KR102252750B1

KR102252750B1 - 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트와 이의 용도

Info

Publication number: KR102252750B1
Application number: KR1020200118379A
Authority: KR
Inventors: 허민경; 박초희; 조호성; 탁동섭; 오연수
Original assignee: 주식회사 미코바이오메드; 전북대학교산학협력단; 강원대학교산학협력단
Priority date: 2020-09-15
Filing date: 2020-09-15
Publication date: 2021-05-20

Abstract

본 출원은 아프리카돼지열병 바이러스를 진단할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 진단 키트를 제공한다. 본 출원에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 이용하면 저농도의 시료에서도 높은 특이도와 민감도로 아프리카돼지열병 바이러스를 진단할 수 있는 효과가 있다.

Description

아프리카돼지열병 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트와 이의 용도{PRIMER AND PROBE SETS FOR DIAGNOSING AFRICAN SWINE FEVER VIRUS AND USES THEREOF}

본 출원은 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 키트 및 아프리카돼지열병 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.

아프리카돼지열병 바이러스(African swine fever virus, ASFV)는 아스파바이러스과(Asfarviridae)에 속하는 유일한 바이러스로서 170~193kbp의 매우 큰 dsDNA를 genome으로 가지며, 150~167개의 ORF (open reading frame)를 포함하고 있다. 아프리카돼지열병 바이러스 특이 단백질 중에는 캡시드 단백질(capsid protein)인 p72를 암호화한 B646L 구조 단백질 유전자의 C-말단(C-terminal) 지역의 염기 서열 변이에 기초해서, 24개의 유전자형(genotype)으로 분류된다. 24개의 유전자형 모두 사람에게는 감염되지 않으며, 아프리카를 벗어나 전 세계적으로 확산하고 있는 바이러스는 대부분 유전형 II의 고병원성 바이러스이다.

한편, 아프리카돼지열병 바이러스의 임상 증상은 돼지열병(classical swine fever)과 아주 유사하고, 두 질병은 일반적으로 실험실 진단에서 변별되어야 하기 때문에 이에 따라 상기 아프리카돼지열병 바이러스에 대한 감염여부를 확인하기 위한 많은 연구들이 행해져 왔다.

종래의 바이러스 진단법으로는 전자현미경 또는 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 그러나, 전자현미경을 이용한 진단방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태학적 특징으로 종을 진단하는 것은 거의 불가능하다. 현재의 일반화된 방법은 혈청학적 방법을 이용한 검사로, 혈액, 소변, 뇌척수액 또는 양수에서 아프리카돼지열병 바이러스의 유전 물질(DNA)을 검출하거나 아프리카돼지열병 바이러스 감염에 반응하여 생성된 혈중 항체를 검출하는 방법이다. 혈청학적 방법 중 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법은 가장 일반적으로 사용되는 진단방법이나 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 정확한 진단이 실패하는 경우가 자주 발생하는 문제가 있다. 또한, 바이러스를 대량생산 및 정제하여 동 바이러스를 불활화한 다음, 이를 항원으로 사용하여 아프리카돼지열병 바이러스에 대한 항체를 검출해야 하기 때문에 상기 항원을 제조하기 위하여는 몇 주 또는 몇 개월이라는 긴 시간과 많은 비용이 소요되는 문제가 있다.

또한, 혈청학적 방법을 이용한 검사는 돼지에게서 시료를 수득하기 위해 전문가가 전문 장비를 가지고 채취해야 하므로 별도의 시간과 비용이 소요되기 때문에, 돼지 농가에서 쉽게 채취할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있었다.

따라서, 아프리카돼지열병 바이러스를 신속하게 검출하고, 돼지열병 바이러스 외의 다른 바이러스들과의 교차 반응성이 없도록 특이적이며, 고감도를 가지는 진단 방법을 개발할 필요가 있다.

한국등록특허 제10-1452310(2014.11.26. 공고)

본 출원은 상기한 바와 같은 종래 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 돼지 농가에서 쉽게 시료를 수득할 수 있고, 적은 농도의 시료에서도 아프리카돼지열병 바이러스를 민감하고 특이도 있게 진단할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 제공하고자 한다.

또한, 본 출원은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하고, 아프리카돼지열병 바이러스의 캡시드 단백질 중 p72유전자를 특이적으로 증폭하여 진단하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 진단 키트, 상기 조성물을 첨가하여 수행하는 아프리카돼지열병 바이러스 검출 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 출원은, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 첨가하여 수행하고 아프리카돼지열병 바이러스의 감염여부에 관한 정보를 제공하기 위한 실시간 PCR(Real time PCR) 방법을 제공하고자 한다.

상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 하나의 실시예는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브; 를 포함하고, 캡시드 단백질 중 p72유전자를 특이적으로 증폭시키는 것을 특징으로 하는 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브; 를 포함하고, 캡시드 단백질 중 p72유전자를 특이적으로 증폭시키는 것을 특징으로 하는 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 진단에 사용하는 생물학적 시료는 구강 내 유체 샘플(Oral fluid sample)일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 생물학적 시료는, 0.8 Copy number/ul 농도 이상에서 아프리카돼지열병 바이러스의 진단이 가능할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 생물학적 시료는, 0.8~22.2 Copy number/ul 농도에서 아프리카돼지열병 바이러스의 진단이 가능할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 진단은 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR)에 의한 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 조성물은, PCR 프리믹스; 및 내부 양성 대조군(Internal positive control, IPC); 을 더 포함할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예는, 상기 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 아프리카돼지열병 바이러스 진단 키트를 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예는, 생물학적 시료에 포함된 아프리카돼지열병 바이러스 DNA를 85℃ 내지 97℃에서 변성시키는 단계; 및 상기 프라이머 및 프로브 조성물을 첨가하여 상기 DNA를 50℃ 내지 60℃에서 어닐링 및 연장을 수행하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 아프리카돼지열병 바이러스 검출 방법을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예는, 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브; 를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 아프리카돼지열병 바이러스의 감염여부에 관한 정보를 제공하기 위한 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR) 방법을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 생물학적 시료는, 0.8 Copy number/ul 농도 이상의 구강 내 유체 샘플(Oral fluid sample) 일 수 있다.

본 출원의 서열번호 1 내지 3의 프라이머 및 프로브 세트는 아프리카돼지열병 바이러스의 캡시드 단백질 중 p72유전자를 특이적으로 증폭시켜 진단함으로써, 아프리카돼지열병 바이러스의 감염 진단을 보다 더 신속하고, 정확하게 할 수 있다는 장점이 있다.

본 출원의 프라이머 및 프로브 세트는 저농도의 구강 내 유체 샘플(Oral fluid sample)만으로도 바이러스에 대한 고감도성을 띄고, 민감하게 검출이 가능하여 감염 진단이 용이하다는 장점이 있다.

본 출원의 프라이머 및 프로브 세트는 돼지열병 바이러스 이외에도 다른 바이러스들과의 교차 반응성을 일으키지 않고 구별되도록 하여 높은 특이도로 가지며, 신뢰성이 높은 바이러스 감염 진단 방법을 제공할 수 있다는 장점이 있다.

본 출원은 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR)을 통해 실시간 반응의 모니터링을 가능하도록 하며, 매우 정확한 정량화를 통해 각 사이클에서 증폭하는 증폭물의 양을 정확하게 측정할 수 있는 장점이 있다.

도 1(a)는 실시예 1의 Test 1에 대하여, 실시간 중합효소 연쇄반응에 따른 검출값을 나타낸 것이고, 도 1(b)는 실시예 1의 Test 2에 대하여, 실시간 중합효소 연쇄반응에 따른 검출값을 나타낸 것이다.
도 2는 비교예 1의 실시간 중합효소 연쇄반응에 대해 검출값의 평균을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 비교예 2의 실시간 중합효소 연쇄반응에 대해 검출값의 평균을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 비교예 3의 실시간 중합효소 연쇄반응에 대해 검출값의 평균을 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 본 출원을 보다 상세히 설명한다.

이하의 특정한 기능적 설명들은 단지 본 출원의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위하여 예시된 것으로, 본 출원의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 출원의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시예들은 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 출원의 개념에 따른 실시예들을 특정한 개시 형태에 한정하려는 것이 아니며, 본 출원의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 출원을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 출원의 하나의 실시예는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브; 를 포함하고, 캡시드 단백질 중 p72유전자를 특이적으로 증폭시키는 것을 특징으로 하는 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.

상기 프라이머 및 프로브 세트는 아프리카돼지열병 바이러스를 매우 높은 정확도로 진단할 수 있어 신뢰성이 높다는 장점이 있다. 상기 3개의 염기서열 세트가 아닌 다른 세트를 사용할 경우 장기간 많은 수의 대상을 진단하는 임상 사용시 예기치 못한 새로운 아프리카돼지열병 바이러스 변종이 출현하거나, 진단을 수행하는 사람이나 기계의 실수와 같은 미리 예견할 수 없는 변수에 의해 잘못된 음성 반응이 나오는 경우가 생길 가능성이 있다. 상기 3개의 염기서열 세트를 포함함으로써 100% 진단 정확도를 유지할 수 있는 장점이 있다.

또한, 상기 프라이머 및 프로브 세트는 저농도의 샘플에서도 아프리카돼지열병 바이러스를 매우 높은 정확도로 진단할 수 있다는 장점이 있다.

또한, 본 출원의 조성물은 아프리카돼지열병 바이러스 외의 바이러스들과 교차반응이 일어나지 않고, 아프리카돼지열병과 임상증상이 유사한 돼지열병(classical swine fever)의 원인 바이러스에도 교차반응이 일어나지 않아 높은 특이도로 진단이 가능하다는 장점이 있다.

본 출원의 상기 프라이머는 아프리카돼지열병 바이러스의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머 일 수 있고, 더욱 구체적으로는 아프리카돼지열병 바이러스의 캡시드 단백질 중 p72유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다.

또한 상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다. 또한 본 출원의 프라이머는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트phosphorothioate) 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

본 출원에서 용어 “프로브”는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 아프리카돼지열병 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.

또한 본 출원의 프로브 서열은 검출 가능한 시그널을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프로브는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일 클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 특정 아프리카돼지열병 바이러스 프로브는 리포터로서 작용하는 형광 색소로 표지되어 있어도 좋다. 이 프로브는 또한 소광 물질로서 작용하는 제2 색소를 가지고, 5‘말단과 3’말단에 각각 형광물질과 소광제를 포함하며, 복수의 프로브를 포함할 때 각각의 프로브의 5' 말단에 포함된 형광물질이 모두 동일할 수 있다. 이 리포터 색소를 소정의 파장으로 측정하여 이것에 의해 증폭한 아프리카돼지열병 바이러스 표적 검출과 식별을 한다. 완전한 상태의 프로브 형광 신호는 소광 물질 색소에 의해 억제되어 있다.

또한, 1종 이상의 추가 프로브, 예를 들면 내부 기준 대조 또는 다른 표적 프로브이거나 다른 바이러스 핵산을 아프리카돼지열병 바이러스 프로브와 관련된 형광 색소 표지와는 다른 고유한 리포터 형광 색소로 표지 할 수 있다. 이러한 경우, 특정 리포터 색소를 소정의 파장으로 측정하므로, 증폭한 아프리카돼지열병 바이러스 표적과 상기 1종 이상의 추가 프로브의 동시 검출 및 식별이 가능하다.

상기 형광물질은 6-FAM(6-carboxyfluorescein), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texas red), Cy3(Cyanine-3) 및 Cy5(Cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 소광제는 BHQ1(Black hole quencher 1), BHQ2(Black hole quencher 2), BHQ3(Black hole quencher 3), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ (Nonfluorescent quencher), 답실(Dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 출원에서 용어 “생물학적 시료”는 검출 대상체로 샘플 또는 검체와 동일한 의미로 사용되었으며, 구강 내 유체 샘플(Oral fluid sample), 전혈, 혈장, 혈소판, 혈청, 복수액, 골수액, 림프액,　 누액, 점막액, 양수, 뇨, 조직, 세포 또는 이들의 조합일 수 있다.

구강 내 유체 샘플을 사용하는 경우 전혈 등의 다른 시료를 사용할 때보다 신속하고 용이하게 채취할 수 있고, 전문가의 도움 없이도 돼지 농가에서 쉽게 채취할 수 있다는 장점이 있다. 구강 내 샘플이 아닌 다른 시료를 채취하는 경우 전문가가 전문 도구를 활용하여 채취해야 하므로 별도의 시간과 비용이 소요되기 때문에, 구강 내 샘플 채취보다 어려움이 있다.

상기 구강 내 유체 샘플(Oral fluid sample)은, 구체적으로 타액(saliva), 구강 내 점막액, 구강 인두(oral pharynx) 점막액 또는 가래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 구강 내 유체 샘플은 배출된 가래, 면봉으로 입을 문질러서 채취하거나, 수동적으로 흘리는 침에서 채취하거나 또는 당해 분야에 공지된 다른 방법에 의해 수집될 수 있다.

아프리카돼지열병 바이러스는 돼지가 죽은 후에도 혈액과 조직에 바이러스가 존속할 수 있기 때문에 만일 정상적인 돼지가 감염동물의 조직을 포함하고 있는 열처리하지 않은 잔반을 먹을 경우 바이러스가 더욱 신속하게 전파될 수 있다. 그렇기 때문에, 음식물이 식도로 내려가는 중간 통로인 구강 인두 점막액이나 타액에서 시료를 채취하여 본원발명의 조성물로 바이러스를 진단하면 보다 신속하고, 정확한 진단이 가능하다는 장점이 있다.

또한, 본 출원에서 용어 “생물학”은 아프리카돼지열병 바이러스에 감염 가능성이 있는 돼지아목(Suina)에 속하는 모든 동물을 제한 없이 포함하며, 예를 들어, 바비루사속(Babyrousa), 숲멧돼지속(Hylochoerus), 혹멧돼지속(Phacochoerus), 아기멧돼지속(Porcula), 강멧돼지속(Potamochoerus), 멧돼지속(Sus)일 수 있다.

본 출원의 프라이머 및 프로브 세트는 고농도의 시료에서는 당연히 아프리카돼지열병 바이러스를 진단할 수 있고, 저농도의 시료에서도 아프리카돼지열병 바이러스를 진단할 수 있다는 장점이 있다. 구체적으로 0.8 Copy number/ul 농도 이상에서 아프리카돼지열병 바이러스를 진단할 수 있다.

본 출원의 프라이머 및 프로브 세트는 0.8 Copy number/ul 이상의 저농도에서 검출율이 90~100%이므로 매우 저농도에서도 민감하게 검출이 가능하여 감염 진단이 용이하다는 장점이 있다.

더 구체적으로, 0.8 Copy number/ul 이상 22.2 Copy number/ul 이하의 저농도에서 검출이 가능하고, 더욱 더 구체적으로, 0.8 Copy number/ul 이상 7.4 Copy number/ul 이하의 저농도에서 검출이 가능하며, 더욱 더 구체적으로, 0.8 Copy number/ul 이상 2.5 Copy number/ul 이하의 매우 저농도에서도 검출이 가능하다.

각 타겟의 민감도를 probit 분석으로 확인할 때 상기 조성물의 검출한계는 상기 범위에서 검출율이 90%~100%일 수 있다.

본 출원에서 용어 “검출한계(Lod)”는 분석과정을 실시한 후 분석대상물질의 유무를 확인할 수 있는 최소 검출 농도이며, 상기 범위에서 검출함으로써 본 출원의 조성물을 이용하여 높은 민감도로 아프리카돼지열병 바이러스를 검출할 수 있다.

본 출원에서의 검출한계는 0.8 Copy number/ul일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예서, 상기 진단은 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR)에 의한 것일 수 있다.

상기 PCR은 통상적인 PCR 반응을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 가장 일반적인 컨벤셔널(Conventional) PCR, 두 번의 PCR을 동시에 또는 연속해서 수행하는 듀플렉스(duplex) PCR 및 네스티드(nested) PCR, 실시간으로 결과를 확인할 수 있는 실시간(Real time) PCR을 모두 이용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 컨벤셔널 PCR 또는 리얼타임 PCR을 이용할 수 있다.

본 출원에서 용어 “실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-time Polymerase chain reaction, Real-time PCR)"이란 중합효소 연쇄 반응을 기반으로 하여 실시간으로 DNA를 증폭시키고, 증폭된 양의 측정을 동시에 하는 방법이다.

상기 실시간 중합효소 연쇄반응은 PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 확인할 수 있기 때문에 추가적인 전기 영동 분석방법을 이용하지 않아도 되며, 앤드 포인트(End point)에서 PCR 증폭산물을 확인하는 기존의 PCR 법에 비해서 신속하고 간편하게 PCR을 해석할 수 있으며 오염의 위험성이 적다. 또한, 실시간 중합효소 연쇄 반응 증폭산물의 검출방법은 타켓 서열(target sequence)에 특이적이며 형광 염료(dye)가 결합된 프로브(Probe)를 이용하며, 검출 특이성이 높아 비슷한 서열까지도 구별하여 검출할 수 있다는 장점이 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 조성물은 PCR 프리믹스; 프라이머 및 프로브 세트; 및 내부 양성 대조군(Internal positive control, IPC); 을 포함하는 것일 수 있다.

본 출원에서 용어 “PCR 프리믹스”는 PCR 반응 전에 미리 제조된 반응 혼합물로서 여기에 분석하고자 하는 DNA 샘플을 넣고 바로 PCR 반응시킬 수 있는 즉시 사용 가능한 시약(Ready-to-use Reagents)을 의미한다.

상기 PCR 프리믹스는 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 혼합물, 염화마그네슘(MgCl2), DNA 중합효소 또는 완충액(buffer solution)을 더 포함하는 마스터 믹스(Master Mix)를 사용할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예는 상기 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 조성물을 포함하는, 아프리카돼지열병 바이러스 진단 키트를 제공한다.

상기 진단 키트는 특정한 형태로 한정되는 것은 아니며, 다양한 형태로 구현될 수 있다. 하나의 실시예에서, 진단 키트는 일회용 PCR 튜브와 같은 용기에 담겨서 동결건조된 (lyophilized) 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1 내지 3의 프라이머와 프로브 세트를 이용한 조성물이 동결건조분말 형태로 담겨있는 일회용 PCR 튜브가 키트에 포함될 수 있다.

상기 진단 키트에는 상기 프라이머 및 프로브, 중합효소 및 버퍼 등을 포함하는 반응 혼합물이 액체 형태로 PCR 튜브와 같은 용기에 담겨있을 수 있다. 이를 냉동 보관하였다가 필요시 해동하여 사용할 수 있다. 상기 진단 키트는 검체를 추가하는 것 외에 별도의 과정이 필요하지 않으므로 검출의 편의성 및 속성이 증대되는 장점이 있다.

본 출원의 하나의 실시예는 생물학적 시료에 포함된 아프리카돼지열병 바이러스 DNA를 85℃ 내지 97℃에서 변성시키는 단계; 및 상기 조성물을 첨가하여 상기 DNA를 50℃ 내지 60℃에서 어닐링(annealing) 및 연장을 수행하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 아프리카돼지열병 바이러스 검출 방법을 제공한다.

상기 어닐링을 수행하는 단계에서 60℃보다 높으면 프라이머가 어닐링 되지 않아 PCR 산물이 생기지 않게 되고, 50℃보다 낮으면 비특이적인 어닐링이 일어나 정확한 PCR 산물이 생기지 않을 수 있다.

또한, 상기 생물학적 시료는 본 출원의 아프리카돼지열병 바이러스 진단 키트의 샘플 패드에 점적하기 전에 희석하여 사용하거나 또는 희석하지 않고 사용할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예는 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브; 를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 아프리카돼지열병 바이러스의 감염여부에 관한 정보를 제공하기 위한 Real time PCR 방법을 제공한다.

상기 PCR 방법을 사용함으로써, 바이러스의 감염여부에 관한 정보를 신속하게 제공하여 대응할 수 있다는 장점이 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 시료는, 구강 내 유체 샘플(Oral fluid sample)일 수 있다. 예를 들어, 상기 시료는 구강 내 유체 샘플은 구강 내에 포함되는 조직의 다양한 부분일 수 있고, 예를들어, 타액(saliva), 구강 내 점막액 또는 구인두(oral pharynx) 점막액 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 구강 내 유체 샘플을 시료로 채취하여 진단하게 되면 전혈을 이용한 진단보다 신속할 수 있고, 전문인력이 필요 없기 때문에 현장에서 즉시 진단을 할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 아프리카돼지열병은 돼지열병 바이러스와 같이 공기를 통한 호흡기 전파가 이루어지는 것이 아니라 접촉에 의한 감염이 이루어지는 특성상, 일부 돼지를 선별하여 무작위 검사시에 위음성 판정이 나오는 것을 예방하여 신뢰도 높은 진단결과를 제공할 수 있다는 장점이 있다.

이하, 제조예, 실시예, 비교예 및 실험예들을 통하여 본 출원을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이 실시예들은 오로지 본 출원을 예시하기 위한 것으로서, 본 출원의 범위가 이 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<제조예 1> 타겟 유전자 선정 및 프라이머 및 프로브 제작

아프리카돼지열병 바이러스를 진단할 수 있는 프라이머와 프로브를 제작하였고, 각 서열은 하기 표 1과 같다. 하기 표 1과 같은 아프리카돼지열병 바이러스를 진단할 수 있는 프라이머를 선정하기 위해 다수의 프라이머 서열을 대상으로 실험적으로 성능을 평가한 후, 현저한 효과를 가지는 성능을 보이는 프라이머 서열들을 선택하였다.

하기 표 1의 프라이머와 프로브 서열은 동일한 조건에서 단시간 내에 p72유전자를 특이적으로 증폭시켜 진단이 가능하여 정확하고, 높은 특이도와 고감도로 다른 바이러스와의 교차 반응성을 일으키지 않았다. 또한, 상기 프라이머와 브로브 서열은 시료 내 포함되어 검출 결과에 영향을 미칠 수 있는 간섭물질과의 간섭반응이 없었고, 재현성 있는 결과를 나타내었으며, 365일 동안의 보관 안정성을 보였다. 프로브의 5’ 말단에는 리포터 FAM을 결합시켰으며, 3’ 말단에는 소광자 TAMRA를 결합시켰다.

병원체 이름	표적 유전자	프라이머 및 프로브 명칭	염기서열 (5' - 3')	길이 (bp)
아프리카 돼지열병 바이러스	P72 (1SET) 실시예 1	Forward primer	GCGATGATGATTACCTTTGCTTT (서열번호 1)	23
		Reverse primer	CTAATATAAAATTCTCTTGCTCTGGATAC (서열번호 2)	29
		Probe	CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG (서열번호 3)	25
	P72 (2SET) 비교예 1	Forward primer	TGCTCATGGTATCAATCTTATCG (서열번호 4)	23
		Reverse primer	CCACTGGGTTGGTATTCCTC (서열번호 5)	20
		Probe	TTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTT (서열번호 6)	24
	P72 (3SET) 비교예 2	Forward primer	GATGATGATTACCTTYGCTTTGAA (서열번호 7)	24
		Reverse primer	CTTGCTCTRGATACRTTAATATGA (서열번호 8)	24
		Probe	CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG (서열번호 9)	25
	P72 (4SET) 비교예 3	Forward primer	GATCCGGGTGCGATGATGATTA (서열번호 10)	22
		Reverse primer	CTAATATAAAATTCTCTTGCTCTGGA (서열번호 11)	26
		Probe	CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG (서열번호 12)	25
	P72 (5SET) 비교예 4	Forward primer	CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA (서열번호 13)	25
		Reverse primer	GATACCACAAGATCRGCCGT (서열번호 14)	20
		Probe	CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG (서열번호 15)	25

< 실험예 1> 실시간 중합효소 연쇄반응의 민감도 평가

제조예 1에서 제작한 실시예와 비교예 1 내지 3의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 조성물의 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)의 분석적 민감도를 평가하기 위해 아프리카돼지열병 바이러스의 DNA를 이용하여 최소 검출한계(limit of detection, LoD)를 확인하였다. 실험은 “농림축산검역본부”의 '동물용 체외진단시약의 성능 및 안정성시험 가이드라인'에 따라 수행하였고, 최소 검출한계는 가이드라인의 정의대로 표준물질을 이용하여 95% 검출률을 보이는 최저 농도로 계산하였다.

구체적으로, 3ul의 생물학적 시료인 돼지 타액을 2x 마스터 믹스(Master mix) 2ul, 프라이머 및 프로브 세트 1ul 및 PCR이 잘 수행되었는지 확인하는 내부 양성 대조군(Internal positive control) 1 ul와 혼합(표 2)한 후, 하기 표 3에 기재된 반응 조건으로 본 출원의 PCR 장치를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 수행하였다. 동일한 조건으로 반복실험을 수행하여 측정한 Ct(cycle threshold)값의 평균(average), 표준편차(standard deviation, SD), 변동계수(coefficient of variation, CV), 및 검출률을 측정하였고, 95% 양성구간을 통계프로그램(IBM SPSS Statistics, IBM)을 이용하여 프로빗(probit) 회귀모델로 검증하였다.

상기 조성물은 아프리카돼지열병 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 표 1의 프라이머 및 프로브 세트가 포함된 조성물을 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. PCR 반응 혼합물의 조성은 표 2에 나타낸 바와 같았다. PCR 조건은 표 3에 나타난 바와 같이 95℃에서 8초 동안 예비 변성단계 1 사이클을 수행하고, 95℃에서 9초 동안 변성단계, 56℃에서 13초 동안 어닐링 및 연장단계로 구성된 PCR 주기를 45 사이클을 수행하였다. 반응시간은 총 35분 이내로 매우 짧은 시간 내에 수행하였다.

아프리카돼지열병 바이러스 진단용 시약 조성	1 reaction 당 용량
PCR 프리믹스-1 (2X Master mix)	5 μl
아프리카돼지열병 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트	1 μl
IPC (Internal positive control) DNA	1 μl
생물학적 시료	3 μl
전체 용량	10 μl

Real time PCR 반응 단계	온도	시간	사이클 수
Pre-denaturation	95 ℃	8초	1
Denaturation	95 ℃	9초	45
Annealing and extension	56 ℃	13초	45
총 반응 시간	약 35분 이내

본 출원의 프라이머 및 프로브 세트가 포함된 조성물이 나타내는 아프리카돼지열병 바이러스의 DNA에 대한 PCR 스크리닝 효율을 하기 표 4에 나타내었다.

도 1(a)는 실시예 1의 Test 1의 검출값을 나타낸 것이고, 도 1(b)는 실시예 1의 Test 2의 검출값을 나타나낸 것이다. 여기서 검출값은 Ct(cycle threshold) 값이고, PCR 산물의 형광신호가 background signal이상이 될 때의 cycle number를 말할 수 있다.

Copies/ul		200.0	66.7	22.2	7.4	2.5	0.8
Set 1 (실시예 1)	Test 1	28.00	29.73	31.19	32.38	33.61	36.77
	Test 2	27.82	29.34	30.77	32.58	36.01	35.55
	Average	27.91	29.54	30.98	32.48	34.81	36.16
Set 2 (비교예 1)	Test 1	35.02	37.27	N/A	39.27	39.42	N/A
	Test 2	35.37	37.97	39.14	39.26	N/A	N/A
	Average	35.20	37.62	39.14	39.27	39.42	0
Set 3 (비교예 2)	Test 1	35.56	37.49	38.16	37.30	N/A	N/A
	Test 2	36.15	38.44	N/A	N/A	N/A	N/A
	Average	35.86	37.97	38.16	37.30	0	0
Set 4 (비교예 3)	Test 1	34.62	35.09	37.72	N/A	N/A	N/A
	Test 2	34.51	37.79	37.11	N/A	N/A	N/A
	Average	34.57	36.44	37.42	0	0	0

그 결과, 실시예 1의 조성물은 0.8 Copy number/ul 농도일 경우, 100%의 검출율로 아프리카돼지열병 바이러스가 검출될 수 있으나, 비교예 1 내지 3의 조성물은 아프리카돼지열병 바이러스가 검출되지 않았으므로 실시예 1의 Set 1이 더 높은 반응성 및 민감성을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 실시예 1의 조성물은 2.5 Copy number/ul 농도일 경우, 100%의 검출율로 아프리카돼지열병 바이러스가 검출될 수 있으나, 비교예 1의 Set 2는 50%의 검출율로 바이러스가 검출되고, 비교예 2 내지 3은 검출되지 않았으므로 실시예 1의 Set 1이 더 높은 반응성 및 민감성을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

그리고, 실시예 1의 조성물은 7.4 Copy number/ul 농도일 경우, 100%의 검출율로 아프리카돼지열병 바이러스가 검출될 수 있으나, 비교예 2의 Set 3는 50%의 검출율로 바이러스가 검출되고, 비교예 3의 Set 4는 검출되지 않았으므로 실시예 1의 Set 1이 더 높은 반응성 및 민감성을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

본 출원의 조성물은 타액 샘플을 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR)을 거쳐 분석한 검출율을 하기 표 5에 나타내었다. 타액 샘플에서 0.8 Copy number/ul 이상의 농도일 때 100%이어서 검출한계가 0.8 Copy number/ul임을 확인할 수 있었다.

또한, 이를 통해 본 출원의 조성물은 타액 샘플이 최소 0.8 copies/ul의 DNA를 포함하고 있으면 아프리카돼지열병 바이러스의 진단이 가능하고, 매우 저농도의 환경에서도 손쉽게 바이러스의 진단이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 비교예 1 내지 3의 경우 저농도의 타액 샘플에서 아프리카돼지열병 바이러스의 진단이 어려운 것을 확인할 수 있다.

상기 표 4의 반복된 실시간 중합효소 연쇄반응 실험을 통하여 도출된 결과는 표 5에 나타내었다.

Copies/ul	200.0	66.7	22.2	7.4	2.5	0.8
Set 1 (실시예 1)	100%	100%	100%	100%	100%	100%
Set 2 (비교예 1)	100%	100%	50%	100%	50%	0%
Set 3 ( 비교예 2)	100%	100%	50%	50%	0%	0%
Set 4 ( 비교예 3)	100%	100%	100%	0%	0%	0%

도 2는 비교예 1의 실시간 중합효소 연쇄반응에 대해 검출값의 평균을 그래프로 나타낸 것이다. 또한, 도 3은 비교예 2의 실시간 중합효소 연쇄반응에 대해 검출값의 평균을 그래프로 나타낸 것이고, 도 4는 비교예 3의 실시간 중합효소 연쇄반응에 대해 검출값의 평균을 그래프로 나타낸 것이다.

도 1(a) 및 도 1(b)를 도 2, 도 3 및 도 4와 비교해 보면, 도 1(a) 및 도 1(b)는 PCR 산물의 형광신호가 백그라운드 신호(background signal)이상이 되어 증식기(exponential phase) 지점인 Ct(Cycle Threshold) 값이 현저하게 낮은 위치에서 시작한다는 것을 확인할 수 있다. 이 점을 통해 본 출원의 일 실시예는 비교예와 비교하여, 저농도의 샘플에서도 높은 민감도로 바이러스의 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있다.

또한, 제조예 1에서 제작한 실시예와 비교예 4의 프라이머 및 프로브 세트는 OIE 가이드라인에 따라 표 6의 조성에 따라 표 7의 조건으로 Real-time PCR을 수행하였다. 돼지의 타액 샘플을 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR)을 거쳐 분석한 검출율을 하기 표 8에 나타내었다. OIE 가이드라인에 따른 비교예 4의 프라이머 및 프로브 세트는 10³copy/ul의 농도 이상에서 검출율이 100%이고 10²copy/ul의 농도 이하에서 검출율이 50%이어서, 저농도의 구강액 샘플에서는 민감도가 좋지 않음을 확인할 수 있었다.

아프리카돼지열병 바이러스 진단용 시약 조성	1 reaction 당 용량
Biorad iQ supermix(2x)	12.5 μl
DW (Nuclease free water)	6.5 μl
Forward primer (50pM)	1 μl
Reverse primer (50pM)	1 μl
Probe (5pM)	1 μl
생물학적 시료	3 μl
전체 용량	25 μl

Real time PCR 반응 단계	온도	시간	사이클 수
Polymerase activation	50 ℃	2 min	1
DNA denaturation	95 ℃	10 min	1
amplification	95 ℃	15초	45
annealing	58 ℃	30초	45
총 반응 시간	약 1시간 이상

Sample copy/ul	Ct1	Ct2	Ct3	Ct4	검출율
10⁶	검출	검출	검출	검출	100%
10⁵	검출	검출	검출	검출	100%
10⁴	검출	검출	검출	검출	100%
10³	검출	검출	검출	검출	100%
10²	검출	불검출	검출	불검출	50%
10¹	불검출	검출	검출	불검출	50%

< 실험예 2> 실시간 중합효소 연쇄반응의 분석적 특이도 평가

제조예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응의 분석적 특이도를 분석하고 다른 균주에 의한 교차반응 여부를 확인하였다.

시험 결과, 아프리카돼지열병 바이러스를 제외한 다른 모든 병원체에서 반응을 나타내지 않아 실시예 1의 프라이머 및 프로브 세트가 아프리카돼지열병 바이러스의 유전자만을 특이적으로 증폭시키는 것으로 확인하였다. 교차반응 평가에 이용한 병원체 목록 및 교차반응 Ct값 결과를 표 9에 나타내었다. 아프리카돼지열병 바이러스의 경우 시험방법에 대한 교차반응 평가 결과, 아프리카돼지열병 바이러스의 핵산에서만 반응을 확인하여 본 시험방법의 특이성을 확인하였다. 또한, 본 출원의 실시예 1은 아프리카돼지열병 바이러스 외의 바이러스들과 교차반응이 일어나지 않고, 아프리카돼지열병 바이러스와 증상이 매우 비슷한 돼지열병 바이러스(classical swine fever)에도 교차반응이 일어나지 않아 높은 특이도로 진단이 가능하다는 장점이 있다.

No.	균주	Test1	Test2	Test3
1	Positive control for African swine fever virus	21.7	21.75	21.89
2	Negative control	N/D	N/D	N/D
3	Porcine whole blood	N/D	N/D	N/D
4	Classical Swine fever virus	N/D	N/D	N/D
5	Porcine reproductive and respiratory syndrome virus	N/D	N/D	N/D
6	Aujeszky’s disease virus	N/D	N/D	N/D
7	Porcine circovirus 2	N/D	N/D	N/D
8	Porcine parvovirus	N/D	N/D	N/D
9	Plasmodium falciparum	N/D	N/D	N/D
10	Mycoplasma pneumoniae	N/D	N/D	N/D
11	Pseudomonas aeruginosa	N/D	N/D	N/D
12	Chlamydophila pneumoniae	N/D	N/D	N/D
13	Legionella pneumophila	N/D	N/D	N/D
14	Escherichia coli	N/D	N/D	N/D
15	Human whole blood	N/D	N/D	N/D
16	Metapneumovirus	N/D	N/D	N/D
17	Parainfluenza 1	N/D	N/D	N/D
18	Parainfluenza 2	N/D	N/D	N/D
19	Parainfluenza 3	N/D	N/D	N/D
20	Parainfluenza 4	N/D	N/D	N/D
21	Zika virus	N/D	N/D	N/D
22	Dengue virus serotype 1	N/D	N/D	N/D
23	Dengue virus serotype 2	N/D	N/D	N/D
24	Dengue virus serotype 3	N/D	N/D	N/D
25	Dengue virus serotype 4	N/D	N/D	N/D
26	Japanese encephalitis virus	N/D	N/D	N/D
27	Respiratory syncytial virus A	N/D	N/D	N/D
28	Adenovirus type B	N/D	N/D	N/D
29	Rhinovirus	N/D	N/D	N/D
30	Coronavirus HKU-1	N/D	N/D	N/D
31	Coronavirus OC43	N/D	N/D	N/D
32	Coronavirus 229E	N/D	N/D	N/D
33	Coronavirus NL63	N/D	N/D	N/D
34	Influenza A virus subtype H1	N/D	N/D	N/D
35	Influenza A virus subtype H3	N/D	N/D	N/D
36	Influenza A virus subtype H5	N/D	N/D	N/D
37	Influenza A virus subtype H7	N/D	N/D	N/D
38	Influenza B virus	N/D	N/D	N/D

이상으로 본 출원의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 출원의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 출원의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가들에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> MiCo BioMed Co., Ltd. <120> PRIMER AND PROBE SETS FOR DIAGNOSING AFRICAN SWINE FEVER VIRUS AND USES THEREOF <130> 20P0101 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 gcgatgatga ttacctttgc ttt 23 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 ctaatataaa attctcttgc tctggatac 29 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 ccacgggagg aataccaacc cagtg 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 4 tgctcatggt atcaatctta tcg 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 5 ccactgggtt ggtattcctc 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 ttccatcaaa gttctgcagc tctt 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 gatgatgatt accttygctt tgaa 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 cttgctctrg atacrttaat atga 24 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 ccacgggagg aataccaacc cagtg 25 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 10 gatccgggtg cgatgatgat ta 22 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 11 ctaatataaa attctcttgc tctgga 26 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 ccacgggagg aataccaacc cagtg 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 13 ctgctcatgg tatcaatctt atcga 25 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 14 gataccacaa gatcrgccgt 20 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 15 ccacgggagg aataccaacc cagtg 25

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머;
서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머; 및
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브; 를 포함하고,
캡시드 단백질 중 p72유전자를 특이적으로 증폭시키며,
저농도에서 검출되는 것을 특징으로 하는 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 진단에 사용하는 생물학적 시료는 구강 내 유체 샘플(Oral fluid sample)인 것을 특징으로 하는 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 진단은 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR)에 의한 것인 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 조성물은,
PCR 프리믹스; 및
내부 양성 대조군(Internal positive control, IPC); 을
더 포함하는 것을 특징으로 하는 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 조성물.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 아프리카돼지열병 바이러스 진단 키트.
생물학적 시료에 포함된 아프리카돼지열병 바이러스 DNA를 85℃ 내지 97℃에서 변성시키는 단계; 및
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항의 조성물을 첨가하여 상기 DNA를 50℃ 내지 60℃에서 어닐링 및 연장을 수행하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 아프리카돼지열병 바이러스 검출 방법.
생물학적 시료로부터
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머;
서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머; 및
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브; 를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR)을 수행하는 단계를 포함하고,
저농도에서 검출되는 아프리카돼지열병 바이러스의 감염여부에 관한 정보를 제공하기 위한 실시간 중합효소 연쇄반응(Real time PCR) 방법.