KR102149373B1 - 리프트밸리열바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

리프트밸리열바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머로 이루어진 리프트밸리열바이러스 검출용 프라이머 세트에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 PCR 수행 시 현재 보고되어 있는 리프트밸리열바이러스를 한 번의 반응으로 검출할 수 있고 민감도가 우수하고 타 균주와의 교차반응 및 간섭물질과의 간섭반응이 없으며 재현성있는 결과를 나타내고 보관 안정성이 우수하므로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 리프트밸리열바이러스를 검출 및 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

리프트밸리열바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set for detecting rift valley virus and uses thereof}
본 발명은 리프트밸리열바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
리프트 밸리열(Rift Valley Fever; RVF)은 버냐바이러스(Bunyaviridae)와 필보바이러스(Phlebovirus)속에 속하며, 세 개의 분절로 이루어진 단일가닥의 선형(-)RNA 바이러스이다. 1900년대 초반 케냐의 가축에서 처음 발견된 이후 감염된 가축을 통하여 많은 사람과 동물에서 발생이 보고되고 있다. 잠복기는 대개 2-6일이며, 일반적으로 발열, 현기증, 극심한 체중감소 등의 경미한 증상을 나타내지만 심한 경우에는 쇼크, 출혈, 안질환, 뇌염으로 인한 두통, 혼수상태 등의 증상을 보이며 사망에 이를 수 있다. 전체 감염자의 1%가 사망하고 출혈열 증상 환자의 경우 치사율이 50%에 달하나 현재까지 특이적 항바이러스제나 예방 백신이 개발되지 않았으며, 발병시 대중 치료만 가능하다. 감염 경로는 감염된 혈액을 가진 모기나 흡혈곤충에게 물리거나 감염된 동물의 혈액이나 체액, 장기에 접촉하는 경우, 감염된 동물의 우유를 가공하지 않고 마실 경우에 감염이 일어날 수 있다. 대부분의 아프리카 지역과 아라비아 반도에서 주로 발생하며, 특히 매개모기 서식지인 서아프리카 지역에서 많이 발생하나, 현재까지 국내에서 발병된 보고는 없다.
이러한 국내에 유입되지 않은 고위험 바이러스가 생물테러로 사용될 경우 진단과 치료에 있어 치명적이며, 확산을 방지하기 어려워 국민보건에 심각한 영향을 끼칠 우려가 있으므로 이에 대한 대응책 마련이 시급하다. 그러나 생물테러 사건현장에서 주로 이용되는 면역크로마토그래피 시험법으로는 검출 가능한 생물작용제가 한정되어 있어 검출 가능한 생물작용제의 확대가 요구되고 있다. 또한 면역크로마토그래피 시험법의 경우, 민감도 개선 필요성이 제기됨에 따라 이를 보완할 수 있는 실시간 유전자중폭장비(real-time PCR)기기에서 운용될 수 있는 현장진단법의 도입이 필요한 실정이다.
현장진단(Point of Care Testing, POCT)은 체외진단 중 하나로, 피검자 및 환자와 가까운 위치에서 원심분리 등 샘플 사전가공을 거치지 않고, 신속하게 시행해 진료 및 치료에 활용할 수 있는 임상병리 검사방식을 말한다. 최근까지는 개인의 자가혈당측정 용도로 많이 사용되어 왔지만 수년 전부터 점차 다양한 질환의 진단 목적으로 사용 및 개발되고 있고, 서유럽에서 다른 진단 제품들이 가지고 있는 비용문제, 규제문제를 해결할 수 있는 분야로 각광받고 있으며, 저비용의 장점으로 개발도상국가에서도 수요가 증가하고 있다.
본 발명의 목적은 리프트밸리열바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 리프트밸리열바이러스 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 리프트밸리열바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머로 이루어진 리프트밸리열바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 리프트밸리열바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 리프트밸리열바이러스 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 리프트밸리열바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 19개의 리프트밸리열바이러스 균주들의 염기서열을 수집하여 디자인한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 PCR 수행 시 현재 보고되어 있는 리프트밸리열바이러스를 한 번의 반응으로 검출할 수 있고 민감도가 우수하고 타 균주와의 교차반응 및 간섭물질과의 간섭반응이 없으며 재현성있는 결과를 나타내고 보관 안정성이 우수하므로, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 리프트밸리열바이러스를 검출 및 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 수집한 19개의 리프트밸리열바이러스 균주의 염기서열을 정렬(alignment)한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시 검출한계를 확인한 결과이다
(Target: 실험예 1-1의 합성된 타겟 RNA 유전자;
IPC: 내부 양성 대조군(internal positive control);
CV: 평균 대비 표준편차의 비율(coefficient of variation)).
도 3은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시 타균주와의 교차반응의 유무를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시 간섭물질과의 간섭반응의 유무를 확인한 결과이다
(녹색: 내부 양성 대조군(ITC); 빨간색: 리프트밸리열 바이러스 시료; 파란선: 음성 대조군).
도 5는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시 재현성을 확인한 결과이다
(녹색: 내부 양성 대조군(ITC); 빨간색: 리프트밸리열 바이러스 시료; 파란선: 음성 대조군).
도 6은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 보관 안정성을 확인한 결과이다
(녹색: 내부 양성 대조군(ITC); 빨간색: 리프트밸리열 바이러스 시료; 파란선: 음성 대조군).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머로 이루어진 리프트밸리열바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 리프트밸리열바이러스의 segment S 영역을 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 상기 segment S 영역의 유전자에 상보적으로 결합 가능한 10 내지 40개, 구체적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 프라이머는 리프트밸리열바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
상기 프라이머 세트는 현장진단(point-of-care testing, POCT)을 위한 것일 수 있다. 상기 프라이머 세트는 현장진단용 기기를 이용하여 황열바이러스를 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있는 현장진단을 위한 프라이머 세트일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머로 이루어진 리프트밸리열바이러스 검출용 프라이머 세트를 포함하는 리프트밸리열바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 리프트밸리열바이러스의 segment S 영역을 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 상기 segment S 영역의 유전자에 상보적으로 결합 가능한 10 내지 40개, 구체적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 프로브를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 또는 RNA 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 프라이머는 리프트밸리열바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein)일 수 있다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 소광자는 BHQ(black hole quencher) 1일 수 있다.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 및 프로브 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 프로브를 제작하여 현재 보고되어 있는 리프트밸리열바이러스를 소형·신속 실시간 유전자 증폭 장치에서 짧은 시간 안에 한 번의 반응으로 리프트밸리열바이러스를 검출할 수 있고, 11.89 copies/reaction의 최소검출한계를 나타내어 민감도가 우수하며, 88개의 타균주와 교차반응이 없고, 검체 내 포함되어 검출 결과에 영향을 미칠 수 있는 간섭물질과의 간섭반응이 없으며, 재현성있는 결과를 나타내고, 365일 동안의 보관 안정성을 나타냄을 확인하였다(도 2 내지 도 6 참조).
따라서, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 리프트밸리열바이러스를 검출 및 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 리프트밸리열바이러스 검출용 키트를 제공한다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머로 이루어진 리프트밸리열바이러스 검출용 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 프로브를 더 포함할 수 있다. 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 또한, 상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자(quencher)가 추가로 더 접합될 수 있다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 리프트밸리열바이러스의 특정 영역에 대한 특이적인 프라이머 세트 이외에도 리프트밸리열바이러스 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), hot-start Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이 때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 리프트밸리열바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 리프트밸리열바이러스의 segment S 영역을 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 상기 segment S 영역의 유전자에 상보적으로 결합 가능한 10 내지 40개, 구체적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 리프트밸리열바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브 제작
리프트밸리열바이러스를 검출할 수 있는 현장 검출용(Point-Of Care-Testing, POCT) 프라이머 및 프로브 세트와 실험실 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 제작하였다.
리프트밸리열바이러스 균주를 탐색한 후 미국국립생물정보센터(NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 19개의 리프트밸리열바이러스 균주들의 염기서열을 수집하였다(표 1). 수집된 염기서열을 이용하여 유전자를 정렬(alignment)하였고, segment S를 표적 유전자로 하여 리프트밸리열바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하였다(도 1 및 표 2). 프로브의 5' 말단에는 리포터 FAM(6-carboxyfluorescein)를 결합시켰으며, 3' 말단에는 소광자 BHQ(black hole quencher) 1를 결합시켰다.
리프트밸리열바이러스 균주
1 H1825RSA75 11 SPU2223KEN07
2 ZH501EGY77 12 SPU2214KEN07
3 ZH548EGY77 13 SPU2215KEN07
4 SPU204ANGL85 14 SPU2220KEN07
5 R1662CAR85 15 SPU10301KEN07
6 SPU45ZAMB85 16 SPU10302KEN07
7 900085MAU88 17 SPU10307KEN07
8 SPU384001KEN97 18 SPU10315KEN07
9 SPU77NAMB04 19 SPU152RSA08
10 SPU2207KEN07
표적
유전자		 프라이머 또는 프로브
 Sequence (5'->3') 길이 GC% Tm 증폭산물크기
segment S 세트 1 정방향
프라이머		 RVFV-S1-F TTCTCATGGCTTATAAAGTTGCTA
(서열번호 1)		 24 33 60 94 bp
역방향
프라이머		 RVFV-S1-R CAAACCTCCGAGGyAGAACA
(서열번호 2)		 20 53 61
프로브 RVFV-S1-P ACTGCTGCATTCATTGGCTGCGT
(서열번호 3)		 23 52 71
<실험예 1> 프라이머 및 프로브 세트의 리프트밸리열바이러스의 검출 능력 평가
<1-1> 검출한계 평가
실시예 1에서 제조한 리프트밸리열바이러스의 현장 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시, 프라이머 및 프로브 세트의 최소검출한계(limit of detection, LoD)를 분석하고자 하였다.
구체적으로, 표 1에 기재된 리프트밸리열바이러스 균주의 공통 영역을 타겟(target)으로 설정한 후, 정제된 DNA를 이용하여 시험관 내 전사(in vitro transcription(T7))를 진행하여 RNA 유전자를 합성하였다. 150, 75, 37.5, 18.75, 9.375 및 4.688 copies/reaction 농도의 리프트밸리열이러스의 합성된 RNA 3 ㎕, 2x 마스터 믹스(Master mix) 5 ㎕, 프라이머 프로브 믹스(primer probe mix) 1 ㎕ 및 PCR이 잘 수행되었는지 확인하는 내부 양성 대조군(Internal positive control) 1 ㎕을 혼합한 후, 하기 표 3과 같은 반응 조건으로 실시간 RT-PCR의 반응을 수행하였다(UltraFast LabChip real-time PCR G2-4). 동일한 조건으로 30회 반복실험을 수행하여 Ct(cycle threshold)값 및 검출률을 측정하였고, 95% 양성구간을 통계프로그램(IBM SPSS Statistics, IBM)을 이용하여 프로빗(probit) 회귀모델로 검증하였다. 최소검출한계는 식품의약품안전처의 <체외진단용 의료기기 허가심사 가이드라인>에서 제시한 정의대로 '표준물질을 이용하여 95% 검출률을 보이는 최저 농도'로 계산하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 합성된 타겟 RNA 유전자(Target으로 표기)의 농도가 높을수록 Ct 값은 낮아졌으며, 리프트밸리열바이러스 segment S를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 세트는 11.89 copies/reaction의 최소검출한계를 나타내, 민감도가 우수함을 알 수 있었다(도 2).
온도 시간 사이클
50℃ 5분 1
95℃ 8초 1
95℃ 13초 44
54℃ 13초
총 소요시간 34분 40초*
(*기계 상에서 결과값을 읽는 시간까지 포함된 총 소요시간)
<1-2> 타균주 유전자와의 교차반응 시험을 통한 특이도 평가
실시예 1에서 제조한 리프트밸리열바이러스의 현장 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시, 프라이머 및 프로브 세트의 특이도를 평가하고자 타균주와의 교차반응 시험을 수행하였다. 리프트밸리열 바이러스는 BL3 항목의 고위험군 물질이므로 국내 반입이 불가능해 불가피하게 제외하였으며, 리프트밸리열 바이러스 대신 합성한 양성 대조군으로 검출여부를 확인하였다.
구체적으로, 총 88개의 균주 유전자(도 3에서 '굵게'로 표시) 및 질병관리본부에서 제공받은 전사체(transcript, 도 3에서 '밑줄'로 표시)를 이용한 교차반응 시험을 수행하였다. 사용한 균주들 중 바이러스는 104 copies/㎕의 농도로 적용하였고, 나머지 균주들은 1 ng/㎕의 농도로 적용하였다. 리프트밸리열바이러스 RNA 대신 동량의 상기 병원체 유전자 및 전사체를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 실시예 1에서 제조한 프라이머 및 프로브 세트는 88개의 타균주와의 교차반응이 나타나지 않았다(도 3).
<1-3> 간섭물질과의 간섭반응 시험을 통한 특이도 평가
실시예 1에서 제조한 리프트밸리열바이러스의 현장 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시, 프라이머 및 프로브 세트의 특이도를 평가하고자 검체 내 포함되어 실험에 영향을 미칠 수 있는 간섭물질과의 간섭반응을 확인하였다.
구체적으로, 간섭물질은 <CLSI 가이드라인>의 'EP7-A2'를 참고하여 헤모글로빈, IgG, 헤파린, EDTA 및 시트르산 나트륨(Na-citrate)으로 선정하였고, 간섭물질을 포함 또는 간섭물질을 포함하지 않은 시료를 이용하여 실험예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였으며, 간섭물질을 포함하지 않은 양성대조군과의 Ct 값 차이(Ct difference)를 산출하였다. 이 때, 리프트밸리열바이러스로부터 합성한 RNA는 최소검출한계(11.89 copies/reaction)의 25배 또는 100배의 농도로 첨가하였으며, 각 간섭물질은 1 mg/㎖의 헤모글로빈(hemoglobin), 12.5 ㎍/㎖의 면역글로불린 G(immunoglobulin G, IgG), 0.1 mg/㎖의 헤파린(heparin), 4 mM의 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 또는 20 mM의 시트르산나트륨(Na-citrate)의 농도로 첨가하였다.
그 결과, 5종의 간섭물질에 따른 Ct 값의 차이는 미미하므로, 실시예 1에서 제조한 프라이머 및 프로브 세트는 간섭물질로 작용하는 헤모글로빈, IgG, 헤파린, EDTA 또는 시트르산 나트륨(Na-citrate)과 간섭반응이 나타나지 않음을 확인하였다(도 4).
<1-4> 재현성 평가
실시예 1에서 제조한 리프트밸리열바이러스의 현장 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시, 프라이머 및 프로브 세트의 재현성을 평가하고자 하였다.
구체적으로, 리프트밸리열바이러스로부터 합성한 RNA를 최소검출한계(11.89 copies/reaction)의 5배, 25배 또는 100배의 농도로 반응시킨 것을 제외하고는 5일 동안 하루에 2회씩 반복하여 실험예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였으며, 측정한 Ct값의 평균, 표준편차 및 CV(coefficient of variation, 평균 대비 표준편차의 비율) 값을 산출하였다. 음성 대조군은 리프트밸리열바이러스의 합성 RNA를 포함하지 않은 시료이다.
그 결과, 10번의 반복실험에 따른 CV 값이 0.02% 이하로 나타나, 실시예 1에서 제조한 프라이머 및 프로브 세트는 재현성있는 결과를 나타냄을 확인하였다(도 5).
<1-5> 보관 안정성 평가
실시예 1에서 제조한 리프트밸리열바이러스의 현장 검출용 프라이머 및 프로브 세트의 보관 안정성을 평가하고자, <식품의약품안전처 고시 제2014-178호>에 제시된 의료기기의 안정성 시험기준에 따른 가속노화실험을 통하여 조사하였다.
구체적으로, 하기 계산식 1을 이용하여 가속노화계수(AAF)를 산출하고, 계산식 2를 이용하여 가속노화시간(AAT)을 산출하였다.
[계산식 1]
AAF = Q10 ｜(TAA-TRT)/10｜
Q10: 온도 10℃ 상승 또는 감소 시 노화계수, 2
TAA: 가속노화온도, 45℃
TRT: 제품 보관온도, -20℃
[계산식 2]
AAT = 설정된 유효기간 / AAF
설정된 유효기간: 365일
AAF: 90.51 (계산식 1로부터 도출된 가속노화계수)
산출된 조건에 따라 4일간 45℃에서 상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 세 가지 농도(최소검출한계 11.89 copies/reaction의 5X, 25X 또는 100X)로 보관하고, 0, 3, 6, 9 또는 12개월째에 상기 실험예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였으며, 0일차의 Ct 값과 비교하여 Ct 값 차이(Ct difference)를 산출하였다. 양성 대조군으로는 리프트밸리열바이러스의 특정 서열로 이루어진 플라스미드 DNA를 이용하였고, 음성 대조군으로는 리프트밸리열바이러스 서열을 갖는 양성 대조군 또는 전사체 RNA가 포함되지 않은 시료를 이용하였다.
그 결과, 실시예 1에서 제조한 프라이머 및 프로브 세트는 ±1 이내의 Ct 값을 나타냈으며, 통상적으로 대조군과의 Ct값 차이가 ±2범위 내에 있는 경우 안정한 것으로 판단하므로, 65일 동안의 보관 안정성을 갖는 것으로 확인되었다(도 6).
<110> Korea Centers for Disease Control and Prevention MICOBIOMED CO., LTD. <120> Primer set for detecting rift valley virus and uses thereof <130> 2018P-07-009 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFV-S1-F <400> 1 ttctcatggc ttataaagtt gcta 24 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFV-S1-R <400> 2 caaacctccg aggyagaaca 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFV-S1-P <400> 3 actgctgcat tcattggctg cgt 23

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3으로 기재되는 프로브로 이루어진 리프트밸리열 바이러스 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단에 리포터가 추가로 접합된 것인, 리프트밸리열 바이러스 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 3' 말단에 소광자가 추가로 접합된 것인, 리프트밸리열 바이러스 검출용 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 리프트밸리열 바이러스 검출용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 리프트밸리열 바이러스 검출용 조성물.
  6. 제1항의 조성물을 포함하는 리프트밸리열 바이러스 검출용 키트.
  7. 1) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계;
    2) 상기 검체로부터 분리한 핵산을 주형으로 제1항의 조성물을 이용하여 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 증폭산물을 형광측정을 통해 검출하는 단계; 를 포함하는 리프트밸리열 바이러스를 검출하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득 되는, 리프트밸리열 바이러스를 검출하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 리프트밸리열 바이러스를 검출하는 방법은 10 내지 20 copies/reaction의 최소검출한계를 나타내는 것인, 리프트밸리열 바이러스를 검출하는 방법.
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