rRNA 유전자, 베타-엑틴(ACTB) 유전자 및 TATA 박스 결합 단백질(TBP) 유전자로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 RNase P 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍은 서열번호 37 및 서열번호 38, 서열번호 39 및 서열번호 40, 및 서열번호 41 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 내부 대조군 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍은 서열번호 37 및 서열번호 38, 서열번호 39 및 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50, 서열번호 51 및 서열번호 52, 및 서열번호 53 및 서열번호 54로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 상기 프라이머 쌍 이외에도, 염료, dNTP, NTP, DNA 또는 RNA 폴리머라아제 등 코로나바이러스의 검출에 필요한 시료 또는 성분을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 조성물을 포함하는 코로나바이러스 감염여부 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 키트는 본 발명의 프라이머 또는 상기 프라이머를 포함하는 조성물 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 일 양태로서, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 키트는 SYBR Green 기반의 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 코로나바이러스 감염여부 진단용 키트일 수 있다.

본 발명에서, "프라이머"는 표적 서열에 혼성화되어, 표적 RNA, DNA 또는 cDNA를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 핵산이다. 상기 핵산은 바람직하게는 단일 가닥 핵산이다. 본 발명에서, 핵산은 뉴클레오티드 및 상기 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자가 중합되는 분자를 의미한다. 예를 들어, DNA, RNA, 및 RNA와 DNA의 중합체가 언급될 수 있다. RNA가 포함된 경우, DNA 서열에서 "T(티민)"은 염기 서열에서 "U(우라실)"로 지칭된다. 본 발명의 프라이머는 당업자에게 공지된 임의의 화학적 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.

예를 들어, 뉴클레아제 등과 같은 효소를 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 시판되는 DNA/RNA 자동 합성기(Applied Biosystems, Beckman Instruments 등)를 사용하여 제조될 수도 있다. 이러한 프라이머에서, 구성 핵산은 추가로 자유롭게 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 프라이머에서, 5'- 말단 또는 3'- 말단은 표지 물질(labeling substance)(예컨대, 형광 분자, 염료 분자, 방사성 동위 원소, 디곡시제닌(digoxigenin) 또는 비오틴 등과 같은 유기 화합물 등) 및/또는 프라이머의 검출 또는 증폭을 용이하게 하기 위한 부가 서열 (LAMP 방법 등에 사용되는 루프(loop) 프라이머 부분)을 포함할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 5-'말단에서 인산화되거나 아민화될 수 있다. 본 발명의 프라이머는 천연 염기 또는 변형된 염기만을 포함할 수 있다. 변형된 염기의 예로는, 데옥시이노신, 데옥시우라실, 포스포로티오화된 염기 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가로, 본 발명의 프라이머는 포스포로티오에이트 결합, 포스포로아미데이트 결합 등을 포함하는 임의의 올리고뉴클레오티드 유도체를 포함할 수 있거나, 또는 펩티드 핵산 결합을 포함하는 펩티드-핵산(PNA)을 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 바람직하게 단리 또는 정제된다. "단리 또는 정제된"이라는 것은 천연 또는 합성된 상태로부터 목적 성분 이외의 성분을 제거하는 조작이 적용됨을 의미한다. (w/w)%에서 단리 또는 정제된 프라이머의 순도(총 핵산에 포함된 표적 프라이머의 백분율)는 일반적으로 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직 하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상(예컨대, 100 %)이다. 프라이머의 순도는 용매 및 고체 또는 액체의 상태에 따라 적절히 변화될 수 있다. 순도의 단위는 (w/v)% 또는 (v/v)%일 수 있고, 목적하는 순도는 상기 언급된 (w/w)%에서 순도의 정의를 고려하여 적절하게 계산될 수 있다.

상기 프라이머는 건조 상태 또는 알코올 침전 상태에서 고체로 제공될 수 있거나, 또는 물 또는 적합한 완충액(예컨대, TE 완충액 등)에 용해시켜 제공될 수도 있다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성될 수 있다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 표적 RNA의 cDNA 서열에 혼성화하여 표적으로 하는 RNA의 cDNA를 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 프라이머는 코로나바이러스의 감염여부의 진단용 조성물 또는 키트나 진단방법에 사용될 수 있다. 상기 프라이머는 일반적으로 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 프라이머는 코로나바이러스 RNA의 cDNA 서열에 혼성화하여 표적 RNA를 역전사하여 생성된 cDNA 단편을 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 프라이머, 조성물 및 키트는 코로나바이러스의 검출 및 진단과 관련된 분야에 광범위하게 사용될 수 있다. 본 발명의 코로나바이러스 감염여부 진단을 위한 정보제공방법에 사용될 수 있으며, 이외에도 프라이머를 사용하는 또 다른 코로나바이러스의 검출용 조성물, 키트, 검출방법, 감염여부 진단방법 또는 코로나바이러스 RNA 검출방법에도 사용될 수 있다.

본 발명에서, 상기 코로나바이러스 RNA 검출용 프라이머 는 서열번호 1 내지 서열번호 30로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28, 및 서열번호 29 및 서열번호 30을 포함하는 각각의 프라이머 쌍으로 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 코로나바이러스 유전자 또는 RNA를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 쌍으로 사용될 수 있으며, 상기 프라이머 쌍은 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28, 및 서열번호 29 및 서열번호 30으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 내부 대조군 유전자 또는 RNA를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 쌍은 서열번호 37 및 서열번호 38, 서열번호 39 및 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50, 서열번호 51 및 서열번호 52, 및 서열번호 53 및 서열번호 54로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서, '유전자를 특이적으로 증폭'이란 유전자, 즉 RNA, 상기 RNA 또는 이와 상보적인 RNA를 코딩하는 DNA 또는 cDNA를 주형으로 하여, PCR등의 방법을 통해 표적 유전자 또는 표적 RNA를 증폭하는 것을 의미한다. 증폭에 있어서, 종래에 알려진 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 예를들어, PCR, RT-PCR 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

재료 및 방법

지원자 모집

샘플을 수집하기 위해 인간 지원자들이 참여하였다. 본 발명의 효과 확인을 위해 총 12명의 지원자가 참여했으며, 각 지원자에게는 서울대학교 병원 임상 시험 심사위원회가 승인한 인두 면봉을 통한 시료 채취 연구 및 절차의 목적에 대한 철저한 설명이 제공되었다(IRBY-H1807-197-966). 상기 12명의 모든 지원자들로부터 서면 동의서를 얻었다.

샘플 수집

샘플 수집은 PCR에 의한 Group A streptococcus 검사를 위한 자체 수집 및 의료계 종사자 수집된 인후 표본(Swab)의 동일 성능을 개시하는 이전의 보고에 기반하여 설계 및 진행되었다. 지원자 간의 접촉 및 지원자와 의료계 종사자 간의 접촉을 방지하기 위해, 자체수집 절차를 채택하였다. 자체 수집은 0.4m/s의 일정한 공기 유입으로 통풍이 잘되는 후드에서 수행되었다. 각 지원자들은 샘플을 수집하는데 있어 도 1에 도시된 절차를 엄격히 준수하였다.

면봉에 사용될 수 있는 일부 목재 재료에 박테리아와 바이러스에 독성이 있는 화학물질이 포함된 것으로 알려져 있으므로, 목재 샤프트 위에 플라스틱 샤프트(6.4 x3.4 x 16.87mm 팁, 163.3mm길이 Catalog #: 6-6587-31; LMS, 일본)가 있는 폴리 에스테르 면봉을 선택하여 사용하였다. 수집 후에는 면봉을 즉시 15ml 원심분리 튜브에 넣었으며, 면봉에 수집된 조직을 즉시 옮기고 면봉을 20번정도 상하 및 둥글게 휘저어서 500μl의 Dulbecco's Modification of Eagle's 배지(DMEM, Catalog #: 10-013-CV, Corning, USA)로 (현탁/용해)시켰다. 이후, 면봉을 생물학 폐기물에 버리고 상기 원심분리 튜브를 튜브랙에 넣었다. 지원자가 샘플 수집 절차를 마치고 수집현장을 떠난 후, 15ml 원뿔형 튜브의 뚜겅을 열고 300μl의 DMEM에 현탁된 조직 샘플을 700μl의 트리졸(Trizol) (easy-BLUE Total RNA Extraction Kit; Catalog #17061; iNtRON, Republic of Korea), 에 옮겨 5회 뒤집어 혼합하였다. 여기서, 트리졸(Trizol)을 함유한 1.5 ml 원심 분리 튜브는 바이러스가 없는 것으로 간주되어, 비감염성 및 안정성의 특성을 갖는 것으로 간주하였다. 상기 1.5ml 튜브를 샘플 수집장소에서 떨어진 인증된 생물 안정성 레벨 II 실험실의 벤치로 이동시켰다.

RNA 추출

수집된 조직 샘플 유래의 전체 RNA를 트리졸(Trizol)로 추출하였다. 조직 샘플을 실온에서 5분동안 트리졸(Trizol)에서 배양한 후, 200μl 클로로포름을 첨가하고 튜브를 5회 뒤집어 혼합하였다. 이어서, 1.5ml 튜브를 3분동안 배양 하고, 4℃및 12000xg로 15분간 원심분리하였다. RNA(약 500~600μl)를 함유하는 투명한 상층액을 새로운 1.5 ml 튜브로 옮기고 동일한 양의 이소프로판올을 첨가하여, 5번 뒤집어 부드럽게 혼합한 뒤 얼음 위에서 10분간 반응시키고, 4℃ 조건에서 12000xg로 10분간 원심 분리하였다. 상층액을 버리고 나머지 침전물(pellet, 보일 때), 또는 침전물이 생길 것으로 예측되는 위치(보이지 않는 경우)를 500μl의 75% 에탄올에 재현탁 하였다. 샘플을 다시 4℃조건에서 7500xg로 5분동안 원심 분리한 뒤, 상등액을 버리고 RNA 침전물을 5~10분동안 공기건조 하였다. RNA 침전물을 가용화하기 위해, 침전물을 10μl의 RNase-free water에 재현탁하고, 37℃에서 10~15분 동안 배양하였다. RNA 농도 및 순도는 260/280 및 260/230의 파장에서 광학 밀도비를 계산하여, NanoDrop(Thermo Fisher Scientific, USA)으로 측정하였다. 전체 RNA 추출의 전체 과정에 약 1시간이 소요되었다.

cDNA 제조

SARS-CoV-2 바이러스 감염여부를 확인하기 위한 RT-PCR을 위해 제조사의 지시에 따라 지원자 샘플의 전체 RNA를 SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System (Catalog #: 18080051; Invitrogen, USA)을 사용하여 cDNA로 역전사하였다. cDNA의 제조를 위해, 8μl의 추출된 RNA, 1μl의 50μM 올리고(dT)20, 및 1μl의 10mM NTP 혼합물을 준비하고, 역전사 효소를 함유하는 10μl의 cDNA 합성 믹스를 첨가하였다. 전체 절차에 약 1시간 30분이 소요되었다.

SARS-CoV-2 전체 RNA에 대한 양성 대조군 제조

SARS-CoV-2 바이러스 RNA를 함유하는 양성 대조군은 MOI 0.05에서 바이러스클론 BetaCoV/Korea/KCDC03/2020에 감염된 Vero 세포로부터 전체 RNA를 추출하여 제조하였다. 자세한 프로토콜은 이미 공지되어 있다. 상기 대조군의 전체 RNA를 cDNA로 역전사하였으며, 생성된 cDNA를 RT-PCR과정에서, SARS-CoV-2의 양성 대조군으로 사용하였다.

SARS-CoV-2 특이적 프라이머 쌍

프라이머는 한국 최초의 환자로부터 최근 이용가능한 SARS-CoV-2 바이러스의 전체 시퀀스를 기반으로 설계하였다(Park, W.B., et al., J Korean Med Sci, 2020. 35(7): p. e84.). NCBI-프라이머 BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 사용하여 특정 프라이머를 설계하였다. 일부 프라이머 쌍은 미국의 CDC에 의해 보고된 프라이머 쌍을 사용하였다(CDC, C.f.d.c.a.p., Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), 2020). 설계된 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 Macrogen (한국)과 Cosmogenetech (한국)의 두 회사에서 합성하여 제공받았다.

인간 RNAse P 단백질 프라이머의 경우, 직접 동정한 프라이머 2쌍(IBS_RPP30 및 IBS_RPP40), 및 CDC에서 제공받은 프라이머 1쌍(CDC_RNAse P)을 사용하였다. GAPDH 및 18S rRNA 프라이머는 당업계에 공지된 것을 사용하였으며(Tsubouchi, et al. (2017). J Radiat Res, 58(6), 816-826; Song, W., et al.(2016), Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 62(13), 29-34.), 베타-엑틴(ACTB) 및 TATA 박스 결합 단백질(TBP) 프라이머는 직접 동정하여 사용하였다.

본 발명에서 동정한 프라이머 농도는 약 0.5μM이며, CDC로부터 제공받은 프라이머의 농도는 약 0.05-20 μM 이다.

본 발명의 실시예에서 사용된 프라이머 쌍은 하기 표 3과 같다.

IPC: 내부 대조군RdRP: RNA-의존 RNA 중합효소 유전자S: 스파이크 단백질 유전자

E: 피막 단백질 유전자

N: 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(Nucleocapsid protein gene)

GAPDH: 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH),

ACTB: 베타-액틴,

TBP: TATA 박스 결합 단백질

정량 RT-PCR

정량 RT-PCR(quantitative RT-PCR)은 SYBR Green PCR Master Mix (카탈로그 번호: 4367659; Applied Biosystems, USA)를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 각 반응 버퍼는 8μl의 100μM 정방향 및 역방향 프라이머(각 프라이머당 4μl), 2μl의 cDNA 및 10μl의 power SYBR Green PCR Master Mix를 함유하는 총 부피 20μl로 구성하였다. RT-PCR은 Quantstudio 1 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)으로 수행되었다. 임계주기(threshold cycle(Ct)) 값을 계산하기 위한 임계 값의 자동 설정은 Quantstudio Design & Analysis software에 의해 결정되었다. 전체 RT-PCR 절차에 약 1시간 10분이 소요되었다.

렌티바이러스를 사용한 검출 효율 및 한계의 결정

바이러스 수집의 효율성은 잘 알려진 RNA 함유 재조합 바이러스인 렌티바이러스(Lentivirus)를 사용하여 독립적으로 평가되었다. 이 연구에 사용된 렌티바이러스는 mCherry 리포터와 함께 pSicoR-스크램블을 가지는 shRNA이다(Ventura, A., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(28): p. 10380-5.). 상기 렌티바이러스는 IBS 바이러스 시설((http://www.ibs.re.kr/virusfacility)에 의해 미리 5.91x107 genomic copies/ml의 역가로 패키지 되었다. 유전자 복제 수 대비 Ct값에 대한 교정 곡선은 qPCR 렌티바이러스 적정 키트(Catalog #: LV900, ABM, USA)를 사용하여 RT-PCR 기계, Quantstudio 1 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)으로부터 얻었다.

트리졸(Trizol) 기반 RNA 추출의 효율성을 비교하기 위해, 트리졸(Trizol) 기반 방법으로 추출된 RNA와 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Lot #: 52904, Qiagen, USA)로 추출된 RNA를 비교했다. 효율성은 밤새 12시간 감염된 렌티바이러스 감염 HEK293T 세포에서 실험되었다.

본 실시예의 전체적인 절차는 도 2의 개략도에 도시된 것과 같다. 각각의 지원자는 조직 샘플을 자체 수집하기 위해, 인후 표본(swab) 수집 스테이션을 방문하였으며, 전체 rNA 추출, cDNA 제작 및 RT-PCR은 공간적으로 분리된 생물안전성 레벨II 실험실에서 진행되었다.

실시예 1: SARS-CoV-2와 관련한 지원자의 증상 이력

인후 표본 샘플을 자체수집하기 위해 총 12명의 무증상 지원자가 지원하였다. 모든 지원자들은 정상 체온범위인 37℃ 미만의 체온을 가지고 있었으며, 발열 증상이 없었다(표 4). 마른 기침 및 두통 및 열을 나타내는 지원자 1 및 근래 급성 비인두염으로 진단되었지만 COVID-19(SARS-CoV-2 감염증)에는 음성으로 확인된 지원자 12를 제외한 나머지 10명의 지원자는 COVID-19의 증상을 보이지 않았다(표 4). 지원자 1은 COVID-19와 다소 유사한 증상을 보였지만 아스피린 복용 직후 열이 내려 단순한 인플루엔자로 진단되었으며, 열이 없어 정부가 지원하는 코로나바이러스 진단 검사를 거부당한 바 있다. SARS-CoV-2에 대해 최근 확인된 진단 테스트로 지원자 12는 완전한 음성으로 확진되었다. 지원자 1 및 지원자 12는 모두 일주일동안 자체 격리된 후 격리 해제되었다. 모든 지원자들은 확진된 SARS-CoV-2 감염자와 접촉한 이력이 없으며, 지원자 2와 지원자 11 및 지원자 4와 지원자 12의 2커플은 각각 서로 배우자이다.

지원자 정보 및 증상 이력

지원자	체온(℃)	증상 이력 및 CPVID-19 환자 접촉여부	RNA 농도 (ng/ μl)	RNA 순도 A260/A280, A260/A230	본 발명 검사 결과
1	36.6	아스피린으로 해열된 발열, 마른기침, 두통, 자가격리 1주, 접촉이력 없음	171.3	1.77, 1.95	1차 음성
2	36.7	무증상, 접촉이력 없음 11번의 배우자	204.5	1.80, 2.07	1차 음성
3	36.7	무증상, 접촉이력 없음	309.9	1.96, 2.21	1차 음성
4	36.4	무증상, 접촉이력 없음2번의 배우자	580.6	1.69, 1.98	1차 음성
5	36.8	무증상, 접촉이력 없음	445.2	2.16, 2.30	1차 판정불가2차 음성
6	36.4	무증상, 접촉이력 없음	366.3	2.04, 2.24	1차 음성
7	36.6	무증상, 대구 방문, 자가격리 2주, 접촉이력 없음	210.5	1.67, 1.87	1차 음성
8	36.7	무증상, 접촉이력 없음	185.7	1.72, 1.94	1차 음성
9	36.6	무증상, 접촉이력 없음	349.2	1.83, 2.13	1차 판정불가2차 판정불가
10	36.7	무증상, 접촉이력 없음	197.4	1.67, 1.98	1차 음성
11	36.8	무증상, 접촉이력 없음2번의 배우자	219.8	1.82, 2.11	1차 음성
12	36.4	급성 비인두염 진단, COVID-19 음성 확진, 자가격리 1주일, 접촉이력 없음 4번의 배우자	200.8	1.84, 2.10	1차 판정불가 2차 음성

실시예 2: 인후 또는 인두 면봉을 통한 조직샘플의 자체 수집

각 지원자의 조직샘플은 인두 면봉 또는 인후 면봉을 통해 편도선에서 수집되었다(도 3A). 지원자와 시험자 사이의 접촉을 최소화하기 위해 각 지원자는 격리되었으며, 통풍이 잘되는 "인후 표본 스테이션(Throat swab station)"에서 독립적으로 절차를 수행하도록 하였다. 자체 수집 직후, 각 지원자는 자체 수집한 조직 샘플을 튜브의 DMEM에 용해 및 분리하였다(도 3B). 튜브랙에 조직 샘플이 담긴 튜브를 위치시킨 후, 각각의 지원자에게 조직 샘플을 함유하는 DMEM을 트리졸(Trizol)로 옮기도록 요청하여, 감염성 바이러스 및 기타 살아있는 유기체를 비활성화 시켰다(도 3B). 이 시점에서 조직 샘플은 비감염성인 것으로 간주되었다. 시험자는 트리졸(Trizol) 비활성화 조직 샘플을 생물 안정성 레벨 II 실험실로 조심스럽게 옮기고 여기서 조직 샘플은 전체 RNA의 추출을 위해 추가적으로 처리되었다(도 3C). 이 절차에 총 10분이 채 걸리지 않았다.

실시예 3: 전체 RNA 추출 및 cDNA제조

조직 샘플에 SARS-CoV-2 바이러스가 있는 경우, 추출된 RNA는 바이러스 RNA와 인간 RNA를 모두 포함할 것으로 예상했다. RNA 추출 과정에서 우리는 각각의 자원자 샘플로부터 287ng/μl의 RNA함유 물질을 얻을 수 있었으며, 페놀 오염으로 인한 상대적으로 순도가 낮았으나(표 4), 페놀은 RT-PCR 결과에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 이어서, 추출된 RNA를 SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System (Catalog #: 18080051; Invitrogen??, USA), 를 사용하여 cDNA를 제조하하였다. 평균적으로 이 절차는 약 60분이 소요되었다.

실시예 4: 렌티바이러스를 이용한 RT-PCR 시스템의 검출효율 및 한계측정

Ct 값에 기반한 유전자 복제 수를 예측할 수 있도록, 본 발명의 RT-PCR 시스템을 보정하기 위해, 이미 알고 있는 Lentiviral Long terminal repeats (LTR)의 복제 수로 SYBR Green 기반의 RT-PCR을 수행하여 표준곡선을 생성하였다(도 4A). 적합 라인(fitted line)은 약 35의 Ct 값이 유전자의 약 1복제인 것으로 추정되었으며, 상기 Ct 값이 본 실시예의 RT-PCR 시스템의 검출 한계로 결정되었다. 따라서, 본 발명의 RT-PCR 시스템의 검출한계로 약 37의 Ct 값으로 엄격하게 제한하였다. 그 뒤, 렌티바이러스를 사용하여, 트리졸(Trizol) 기반의 RNA 추출 효과를 트리졸(Trizol) 추출방법보다 매우 비싸지만 RNA 추출에 널리 사용되는 QIAgene사의 Viral RNA Mini Kit와 비교하여 테스트 했다. 테스트 결과 QIAmpt와 트리졸(Trizol) 사이에 렌티바이러스에 감염된 HEK293 세포로부터 RNA를 추출하는 능력이 실질적으로 큰 차이가 없음을 확인하였다(도 4B, 4C). 상기 결과는 트리졸(Trizol)이 시판되는 키트와 비교하여, RNA 추출에 동등한 민감성을 가지며 효과적이라는 것을 의미한다. 따라서, 상기 결과를 바탕으로 본 발명의 일 실시예에서는 트리졸(Trizol) 기반의 RNA 추출방법을 사용하였다.

실시예 5: 프라이머 쌍의 동정 및 각 프라이머 쌍에 대한 검증

본 발명의 중요한 특징 중 하나는 SARS-CoV-2를 다른 일반 RNA와 구별할 수 있는 독특한 프라이머 서열을 확인하였다는 데 있다. 최근 보고된 한국 최초의 환자에서 유래한 SARS-CoV-2의 genomic RNA의 전체 서열(도 5, (Park, W.B., et al., J Korean Med Sci, 2020. 35(7): p. e84))을 활용하여, SARS-CoV-2를 특이적으로 표적하는 고유한 서열을 동정하였다.

실시예 5-1: 주형 cDNA 없는 조건에서, 프라이머 쌍에 대한 검증

우선, 미국 CDC로부터 입수 가능한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(N)를 표적으로하는 다음의 3개의 프라이머 쌍을 확인하였다: CDC_N1, CDC_N2 및 CDC_N3(도 5 및 표 3). 예상과는 다르게, 상기 3종의 프라이머 쌍 중 2개의 프라이머 쌍(CDC_N2 및 CDC_N3)는 주형(tamplate)인 cDNA가 없는 경우에도, SYBR Green 기반 RT-PCR에서 각각 20.266 및 21.129의 유의미한 Ct 값(Ct 값<37)을 나타내어 위양성 신호(false positive signal)를 생성하였다(도 6A, 표 5). 특히, RT-PCR 후 반응 생성물로 전기 영동을 수행할 때 100 염기쌍 미만의 명확한 PCR 생성물 밴드 크기를 발견하였다(도 6B). 증폭 대상인 cDNA 주형이 없다는 사실을 고려하면 상기한 결과는 SYBR Green 기반 RT-PCR을 사용하여 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는 데 CDC_N2 및 CDC_N3의 프라이머 쌍이 적절하지 않다는 것을 의미한다.

따라서, 보다 적합한 프라이머 쌍을 동정하기 위해 SARS-CoV-2 바이러스 유전자에서 보존률이 높을 것으로 예상되는 지역을 대상으로 프라이머 시퀀스를 검색하였으며, RNA 의존 RNA 중합효소 유전자(RdRP; RNA-dependent RNA polymerase gene), 스파이크 단백질 유전자(S; spike protein gene), 외막 단백질 유전자(E; envelope protein gene) 및 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(N; nucleocapsid protein gene)를 표적으로 하는 총 15개의 프라이머 쌍(총 30개의 프라이머)를 동정하였다(표 3).

상기 정방향 및 역방향 프라이머 쌍의 프라이머 쌍 각각은 100 내지 120개의 염기쌍의 RT-PCR 생성물을 생산할 수 있다. 상기 표 3의 프라이머 쌍 SARS-CoV-2_IBS_RdRP1, SARS-CoV-2_IBS_S1, SARS-CoV-2_IBS_E1, SARS-CoV-2_IBS_N1, SARS-CoV-2_IBS_RdRP2, SARS-CoV-2_IBS_RdRP3, SARS-CoV-2_IBS_S2, SARS-CoV-2_IBS_E2 및 SARS-CoV-2_IBS_N2는 모두 주형 cDNA가 없는 조건의 SYBR Green 기반 RT-PCR에서 37 이상의 Ct 값을 나타내어 위양성 신호를 나타내지 않았다(표 5).

또한, 내부 대조군 역할을 하는 인간 RNA 특이적 프라이머 쌍을 동정하였다. tRNA를 합성하는 인간의 모든 세포 및 세포 구성의 유비퀴터스 효소(ubiquitous enzyme)인 인간 리보뉴클라아제 P(Ribonuclease P; RNase P) 단백질을 표적으로 동정하였으며(Gopalan, V., A. Vioque, and S. Altman, J Biol Chem, 2002. 277(9): p. 6759-62), 상기 표 3의 각각 RPP 서브유닛 30 및 40을 표적으로하는 IBS_RPP30 및 IBS_RPP40 프라이머 쌍을 선택하였다. 또한, 동일한 RNase P 단백질을 표적으로 하는 내부대조군 프라이머 쌍인 CDC_RNAse P를 CDC로부터 얻어 사용하였다. 상기 내부 대조군 프라이머 쌍 또한 SARS-CoV-2 표적 프라이머 쌍과 같은 방법으로 주형 cDNA가 없는 조건의 SYBR Green 기반 RT-PCR을 통해 검증 되었고, 모든 프라이머가 위양성을 나타내지 않았다(도 6A, 표 5). 상기 내부 대조군 프라이머 쌍은 SARS-CoV-2 검출에 있어서, 음성 신호의 유효성을 평가하는데 중요한 지표로 사용된다.

cDNA 주형 없는 조건에서, 표 3의 프라이머 쌍의 Ct 값

프라이머	Ct 값
IBS_RdRB1	u.d.
IBS_RdRB2	u.d.
IBS_RdRB3	u.d.
IBS_S1	u.d.
IBS_S2	u.d.
IBS_E1	u.d.
IBS_E2	u.d.
IBS_N1	u.d.
IBS_N2	u.d.
IBS_RPP30	u.d.
IBS_RPP40	u.d.
CDC_RNase P	u.d.
CDC_N1	u.d.
CDC_N2	20.266
CDC_N3	21.129

u.d. = undetermined (Ct ＞37 cycles)

실시예 5-2: SARS-CoV-2 프라이머 쌍의 표적 선택성 및 검출 민감성 검증

SARS-CoV-2 RNA를 대상으로 상기 동정한 각각의 SARS-CovV-RNA 프라이머 쌍을 사용하여 SYBR-Green 기반의 RT-PCR을 수행하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 20이하의 Ct 값을 나타내는 것을 확인하였으며, 실시예 5-1에서 확인한 것과 종합하면, 본 발명에서 동정한 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 쌍이 기존의 CDC 프라이머 쌍보다, SARS-CoV-2 RNA 표적 선택성 및 검출 민감성이 현저히 뛰어나다는 것을 의미한다.

이어서, 상기 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 쌍 중, SARS-CoV-2_IBS_RdRP1, SARS-CoV-2_S1, SARS-CoV-2_E1, SARS-CoV-2_N1을 혼합하여 하나의 튜브에서 SARS-CoV-2 RNA가 있는 조건(보라색) 및 없는 조건(하늘색)에서 각각 SYBR-Green 기반의 RT-PCR을 수행하였다. 도 8에 도시된 바와 같이 주형 cDNA가 없는 경우에는 37 이상의 Ct 값을 나타내는 것에 반해, SARS-CoV-2 표적 RNA가 있는 경우에는 10 이하의 Ct 값을 나타내어 혼합하여 사용하는 경우에도 높은 표적 선택성 및 검출 민감성을 나타내는 것을 검증하였다.

실시예 6: SARS-CoV-2 감염 세포(Vero) 및 비감염 세포(HEK-293T) 샘플에 대한 PCR

본 발명에서 동정된 SARS-CoV-2 표적 프라이머 쌍 중 SARS-CoV-2_IBS_RdRP2, SARS-CoV-2_IBS_ S2, SARS-CoV-2_IBS_ E2 및 SARS-CoV-2_IBS_ N1 primer를 사용하여, SARS-CoV-2 감염 세포(Vero) 및 비감염 세포(HEK-293T) 샘플로부터 추출된 전체 RNA에 대해 PCR을 수행하였으며, 프라이머의 신뢰도 검증을 위해서 GAPDH 유전자를 표적으로 하는 프라이머 쌍을 함께 사용하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, SARS-CoV-2각각의 프라이머 쌍이 세포 추출 전체 RNA에서 표적하는 SARS-CoV-2 RNA를 검출할 수 있음을 확인하였으며, HEK-293T 샘플에서는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 쌍을 사용한 PCR 산물이 검출되지 않았다. 신뢰도 검증을 위해서 사람 유래 세포인 HEK-293T에서 많이 발현하는 유전자인 GAPDH 유전자를 함께 확인하였다. SARS-Cov-2 유전체는 아프리카 녹색 원숭이 유래의 세포주인 Vero에서 증식 및 추출되었기 때문에 코로나 바이러스 핵산 샘플에 GAPDH 유전자가 포함되어 있을 수 있다. 도 9에 도시된 바와 같이, GAPDH는 양 세포에서 검출되어 본 실시예의 결과의 신뢰도가 검증되었다.

상기 두 세포 샘플에 대해서, 본 발명에서 동정된 SARS-CoV-2 표적 프라이머 쌍 중 SARS-CoV-2_IBS_RdRP2, SARS-CoV-2_IBS_ S2, SARS-CoV-2_IBS_ E2 및 SARS-CoV-2_IBS_ N1 primer를 사용한 정량 RT-PCR을 통해 Ct 값 및 PCR 산물의 melting curve를 분석하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, SARS-CoV-2_IBS_RdRP, S, E, N 유전자를 타겟으로 하는 각각의 프라이머 쌍으로 RT-PCR을 한 경우, 대부분 SARS-CoV-2 감염 세포의 전체 RNA에 대해서만 반응하였다. 다만, SARS-CoV-2_IBS_N1의 경우 HEK-293T에서 약간의 반응을 나타내었으나, melting curve 분석 결과 비특이적 반응인 것으로 확인되어, 각각의 프라이머 쌍의 표적 선택성 및 검출 민감성이 뛰어남을 검증하였다.

이어서, 상기 두 세포의 전체 RNA 샘플에 대해서 Multiplex PCR을 수행하여, 본 발명에서 동정한 SARS-CoV2 프라이머 쌍(SARS-CoV2_IBS_m_RdRP1, SARS-Cov2_IBS_m_RdRP2, SARS-Cov2_IBS_m_S1, SARS-Cov2_IBS_m_S2, SARS-Cov2_IBS_m_N1 및 SARS-Cov2_IBS_m_N2) 및 내부 대조군 프라이머 쌍(IBS_m_ACTB1, IBS_m_ACTB2, IBS_m_TBP1 및 IBS_m_TBP2)을 검증하였다. 우선, Multiplex PCR을 수행하기 위해 동정된 프라이머의 효율을 확인하여, SARS-CoV-2_IBS_m_RdRP1, SARS-CoV-2_IBS_m__S1 및 SARS-CoV-2_IBS_m_N1을 SARS-CoV-2 RNA 검출용 프라이머 쌍으로, GADPH, 18s rRNA, IBS_m_ACTB1 및 IBS_m_TBP1을 내부 대조군 RNA 검출용 프라이머 쌍으로 선정하였다(도 11A). 이후, 상기 선정된 프라이머 쌍으로 상기 두 세포의 전체 RNA 샘플에 Multiplex PCR을 수행하였다. Multiplex PCR 수행 결과, 도 11B에 도시된 바와 같이, SARS-Cov-2의 검출을 의미하는 4개의 밴드가 나타났으며, 사람 유래 세포주인 HEK-293T에서는 PCR 산물이 나타나지 않았고(도 11B 왼쪽), 해당 결과의 신뢰도는 내부 대조군의 검출을 통해 검증되었다(도 11B 오른쪽).

실시예 7: 지원자 샘플의 RT-PCR

상기 실시예 5 및 실시예 6에서 검증한 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 쌍을 사용하여 각 지원자 샘플에 대해 RT-PCR을 수행하였다. 샘플의 양성 대조군으로 BetaCoV/Korea/KCDC03/2020 바이러스 감염 Vero 세포에서 추출하여 정제된 SARS-CoV-2의 전체 RNA를 이용했다. 예상과 같이, SARS-CoV-2 양성 대조군은 본 발명의 프라이머 쌍, CoV2_IBS_RdRP1, SARS-CoV2_IBS_S1, SARS-CoV2_IBS_E1 및 SARS-CoV2_IBS_N1 모두에서 내부 대조군 프라이머 중 하나 이상과 함께 37 미만의 Ct 값을 갖는 유의미한 양성 신호를 나타냈다(도 12A 및 표 6). 지원자 샘플 중 대부분은 3개의 내부 대조군 프라이머 쌍 중 하나 이상에 대해 양성 신호를 나타냈으며, 동시에 4가지 SARS-CoV-2 프라이머 쌍 모두에 대해 음성신호를 나타냈다(도 12B, 표 6). 12명의 지원자 샘플 중 3개(지원자 5, 9 및 12)는 SARS-CoV-2 프라이머 쌍 및 내부 대조 프라이머 쌍에 대해 모두 음성 신호를 나타냈으며(표 6), 세 지원자 샘플의 결과는 유의미하지 않은 것으로 간주되어 처음부터 재시험되었다. 상기 세명의 지원자들은 추가적인 수집을 위해 다시 호출되었다. 음성 대조군의 경우 주형 cDNA가 없는 조건을 사용했으며, 모든 프라이머 쌍은 예상대로 음성을 나타냈다(도 12C, 표 6).

각 지원자의 RT-PCR 결과

주형	SARS-CoV-2_ IBS_RdRP1	SARS-CoV-2_IBS_S1	SARS-CoV-2_IBS_E1	SARS-CoV-2_IBS_N1	IBS_ RPP30	IBS_ RPP40	CDC_ RNase P
SARS-CoV-2	30.3	28.5	31.1	30.6	u.d.	u.d.	35.2
지원자 1	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	35.4	u.d.	u.d.
지원자 2	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	34.5
지원자 3	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	35.2	34.1	34.8
지원자 4	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	33.4	u.d.
지원자 5	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.
지원자 6	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	31.4	u.d.	32.7
지원자 7	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	31.9	u.d.	32.9
지원자 8	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	34.8	u.d.	u.d.
지원자 9	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.
지원자 10	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	34.9
지원자 11	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	31.2	30.8	32.9
지원자 12	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.
주형 cDNA 없음	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.

Ct value, u.d. = undetermined (Ct ＞37 cycles)

상기 표 6에 기재된 것과 같은 RT-PCR 결과를 해석하기 위해 SARS-CoV-2 프라이머 쌍 및 내부 대조 프라이머 쌍의 RT-PCR 결과의 조합에 기반한 해석 표를 작성하였다(표 7). 이러한 해석표의 주요한 목표는 4가지 SARS-CoV-2 프라이머 쌍에 대한 RT-PCR 결과가 모두 음성신호를 나타내는 것을 요구하는 것과 같이 SARS-CoV-2 비감염(감염 음성) 판정에 대한 엄격한 기준을 세우는 것이다. 이러한 SARS-CoV-2 비감염(감염 음성) 판정은 내부 대조군 프라이머 쌍 중 하나 이상에 대한 RT-PCR결과가 양성으로 확인되어야 유효하다(표 7). 대조적으로 SARS-CoV-2 감염(감염 양성) 판정 조건은 4개의 SARS-CoV2 프라이머 쌍 중 하나 이상이 양성인 경우로서, 감염 음성 판정 조건과 비교하여 덜 엄격하다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 감염 양성으로 판단된 경우, 잠재적인 감염 양성으로 판단할 수 있으며, 다른 인증된 엄격한 기준의 진단방법 등이 추가로 수행될 수 있다.

RT-PCR 결과 해석표

상기 표 7의 엄격한 감염 음성 판정 기준에 근거하여, 12명의 지원자중 9명은 SARS-CoV-2에 대해 감염 음성으로 판정되었으며, 다른 3명은 내부 대조군 프라이머 쌍에 대한 양성 신호가 검출되지 않아(표 6, 지원자 5, 9, 12), cDNA 주형의 양을 2배로 늘려 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 재시험 결과 지원자 5 및 지원자 12는 여전히 SARS-CoV-2 프라이머 쌍에 대해 음성 신호를 보였으며, 3 개의 내부 제어 프라이머 쌍 중 하나는 양성 신호를 나타냈고(표 8), 따라서, 지원자 5와 지원자 12는 감염 음성으로 판정되었다.

재검사 결과

대상	SARS-CoV-2_IBS_RdRP1	SARS-CoV-2_IBS_S1	SARS-CoV-2_IBS_E1	SARS-CoV-2_IBS_N1	IBS_ RPP30	IBS_ RPP40	CDC_ RNase P
지원자 5	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	35.644	u.d	u.d
지원자 9	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d	u.d	u.d
지원자 12	u.d.	u.d.	u.d.	u.d.	u.d	u.d	36.649

실시예 7: 본 발명의 진단 프로토콜의 소요비용 및 소요 시간

상기 실시예들에서, 소요된 비용 및 시간은 다음 표 9 및 10와 같다.

지원자 샘플당 소요 비용 ($ = US Dollar)

재료	판매가	수량	비용 (PCR 1회)	지원자당 비용 (PCR 8회)
Swab and tongue presser	$5.00	100 each	$0.50	$0.50
easy-BLUE^TM Total RNA Extraction Kit (Trizol)	$154.17	100 ml	$1.07	$1.07
SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System	$406.67	50 회분	$8.13	$8.13
Power SYBR^TMGreen PCR Master Mix	$322.5	5 ml	$0.65	$5.20(8회)
Primer set				$0.10
Tubes and buffers				$1.00
			총 비용	$15.00

지원자 샘플당 소요 시간

단계	소요 시간(분)
샘플 수집	10
RNA 추출	60
cDNA 합성	90
RT-PCR	70
총 시간	230 (3시간 50분)

상기 표와 같이 총 소요 비용은 약 15달러(한화 약 16000원)이며, 총 검사시간은 4시간 이내이다. RNA를 cDNA로 역전사하는 단계를 생략하면 이러한 기간을 단축할 수 있다. 현재 역전사 효소 및 중합효소를 함께 포함하는 여러 시판 키트가 있다. 이러한 키트를 이용하는 경우 지속시간은 약 1시간 단축되나 각 샘플의 비용이 4배이상 증가한다. 따라서, 본 발명의 트리졸(Trizol)을 이용한 RNA 추출 방법 및 SYBR Green 기반 RT-PCR을 이용한 SARS-CoV-2의 감염여부 진단을 위한 정보제공방법은 약 15 달러 및 약 4 시간이 소요되는 경제적/시간적으로 최적화되었으면서도, 매우 민감도 및 정확도로 SARS-CoV-2 감염여부, 특히 SARS-CoV-2 비감염에 대한 확진이 가능하다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INSTITUTE FOR BASIC SCIENCE <120> A Laboratory-safe and Low-cost Detection Protocol for SARS-CoV-2 of the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) <130> P20-B079 <150> KR 2020-0028424 <151> 2020-03-06 <160> 54 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_RdRP1 Forward primer <400> 1 catgtgtggc ggttcactat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_RdRP1 Reverse primer <400> 2 tgcattaaca ttggccgtga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_S1 Forward primer <400> 3 ctacatgcac cagcaactgt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_S1 Reverse primer <400> 4 cacctgtgcc tgttaaacca 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_E1 Forward primer <400> 5 ttcggaagag acaggtacgt t 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_E1 Reverse primer <400> 6 cacacaatcg atgcgcagta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_N1 Forward primer <400> 7 caatgctgca atcgtgctac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_N1 Reverse primer <400> 8 gttgcgacta cgtgatgagg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_RdRP2 Forward primer <400> 9 agaatagagc tcgcaccgta 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_RdRP2 Reverse primer <400> 10 ctcctctagt ggcggctatt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_RdRP3 Forward primer <400> 11 tctgtgatgc catgcgaaat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_RdRP3 Reverse primer <400> 12 actacctggc gtggtttgta 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_S2 Forward primer <400> 13 gctggtgctg cagcttatta 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_S2 Reverse primer <400> 14 agggtcaagt gcacagtcta 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_E2 Forward primer <400> 15 ttcggaagag acaggtacgt ta 22 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_E2 Reverse primer <400> 16 agcagtacgc acacaatcg 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_N2 Forward primer <400> 17 gctgcaatcg tgctacaact 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_N2 Reverse primer <400> 18 tgaactgttg cgactacgtg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_m_RdRP1 Forward primer <400> 19 gctcgcaaac atacaacgtg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_m_RdRP1 Reverse primer <400> 20 cattaacatt ggccgtgaca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_m_RdRP2 Forward primer <400> 21 tgaaatcaat agccgccact 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_m_RdRP2 Reverse primer <400> 22 tgtttgcgag caagaacaag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_m_S1 Forward primer <400> 23 cagatgctgg cttcatcaaa 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_m_S1 Reverse primer <400> 24 ggttggcaat caatttttgg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_m_S2 Forward primer <400> 25 actgttttgc cacctttgct 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_m_S2 Reverse primer <400> 26 agcttgtgca ttttggttga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_m_N1 Forward primer <400> 27 aaggaaattt tggggaccag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2_IBS_m_N1 Reverse primer <400> 28 gagtcagcac tgctcatgga 20 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ttgattttgg agggatctcg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA Forward primer <400> 45 cggctaccac atccaaggaa 20 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA Reverse primer <400> 46 gctggaatta ccgcggct 18 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBS_m_ACTB1 Forward primer <400> 47 ctcctgagcg caagtactcc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBS_m_ACTB1 Reverse primer <400> 48 gtcaccttca ccgttccagt 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBS_m_ACTB2 Forward primer <400> 49 agagctacga gctgcctgac 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBS_m_ACTB2 Reverse primer <400> 50 agtacttgcg ctcaggagga 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBS_m_TBP1 Forward primer <400> 51 gttctgggaa aatggtgtgc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBS_m_TBP1 Reverse primer <400> 52 ggaggcaagg gtacatgaga 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBS_m_TBP2 Forward primer <400> 53 aatatggtgg ggagctgtga 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IBS_m_TBP2 Reverse primer <400> 54 ggcacttaca gaagggcatc 20

Claims

다음을 포함하는 대상의 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공 방법으로,
(a) 대상으로부터 분리된 샘플로부터 전체 RNA를 추출하는 단계; 및
(b) 상기 추출된 전체 RNA로부터 코로나바이러스 RNA 및 내부 대조군(internal control) RNA를 MultiPlex 중합 효소 연쇄반응(PCR)을 통해 동시에 검출하는 단계;
여기서, 상기 코로나바이러스 RNA는 RNA-의존 RNA 중합효소 유전자(RNA-dependent RNA polymerase gene), 스파이크 단백질 유전자(Spike protein gene), 피막 단백질 유전자(Envelope protein gene) 및 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(Nucleocapsid protein gene)이며,
상기 RNA-의존 RNA 중합효소 유전자의 RNA는 서열번호 1과 서열번호 2; 및 서열번호 9와 서열번호 10으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 검출하고,
상기 스파이크 단백질 유전자(Spike protein gene)의 RNA는 서열번호 3과 서열번호 4; 및 서열번호 13과 서열번호 14로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 검출하며,
상기 피막 단백질 유전자(Envelope protein gene)의 RNA는 서열번호 15와 서열번호 16으로 표시되는 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 검출하고,
상기 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(Nucleocapsid protein gene)의 RNA는 서열번호 7과 서열번호 8로 표시되는 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 검출하며,
상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플을 트리졸(Trizol)에 보관하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a)단계는 트리졸(Trizol)을 사용하여 전체 RNA를 추출하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 SYBR Green 기반 역전사 중합효소 연쇄반응(SYBR Green based RT-PCR)을 통해 코로나바이러스 RNA 및 내부 대조군 RNA를 검출하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 내부 대조군(internal control) RNA는 RNase P 단백질 RNA, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH) RNA, 18S rRNA, 베타-엑틴(ACTB) RNA 및 TATA 박스 결합 단백질(TBP) RNA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 RNA인 것을 특징으로 하는 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공 방법.
삭제
제6항에 있어서, 상기 RNase P RNA는 서열번호 37 및 서열번호 38, 서열번호 39 및 서열번호 40, 및 서열번호 41 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 검출하고,
상기 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소 효소(GAPDH) RNA는 서열번호 43 및 서열번호 44의 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 검출하며,
상기 18S rRNA는 서열번호 45 및 서열번호 46의 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 검출하고,
상기 베타-엑틴(ACTB) RNA는 서열번호 47 및 서열번호 48, 또는 서열번호 49 및 서열번호 50의 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 검출하며,
상기 TATA 박스 결합단백질(TBP) RNA는 서열번호 51 및 서열번호 52, 또는 서열번호 53 및 서열번호 54의 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 코로나바이러스 RNA가 검출되는 경우, 상기 대상을 코로나바이러스 감염군으로 동정하는 단계를 추가로 포함하는 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 코로나바이러스 RNA가 검출되지 않고, 상기 내부 대조군 RNA가 검출되는 경우, 상기 대상을 코로나바이러스 비감염군으로 동정하는 단계를 추가로 포함하는 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 코로나바이러스 RNA 및 내부 대조군 RNA가 모두 검출되지 않는 경우, 상기 대상으로부터 분리된 새로운 샘플에 대해, (a) 단계 및 (b) 단계를 다시 수행하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스 감염여부의 진단을 위한 정보제공 방법.
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i) 서열번호 1과 서열번호 2; 및 서열번호 9와 서열번호 10으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 RNA-의존 RNA 중합효소 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍;
ii) 서열번호 3과 서열번호 4; 및 서열번호 13과 서열번호 14로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 스파이크 단백질 유전자(Spike protein gene)를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍;
iii) 서열번호 15와 서열번호 16으로 표시되는 서열을 포함하는 피막 단백질 유전자(Envelope protein gene)를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍; 및
iv) 서열번호 7과 서열번호 8로 표시되는 서열을 포함하는 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(Nucleocapsidprotein gene)를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍을 포함하는 SARS-CoV-2 감염여부 진단용 조성물.
제15항에 있어서, 내부 대조군 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 하나 이상의 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 SARS-CoV-2 감염여부 진단용 조성물.
제16항에 있어서, 상기 내부 대조군 유전자는 RNase P 단백질 유전자, GAPDH 유전자, 18S rRNA 유전자, 베타-엑틴(ACTB) 유전자 및 TATA 박스 결합 단백질(TBP) 유전자로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 SARS-CoV-2 감염여부 진단용 조성물.
제17항에 있어서,
상기 RNase P 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍은 서열번호 37과 서열번호 38; 서열번호 39와 서열번호 40; 및 서열번호 41과 서열번호 42로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하고,
상기 GAPDH 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍은 서열번호 43과 서열번호 44의 서열을 포함하며,
상기 18S rRNA 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍은 서열번호 45와 서열번호 46의 서열을 포함하고,
상기 베타-엑틴(ACTB) 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍은 서열번호 47과 서열번호 48; 또는 서열번호 49와 서열번호 50의 서열을 포함하며,
상기 TATA 박스 결합 단백질(TBP) 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍은 서열번호 51과 서열번호 52; 또는 서열번호 53과 서열번호 54의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 SARS-CoV-2 감염여부 진단용 조성물.
제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 진단용 키트.