KR20220024254A - 신종 코로나바이러스 검출용 고감도 다중 루프매개등온증폭 프라이머 세트 - Google Patents

신종 코로나바이러스 검출용 고감도 다중 루프매개등온증폭 프라이머 세트 Download PDF

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장웅식
임민섭
임다혜
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Abstract

본 발명은 신종 코로나바이러스 감별하여 검출할 수 있는 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 등에 관한 것으로서, 본 발명의 의해 무겁고 복잡한 PCR 기기 없이도 빠르고 정확하게 COVID19를 검출할 수 있고 이를 감별하여 진단할 수 있는바 본 발명은 기존의 신종 코로나바이러스 검출법을 대체하는 분자진단 검사법으로 이용될 것으로 기대된다.

Description

신종 코로나바이러스 검출용 고감도 다중 루프매개등온증폭 프라이머 세트{High sensitive multiplex loop-mediated isothermal amplification primer set for detection of novel coronavirus-19}
본 발명은 2019 신종 코로나바이러스(coronavirus disease-19: COVID-19)에 감염된 환자를 신속하고 정확하게 진단하기 위한 방법으로 인후도말 RNA 샘플로부터 코로나19 바이러스의 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있는 루프매개등온증폭 프라이머와 프로브에 관한 것이다.
2019 년 12 월, 무한의 도매 시장과 역학적으로 연결된 비정형 폐렴 환자 집단이 발견되었고, 이들 중에서 2019-novel coronavirus (2019-nCoV)로 명명된 새로운 베타-코로나 바이러스의 감염이 일부 확인되었다. 이 바이러스는 Sarbecovirus 속의 박쥐 바이러스와 유전적으로 유사하며 2020년 2월 13일 전세계적으로 46997명이 감염환자로 확인되었고, 중국에서는 46550명 감염환자중에서 1368명이 사망한 것으로 보고되었다. 중국 이외에 한국, 일본, 싱가폴, 스페인, 미국, 독일, 배트남, 프랑스 말레이시아 등의 나라에서도 감염이 확인되어 사람간 감염 및 다중 감염이 발생하고 있는 상황이지만 인간 사이에서 이 질병의 스펙트럼은 아직 완전히 결정되지 않았다. 2019-nCoV의 감염 징후는 비특이적이며 호흡기 증상, 열, 기침, 호흡 곤란 및 바이러스 성 폐렴 증상을 나타낸다. 2019-novel coronavirus의 감염 확산을 막고, 환자를 치료하려면 빠른 2019-novel coronavirus 진단 검사가 절실히 필요하다. 신종 코로나바이러스현재 바이러스의 진단은 WHO 분자진단 검사법으로서 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 이용하여 2019-nCoV를 진단하는 방법이 제공되고 있는 상황이나 실시간 PCR법은 숙련된 검사자 및 고급 실험실 기반을 필요로하며 검사결과 확인까지 2시간 정도의 시간이 소요되어 현장에서 빠르게 진단까지 어려움이 있다.
최근, 온도 변화 없이 일정한 온도에서 유전자를 증폭하는 등온 증폭 반응법(loop-mediated isothermal amplification reaction, LAMP)이 개발되었다. LAMP법은 주형에 상보적인 프라이머 6개를 사용하여 각기 다른 8개의 부위를 인식하여 유전자 증폭을 진행한다. 기존의 PCR법과 비교하였을 때, 온도의 변화 없이 증폭할 수 있다는 점에서 검사 시간을 단축할 수 있고, 온도 변화를 위한 값비싼 장비 없이 검사를 진행할 수 있다
이에, 본 발명자들은 LAMP법을 이용하여 숙련된 검사자 및 값비싼 장비 없이도 2019-nCoV의 빠른 진단을 위하여 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.
Yu GY, Lou Z, Zhang W. [Several suggestion of operation for colorectal cancer under the outbreak of Corona Virus Disease 19 in China]. Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi. 2020 Feb 19;23(3):9-11
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 신종 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 키트를 제공하고, 이를 이용하여 신종 코로나바이러스를 빠르고 정확하게 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 프라이머를 포함하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 신종 코로나바이러스의 RdRP 유전자를 타겟으로 하며, 프로브(probe)와 퀀쳐(quencher)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 7의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 형광물질이 부착된 것일 수 있고, 상기 퀀쳐는 서열번호 8의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 9 내지 13의 프라이머를 포함하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 신종 코로나바이러스의 E 유전자를 타겟으로 하며, 프로브와 퀀쳐를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 14의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 형광물질이 부착된 것일 수 있고, 상기 퀀쳐는 서열번호 15의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 16 내지 21의 프라이머를 포함하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 신종 코로나바이러스의 N 유전자를 타겟으로 하며, 프로브와 퀀쳐를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 22의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 형광물질이 부착된 것일 수 있고, 상기 퀀쳐는 서열번호 23의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 24 내지 29의 프라이머를 포함하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 신종 코로나바이러스의 Spike (S) 유전자를 타겟으로 하며, 프로브와 퀀쳐를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 30의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 형광물질이 부착된 것일 수 있고, 상기 퀀쳐는 서열번호 31의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 각 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 허위음성 결과를 배재하기 위하여 actin beta 유전자를 타겟하는 내부대조군(internal control) 서열번호 32 -37의 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트, 서열번호 9 내지 13의 프라이머 세트, 서열번호 16 내지 21, 및 서열번호 24 내지 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 신종 코로나바이러스 검출용 다중 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트 중 1종의 프라이머 세트 또는 상기 신종 코로나바이러스 검출용 다중 LAMP 프라이머 세트를 포함하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 키트에 신종 코로나바이러스 검출용 다중 LAMP 프라이머 세트가 포함된 경우, 상기 프라이머 세트는 상기 서열번호 7; 서열번호 14; 서열번호 22; 및/또는 서열번호 30의 프로브를 포함할 수 있고, 상기 프로브는 형광물질로 표지된 것일 수 있으며, 상기 프로브는 서로 다른 파장을 발하는 형광물질로 표지된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서 상기 프로브는 각각 독립적으로 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시약에는 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 생물학적 시료의 게놈 DNA(gDNA)를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 gDNA를 주형으로 하고 상술한 LAMP 프라이머 세트 또는 다중 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 신종 코로나바이러스 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 생물학적 시료의 게놈 DNA(gDNA)를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 gDNA를 주형으로 하고 상술한 LAMP 프라이머 세트 또는 다중 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 신종 코로나바이러스 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 생물학적 시료는 객담(sputum), 기관지 흡인(bronchial aspiration) 및 기관지세척액(bronchial washing), 및 인후 도말(throat swab)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (3) 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 바람직하게는 형광 측정 방법에 의할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 실시간 다중 등온증폭반응(real-time multiplex LAMP)을 기반으로 하여 종래에 PCR, real time PCR 기반의 검출과 달리 고가의 장비와 숙련된 기술자 없이도 신종 코로나바이러스의 검출이 가능하고, 1시간 이내에 바이러스의 검출이 가능하여 현장에서 빠른 진단을 통환 조기 치료를 실시할 수 있다. 또한, 본 발명은 형광프로브와 내부대조군을 이용하여 위양성/위음성 결과를 배제할 수 있고, 아울러 복수 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 세트를 제공하여 검사 결과의 신뢰도를 높일 수 있는바 현장에서 기존의 검출법을 대체하는 분자진단검사법으로 즉시 적용가능하다.
도 1은 신종 코로나바이러스 RdRP gene 서열에서 LAMP 프라이머 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 2는 신종 코로나바이러스 E gene 서열에서 LAMP 프라이머 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 3은 신종 코로나바이러스 N gene 서열에서 LAMP 프라이머 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 4는 신종 코로나바이러스 S gene 서열에서 LAMP 프라이머 세트의 위치를 나타낸 도면이다.
도 5는 RdRP gene을 타겟으로 하는 LAMP 프라이머 세트의 교차반응에 대한 특이도 테스트 결과 도면이다.
도 6는 E gene을 타겟으로 하는 LAMP 프라이머 세트의 교차반응에 대한 특이도 테스트 결과 도면이다.
도 7는 N gene을 타겟으로 하는 LAMP 프라이머 세트의 교차반응에 대한 특이도 테스트 결과 도면이다.
도 8는 S gene을 타겟으로 하는 LAMP 프라이머 세트의 교차반응에 대한 특이도 테스트 결과 도면이다.
도 9은 상기 2종 프라이머 세트의 혼합인 다중 LAMP 프라이머 세트(COVID19 RdRP/N gene multiplex LAMP primer set)의 교차반응에 대한 특이도 테스트 결과 도면이다.
도 10은 임상샘플에서 다중 LAMP 프라이머 세트(COVID19 RdRP/E gene multiplex LAMP primer set)를 이용한 증폭 산물 검출 결과이다.
도 11은 COVID19 RdRP/N 유전자와 인터널컨트롤(actin ß) 조합의 다중 LAMP 테스트 결과 도면이다.
본 발명자들은 현장에서 숙련된 기술자 없이 빠르고 정확하게 신종 코로나바이러스 검출방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 신종 코로나바이러스(2019 novel coronavirus: 2019-nCoV)의 RdRP, E, N, 및/또는 S 유전자를 기반으로 LAMP 프라이머를 제작하였고, BLP 프라이머에 형광이 결합된 올리고뉴클레오티드 프로브를 표지하여 기존의 형광 dye를 사용하는 LAMP 방법보다 정확도와 특이도를 향상시키고, real time LAMP가 가능하게 하였다. 또한, 본 발명은 Real-time RT-LAMP 방법을 이용함으로써 종래에 qRT-PCR에 비해 시간을 검사에 소요되는 시간을 40분 이상 단축시킬 수 있으며, actin beta 유전자를 internal control로 이용하여 위음성 결과를 배제할 수 있다.
본 발명의 RdRP 유전자를 타겟으로 하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 1의 F3 프라이머, 서열번호 2의 B3 프라이머, 서열번호 3의 FIP 프라이머, 서열번호 4의 BIP 프라이머, 서열번호 5의 FL 프라이머, 서열번호 6의 BLP 프라이머를 포함하고, 상기 BLP 프라이머의 5`에 형광이 결합된 32 mer의 올리고 뉴클레오티드를 연결하여 프로브를 디자인하였다(서열번호 7), 또한, 상기 프로브와 상보적인 서열번호 8번의 올리고 뉴클레오티드(30mer)의 3`에 BHQ1이 결합시켜 퀀처 프로브를 제작하였다.
또한, 본 발명의 E 유전자를 타겟으로 하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 9의 F3 프라이머, 서열번호 10의 B3 프라이머, 서열번호 11의 FIP 프라이머, 서열번호 12의 BIP 프라이머, 서열번호 13의 BLP 프라이머를 포함하고, 상기 BLP 프라이머의 5`에 형광이 결합된 32 mer의 올리고 뉴클레오티드를 연결하여 프로브를 디자인하였다(서열번호 14), 또한, 상기 프로브 서열과 상보적인 서열번호 15번의 올리고 뉴클레오티드(30mer)의 3`에 BHQ1이 결합시켜 퀀쳐 프로브를 제작하였다.
또한, 본 발명의 N 유전자를 타겟으로 하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 16의 F3 프라이머, 서열번호 17의 B3 프라이머, 서열번호 18의 FIP 프라이머, 서열번호 19의 BIP 프라이머, 서열번호 20의 FL 프라이머, 서열번호 21의 BLP 프라이머를 포함하고, 상기 BLP 프라이머 5`에 형광이 결합된 32 mer의 올리고 뉴클레오티드를 연결하여 프로브를 디자인하였다(서열번호 22). 또한, 상기 프로브 서열과 상보적인 서열번호 23번의 올리고 뉴클레오티드(30mer)의 3`에 BHQ1이 결합시켜 퀀처 프로브로 사용하였다.
또한, 본 발명의 Spike (S) 유전자를 타겟으로 하는 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 24의 F3 프라이머, 서열번호 25의 B3 프라이머, 서열번호 26의 FIP 프라이머, 서열번호 27의 BIP 프라이머, 서열번호 28의 FL 프라이머, 서열번호 29의 BLP 프라이머를 포함하고, 상기 BLP 프라이머 5`에 형광이 결합된 32 mer의 올리고 뉴클레오티드를 연결하여 프로브를 디자인하였다(서열번호 30). 또한, 상기 프로브 서열과 상보적인 서열번호 31번의 올리고 뉴클레오티드(30mer)의 3`에 BHQ1이 결합시켜 퀀처 프로브로 사용하였다.
인터널 컨트롤로 사용된 Actin beta 유전자를 타겟으로 하는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 32의 F3 프라이머, 서열번호 33의 B3 프라이머, 서열번호 34의 FIP 프라이머, 서열번호 35의 BIP 프라이머, 서열번호 36의 FL 프라이머, 서열번호 37의 BL 프라이머를 포함한다.
한편, 본 발명자들은 신종 코로나바이러스의 2개 이상의 유전자를 동시에 증폭시켜 보다 신뢰도 높은 검사 결과를 확보하기 위하여 상기 각각의 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 세트를 혼합하여 '신종 코로나바이러스 검출용 다중 LAMP 프라이머 세트'를 제작하였다. 상기 신종 코로나바이러스 검출용 다중 LAMP 프라이머 세트는 RdRP, E, N, 및 S 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 유전자의 검출을 하나의 튜브에서 수행할 수 있는 multiplex LAMP에 제공될 수 있고, 상기 다중 LAMP 프라이머 세트는 높은 민감도와 특이도를 가지고 보다 정확한 진단 결과를 제공할 수 있다.
본 발명의 LAMP 기반의 프라이머 세트는 전통적인 PCR과 달리 온도변화를 요구하지 아니하여 단순하고 가벼운 증폭 기기를 이용할 수 있고 분석에 소요되는 시간을 획기적으로 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 신종 코로나바이러스 검출용 조성물을 제공한다. 하기 표 1의 서열번호 1-6은 신종 코로나바이러스의 RdRP 유전자를 증폭할 수 있는 6개의 프라이머 세트이며 (RdRP primer), 서열번호 9-13은 E 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트 (E primer) 이며, 서열번호 16-21은 N 유전자를 증폭할 수 있는 6개의 프라이머 (N primer) 세트이며, 서열번호 24-29은 S 유전자를 증폭할 수 있는 6개의 프라이머 (S primer) 세트이다. 표 1의 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물은 Multiplex LAMP 법을 이용한 신종 코로나바이러스 검출법에 사용될 수 있다.
본 발명의 신종 코로나바이러스 검출을 위한 multiplex LAMP 프라이머 세트의 구성은 하기 표 2 및 3과 같으며, 반응 시간 및 온도는 하기 표 5과 같다.
본 발명은 RdRP 프라이머 세트, E 프라이머 세트, 및 N 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 신종 코로나바이러스 진단용 LAPM 키트를 제공할 수 있으며, 상기 LAMP 키트는 multiplex LAMP 수행에 이용되어 한 번의 검사로 신종 코로나바이러스 감염 여부를 알 수 있다.
한편, 본 발명의 상기 세개의 프라이머 세트는 각각 독립적으로 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 각 프로브는 발하는 파장범위가 상이한 형광물질이 부착된 것일 수 있다.
본 발명은 서로 다른 형광을 발하는 각각의 프로브를 포함하는 상기 3개 프라이머 세트를 이용하여 multiplex real-time LAMP를 수행함으로써 한 번의 검사로 빠르게 감염 여부 결과를 얻을 수 있다.
상기 각 프로브에 부착되는 형광물질은 형광을 발하는 것이라면 제한되지 아니하나, 그 비제한적인 예로서 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등이 있다.
또한, 본 발명은 신종 코로나바이러스 감염 여부의 진단이 필요한 개체의 생물학적 시료에서 게놈 DNA(gDNA)를 분리하고, 상기 gDNA를 주형으로 하여 상기 키트를 이용하여 LAMP를 수행함으로써 표적 서열을 증폭하고, 그 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 신종 코로나바이러스 감염 진단 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 “개체”는 신종 코로나바이러스 감염의 진단이 필요한 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간일 수 있다. 또한, 본 발명에서 “생물학적 시료”는 객담(sputum), 기관지 흡인(bronchial aspiration) 및 기관지세척액(bronchial washing), 인후도말 등을 포함하는 신체의 다양한 부분의 세포 또는 조직을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “등온증폭반응(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)”은 기존 PCR법과 달리 PCR 사이클이 필요 없는 Bst, Gsp 등의 중합효소를 이용하여 등온의 조건에서 반응을 수행하는 방법으로, 기본적으로 4개의 프라이머를 이용하여, 양끝을 고리(loop) 구조로 합성하여 유전자의 특정 부위를 무한대로 증폭하고, 증폭된 DNA 산물을 형광 검출용 시약을 이용하거나 침전 반응시켜 증폭 유무를 확인하는 방법으로서, 바람직하게는 형광 검출용 시약을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, “다중 등온증폭반응(multiplex LAMP)”은 다양한 유전자를 동시에 검출할 수 있으며, 바람직하게는 시료에서 신종 코로나바이러스의 RdRP, N, 및 E 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 유전자의 증폭 산물 확인을 통해 신종 코로나바이러스 감염 유무를 판별할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 “실시간 다중 등온증폭반응(multiplex real-time LAMP)”는 상기 다양한 유전자의 증폭 유무를 실시간으로 확인하는 방법으로서 상기 3종의 프라이머 세트는 각각 형광 표지된 프라이머를 포함하여 시료에서 신종 코로나바이러스 감염 여부를 실시간으로 판별할 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트는 신종 코로나바이러스 감염의 진단을 위한 등온증폭반응(LAMP; Loop-mediated isothermal amplification)에 사용되는 것이 바람직하며, 등온증폭반응은 표적 DNA를 LAMP에 의하여 증폭하는 단일-단계(one-step) LAMP일 수 있고, 실시간 LAMP (real-time LAMP)일 수 있으며, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머 (primer)"란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에 있어서, “내부 프라이머(inner primer)”는 주형 DNA에 결합하여 새로운 DNA 사슬 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에 있어서, “외부 프라이머(outer primer)”는 내부 프라이머가 주형 DNA에 결합한 위치보다 더 바깥쪽에서 주형 DNA에 결합하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 내부 프라이머가 주형 DNA에 결합하여 DNA 사슬이 신장된 이후, 외부 프라이머와 주형 DNA의 결합으로 사슬 변위(strand displacement)가 발생하여 먼저 형성된 사슬이 떨어져 나오게 된다.
본 발명에 있어서, “고리 프라이머(loop primer)”는 상기 내부 프라이머 및 외부 프라이머가 주형 DNA에 결합하여 형성된 초기 줄기 고리(stem loop) 구조 사슬이 고리(loop) 구조 생성 횟수를 증가시켜 결과적으로 전체 반응을 가속화시킬 수 있도록 하는, 뉴클레오티드 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
한편, 본 발명에서 고리 프라이머에서 형광물질이 부착된 염기를 특정하기 위한 염기의 번호매김은 통상적으로 올리고뉴클레오티드의 염기 순서를 확인하는 방법과 동일하게 3'에서 5' 순서로 이루어진다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1. 2019-nCoV 검출용 프라이머 세트 설계
신종 코로나바이러스19의 정확한 검출을 위한 타겟 유전자 선별을 위하여 10개의 신종 코로나바이러스 19의 subtype을 조사하였고, 그 결과 변이에 영향을 받지 않고 확실한 바이러스 검출 결과를 제공할 수 있는 유전자로서 RdRP, E, N 및 S 유전자를 선정하였다. 각 유전자의 염기서열을 바탕으로 설계된 프라이머 세트는 형광프로브가 부착된 올리고펩타이드를 포함하고 있다. 각 타겟 유전자에 따른 프라이머 세트의 구체적인 정보는 하기 표 1과 같다.
서열번호 Name Sequence (5'-3') Target gene
1 Corona19 orf1ab LAMP primer set orf1ab_F3-1 CCG ATA AGT ATG TCC GCA AT Orf1ab
2 orf1ab_B3 GCT TCA GAC ATA AAA ACA TTG T
3 orf1ab_FIP ATG CGT AAA ACT CAT TCA CAA AGT CCA ACA CAG ACT TTA TGA GTG TC
4 orf1ab_BIP TGA TAC TCT CTG ACG ATG CTG TTT AAA GTT CTT TAT GCT AGC CAC
5 orf1ab_FLP TGT GTC AAC ATC TCT ATT TCT ATA G
6 orf1ab_BLP TCA ATA GCA CTT ATG CAT CTC AAG G
7 orf1ab_LB_P4_FAM CGGGCCCGTACAAAGGGAACACCCACACTCCG TCA ATA GCA CTT ATG CAT CTC AAG G
8 P4_QUANCHER GAG TGT GGG TGT TCC CTT TGT ACG GGC CCG
9 Corona19 E LAMP primer set Wu_LAMP_E_F3 TCATTCGTTTCGGAAGAGA E
10 Wu_LAMP_E_B3 AGGAACTCTAGAAGAATTCAGAT
11 Wu_LAMP_E_FIP TGTAACTAGCAAGAATACCACGAAACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCG
12 Wu_LAMP_E_BIP GCTTCGATTGTGTGCGTACTCGAGAGTAAACGTAAAAAGAAGG
13 Wu_LAMP_E_BLP GCTGCAATATTGTTAACGTGAGTC
14 Wu_LAMP_E_LB_P4_HEX CGG GCC CGT ACA AAG GGA ACA CCC ACA CTC CGG CTG CAA TAT TGT TAA CGT GAG TC
15 P4_QUANCHER GAG TGT GGG TGT TCC CTT TGT ACG GGC CCG
16 Corona19 N LAMP primer set Wu_LAMP_N_F3 TGGACCCCAAAATCAGCG N
17 Wu_LAMP_N_B3 GCCTTGTCCTCGAGGGAAT
18 Wu_LAMP_N_FIP CCACTGCGTTCTCCATTCTGGTAAATGCACCCCGCATTACG
19 Wu_LAMP_N_BIP CGCGATCAAAACAACGTCGGCCCTTGCCATGTTGAGTGAGA
20 Wu_LAMP_N_FLP TGAATCTGAGGGTCCACCAAA
21 Wu_LAMP_N_BLP GGTTTACCCAATAATACTGCGTCTT
22 Wu_LAMP_N_BLP_PROBE4_TEX CGGGCCCGTACAAAGGGAACACCCACACTCCGGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTT
23 P4_QUANCHER GAG TGT GGG TGT TCC CTT TGT ACG GGC CCG
24 Corona19 S LAMP primer set Wu_LAMP_S_F3 CAGAAGTCCCTGTTGCTAT Spike gene
25 Wu_LAMP_S_B3 CGAGGAGAATTAGTCTGAGTC
26 Wu_LAMP_S_FIP TGCACGTGTTTGAAAAACATTAGAATCATGCAGATCAACTTACTCC
27 Wu_LAMP_S_BIP GGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGATAACTAGCGCATATACCTG
28 Wu_LAMP_S_FLP CCTGTAGAATAAACACGCCAAGTA
29 Wu_LAMP_S_BLP TGTCAACAACTCATATGAGTGTGAC
30 Wu_LAMP_S_BLP_PROBE4_HEX CGGGCCCGTACAAAGGGAACACCCACACTCCG CCTGTAGAATAAACACGCCAAGTA
31 P4_QUANCHER GAG TGT GGG TGT TCC CTT TGT ACG GGC CCG
32 Internal control Actin B LAMP primer set IC_LAMP_ACTB_F3 AGT ACC CCA TCG AGC ACG Actin beta
33 IC_LAMP_ACTB_B3 AGC CTG GAT AGC AAC GTA CA
34 IC_LAMP_ACTB_FIP GAG CCA CAC GCA GCT CAT TGT ATC ACC AAC TGG GAC GAC A
35 IC_LAMP_ACTB_BIP CTG AAC CCC AAG GCC AAC CGG CTG GGG TGT TGA AGG TC
36 IC_LAMP_ACTB_LF TGT GGT GCC AGA TTT TCT CCA
37 IC_LAMP_ACTB_LB CGA GAA GAT GAC CCA GAT CAT GT
실시예 2. 2019-nCoV 검출용 primer mix 및 LAMP 조성물의 조성과 반응 조건
real-time LAMP primer mix 조성은 하기 표 2에 나타내었으며, real-time LAMP를 위한 반응 혼합물의 시약(M-monitor LAMP kit 사용) 조성은 하기 표 3에 나타내었고, real-time LAMP는 하기 표 4의 반응 조건하에서 수행되었다.
Corona19 orf1ab LAMP primer set Corona19 E LAMP primer set Corona19 N LAMP primer set Corona19 S LAMP primer set Vol(ul)
orf1ab_F3-1 Wu_LAMP_E_F3 Wu_LAMP_N_F3 Wu_LAMP_S_F3 4
orf1ab_B3 Wu_LAMP_E_B3 Wu_LAMP_N_B3 Wu_LAMP_S_B3 4
orf1ab_FIP Wu_LAMP_E_FIP Wu_LAMP_N_FIP Wu_LAMP_S_FIP 32
orf1ab_BIP Wu_LAMP_E_BIP Wu_LAMP_N_BIP Wu_LAMP_S_BIP 32
orf1ab_FLP DW Wu_LAMP_N_FLP Wu_LAMP_S_FLP 10
orf1ab_BLP Wu_LAMP_E_BLP Wu_LAMP_N_BLP Wu_LAMP_S_BLP 4
orf1ab_BLP_PROBE4_ FAM Wu_LAMP_E_BLP_PROBE4_ HEX Wu_LAMP_N_BLP_PROBE4_TEX Wu_LAMP_S_BLP_PROBE4_ TEX 6
DW 8
TOTAL 100
구분 부피
RM 12.5
EM 2
Distilled water 0.5
Primer mix 2.5
QUANCHER P4 2.5
Template 5
TOTAL 25
실험 1. 원스텝 RT-LAMP검출실험
온도 반응시간
60 ℃ 1분 50 Cycle
80 ℃ 5분
전체반응시간 55분
실시예 3. 2019-nCoV 검출용 LAMP 프라이머 세트의 검출 민감도 확인 본 발명의 2019-nCoV 검출용 LAMP 프라이머 세트의 검출 한계를 확인하기 위하여 코로나19 바이러스의 RdRP, N, 또는 E 유전자를 삽입한 plasmid DNA(양성 대조군)를 3차 증류수로 1X107 ~ 1X100까지 희석하여 농도별 분석능을 확인하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
No Copies/μl RdRP gene E gene N gene S gene
Ct value RFU Ct value RFU Ct value RFU Ct value RFU
1 107 13.41 9989 7.96 7067 9.14 5080 6.44 15381
2 106 15.41 10584 8.54 18288 10.58 4690 7.32 15761
3 105 16.84 9370 9.37 18122 11.73 4762 8.33 14321
4 104 19.23 10729 10.39 18053 12.49 4660 9.22 15864
5 103 21.18 10532 12.24 17344 15.15 4803 10.23 16147
6 102 23.72 9894 27.27 10855 17.85 4865 12.2 14982
7 101 N/A 34.4 N/A 292 27.83 4533 17 14995
8 100 N/A 27 N/A 338 N/A 155 N/A 226
상기 표로 확인되는 바와 같이, RdRP 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 세트는 100 copy에서 증폭이 확인되었고, N 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 세트는 10 copy에서 증폭이 확인되었고, E 유전자를 타겟으로 하는 프라이머 세트는 100 copy에서 증폭이 확인되었는바, 각 프라이머 세트는 높은 민감도로 타겟 유전자를 검출할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4. 2019-nCoV 검출용 LAMP 프라이머 세트의 특이도 확인
신종 코로나바이러스-19에 대한 특이반응을 확인하기 위하여, 임상으로 확인된 코로나바이러스 3종(NL63, 229E, OC43/HKU1)과의 교차반응을 실시하였다.
그 결과, 4개의 2019-nCoV 검출용 프라이머 세트 모두 상호 교차 반응 및 비특이 반응에 대한 결과가 없음을 확인할 수 있었다(도 5 내지 도 8).
실시예 5. 임상샘플에서 2019-nCoV 검출용 LAMP 프라이머 세트와 WHO의 RT-qPCR 프라이머의 검출 민감도 비교 확인
고려대학교 구로 병원에서 신종 코로나바이러스 감염으로 확진된 2개 검체로 WHO 기준의 RT-qPCR 프라이머와 상기 실시예 1에서 설계한 2종 프라이머 세트의 혼합 프라이머 세트(COVID19 RdRP/E gene multiplex CoV19 LAMP primer set, 도 9)의 신종 코로나바이러스 검출 민감도의 비교 테스트를 진행하였다. 각 샘플은 인후도말 샘플이며, 고려대학교 구로 병원에서 제공받아 사용하였다.
각 샘플의 10분의 1희석배수를 이용하여 농도별 분석능을 검증한 결과는 하기 표 6 및 7에 나타내었으며, 하기 표로 확인되는 바와 같이, 본원의 혼합 프라이머 세트는 WHO의 RT-qPCR 프라이머와 비교하여 더 낮은 농도에서 신종 코로나바이러스 19를 검출할 수 있음을 알 수 있다. 도 10는 두개의 2019-nCoV 감염 Nasopharyngeal swab 원 검체에 대한 멀티플렉스 실험 결과를 나타낸다(도 10).
샘플 1 Nasopharyngeal swab Nasopharyngeal swab
Multiplex CoV19 LAMP RdRP_SARSr- P1 RdRP_SARSr- P2 E_Sarbeco- P1 N_Sarbeco- P1
RdRP_FAM E_HEX SYBR SYBR SYBR SYBR
　 CT RFU CT RFU CT RFU CT RFU CT RFU CT RFU
원 검체 12.8 8104 12.82 3597 24.31 1757 21.62 5103 20.09 7995 24.39 7449
검체 10-1 희석 13.26 7685 13.93 4348 27.69 1752 24.95 5885 23.46 8178 27.93 8175
검체 10-2 희석 15.27 8454 15.47 4328 30.99 1806 28.23 6065 26.68 8855 30.75 7933
검체 10-3 희석 16.57 8264 16.25 4263 34.94 1427 31.88 5623 30.5 7868 34.21 6080
검체 10-4 희석 20.37 7933 24.69 767 N/A 1179 N/A 5049 34.35 7396 N/A 2715
검체 10-5 희석 N/A 16.4 N/A 16.3 N/A 692 N/A 1839 N/A 4525 N/A 20
검체 10-6 희석 N/A 28.2 N/A 61.6 N/A 586 N/A -3.21 N/A 17.1 N/A 25
1) HsRNA N/A 19.1 N/A 16.5 N/A 0.873 N/A -5.77 N/A -7.42 N/A 454
1) DW N/A 32 N/A 26.3 N/A 8.98 N/A -6.03 N/A 7.86 N/A 2.18
샘플 2 Nasopharyngeal swab Nasopharyngeal swab
Multiplex CoV19 LAMP RdRP_SARSr- P1 RdRP_SARSr- P2 E_Sarbeco- P1 N_Sarbeco- P1
RdRP_FAM E_HEX SYBR SYBR SYBR SYBR
　 CT RFU CT RFU CT RFU CT RFU CT RFU CT RFU
원 검체 14.47 8971 14.02 4039 28.18 1566 25.42 5164 24.03 7742 28.48 7241
검체 10-1 희석 15.99 7261 15.77 3769 31.45 1637 28.67 5746 27.15 8265 31.59 6992
검체 10-2 희석 17.4 8876 19.23 4019 34.74 1577 31.87 5521 30.63 8153 33.96 6334
검체 10-3 희석 19.13 8868 22.24 807 N/A 1103 N/A 5008 34.29 7117 N/A 2838
검체 10-4 희석 N/A 3139 N/A 518 N/A 845 N/A 2909 N/A 6269 N/A 21.5
검체 10-5 희석 N/A 27.9 N/A 30.6 N/A 11.1 N/A 579 N/A 4.55 N/A 21.9
검체 10-6 희석 N/A 26.1 N/A 518 N/A 9.38 N/A -2.46 N/A 15.1 N/A 23.1
1) HsRNA N/A 19.1 N/A 16.5 N/A 0.873 N/A -5.77 N/A -7.42 N/A 454
1) DW N/A 32 N/A 26.3 N/A 8.98 N/A -6.03 N/A 7.86 N/A 2.18
시예 6. COVID19 RdRP/N 유전자와 인터널컨트롤(actin ß) 조합의 멀티플렉스 LAMP 프라이머의 검출 민감도 확인
RdRp 및 N plasmid와 음성 검체로 상기 실시예 1에서 설계한 2종 프라이머 세트(COVID19 RdRP/N gene multiplex CoV19 LAMP primer set)와 인터널컨트롤 프라이머 세트의 혼합을 이용하여 다중 등온증폭반응을 수행하였다. RdRP 프라이머 세트와 N 프라이머 세트에 포함된 각 프로브는 Cy5로 형광표지되었으며, 인터널 컨트롤 actin ß를 포함한 증폭산물은 Evagreen을 이용하여 형광염색하였다. 그 결과, 코로나 19 바이러스의 RdRP 및 N 유전자는 Cy5 형광으로 검출할 수 있고, RdRP 및 N 증폭산물을 포함하는 actin ß 증폭산물은 evagreen으로 검출이 가능함을 확인하였다(도 11).
상기 결과를 기반으로, 고려대학교 구로 병원에서 신종 코로나바이러스 감염으로 확진된 10개 임상샘플과 음성샘플 10개를 RdRP/N/actin ß 멀티플렉스 LAMP assay를 통해 검출 민감도 및 특이도를 확인하였다. 신종 코로나바이러스 감염으로 확진된 샘플에 대한 결과는 하기 표 8에 나타내었고, 음성샘플을 대상으로 한 실험 결과는 하기 표 9에 나타내었다. 하기 표로 확인되는 바와 같이, 본원의 혼합 프라이머 세트는 비특이적 반응없이 실험된 모든 COVID19 양성검체 모두를 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
COVID-19
양성 검체 수		 COVID-19 RdRP, N gene (FAM) Internal control (Eva green)
Ct RFU Ct RFU
1 24.36 9159 21.63 4586
2 23.77 9901 21.19 4655
3 27.73 8990 24.92 4619
4 25.84 9009 23.13 4482
5 22.98 9682 20.2 4776
6 27.28 8769 24.57 4631
7 22.74 9528 20.12 4706
8 22.15 9198 19.5 4433
9 16.53 9397 14.1 4330
10 29.25 6403 24.71 4317
COVID-19
음성 검체 수		 COVID-19 RdRP, N gene (FAM) Internal control (Eva green)
Ct RFU Ct RFU
1 N/A 31.1 24.64 2823
2 N/A 35.4 24.3 3187
3 N/A 119 26.5 3101
4 N/A 19.1 30.99 2801
5 N/A 21.6 26.13 3375
6 N/A 48.7 25.55 3019
7 N/A 42.6 26.63 3058
8 N/A 47.1 27.49 3116
9 N/A 35.5 29.82 28678
10 N/A 50.5 34.2 5077
상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research and Buisness Foundation <120> High sensitive multiplex loop-mediated isothermal amplification primer set for detection of novel coronavirus-19 <130> DHP20-194 <150> KR 1020200029268 <151> 2020-03-09 <160> 37 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_F3-1 <400> 1 ccgataagta tgtccgcaat 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_B3 <400> 2 gcttcagaca taaaaacatt gt 22 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_FIP <400> 3 atgcgtaaaa ctcattcaca aagtccaaca cagactttat gagtgtc 47 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_BIP <400> 4 tgatactctc tgacgatgct gtttaaagtt ctttatgcta gccac 45 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_FLP <400> 5 tgtgtcaaca tctctatttc tatag 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_BLP <400> 6 tcaatagcac ttatgcatct caagg 25 <210> 7 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_F3-1 <400> 7 cgggcccgta caaagggaac acccacactc cgtcaatagc acttatgcat ctcaagg 57 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orf1ab_B3 <400> 8 gagtgtgggt gttccctttg tacgggcccg 30 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_E_F3 <400> 9 tcattcgttt cggaagaga 19 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_E_B3 <400> 10 aggaactcta gaagaattca gat 23 <210> 11 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_E_FIP <400> 11 tgtaactagc aagaatacca cgaaacaggt acgttaatag ttaatagcg 49 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_E_BIP <400> 12 gcttcgattg tgtgcgtact cgagagtaaa cgtaaaaaga agg 43 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_E_BLP <400> 13 gctgcaatat tgttaacgtg agtc 24 <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_E_LB_P4_HEX <400> 14 cgggcccgta caaagggaac acccacactc cggctgcaat attgttaacg tgagtc 56 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4_QUANCHER <400> 15 gagtgtgggt gttccctttg tacgggcccg 30 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_N_F3 <400> 16 tggaccccaa aatcagcg 18 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_N_B3 <400> 17 gccttgtcct cgagggaat 19 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_N_FIP <400> 18 ccactgcgtt ctccattctg gtaaatgcac cccgcattac g 41 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_N_BIP <400> 19 cgcgatcaaa acaacgtcgg cccttgccat gttgagtgag a 41 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_N_FLP <400> 20 tgaatctgag ggtccaccaa a 21 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_N_BLP <400> 21 ggtttaccca ataatactgc gtctt 25 <210> 22 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_N_BLP_PROBE4_TEX <400> 22 cgggcccgta caaagggaac acccacactc cgggtttacc caataatact gcgtctt 57 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4_QUANCHER <400> 23 gagtgtgggt gttccctttg tacgggcccg 30 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_F3 <400> 24 cagaagtccc tgttgctat 19 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_B3 <400> 25 cgaggagaat tagtctgagt c 21 <210> 26 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_FIP <400> 26 tgcacgtgtt tgaaaaacat tagaatcatg cagatcaact tactcc 46 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_BIP <400> 27 ggctgtttaa taggggctga acatgataac tagcgcatat acctg 45 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_FLP <400> 28 cctgtagaat aaacacgcca agta 24 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_BLP <400> 29 tgtcaacaac tcatatgagt gtgac 25 <210> 30 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wu_LAMP_S_BLP_PROBE4_HEX <400> 30 cgggcccgta caaagggaac acccacactc cgcctgtaga ataaacacgc caagta 56 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4_QUANCHER <400> 31 gagtgtgggt gttccctttg tacgggcccg 30 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_F3 <400> 32 agtaccccat cgagcacg 18 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_B3 <400> 33 agcctggata gcaacgtaca 20 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_FIP <400> 34 gagccacacg cagctcattg tatcaccaac tgggacgaca 40 <210> 35 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_BIP <400> 35 ctgaacccca aggccaaccg gctggggtgt tgaaggtc 38 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_LF <400> 36 tgtggtgcca gattttctcc a 21 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC_LAMP_ACTB_LB <400> 37 cgagaagatg acccagatca tgt 23

Claims (20)

  1. 서열번호 1 내지 6의 프라이머를 포함하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프로브와 서열번호 8의염기서열로 이루어진 퀀처(quancher)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 프로브는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 32 내지 37의 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  5. 서열번호 9 내지 13의 프라이머를 포함하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프로브와 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 퀀처(quencher)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 프로브는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 32 내지 37의 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  9. 서열번호 16 내지 21의 프라이머를 포함하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 프로브와 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 퀀쳐(quencher)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 프로브는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 32 내지 37의 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  13. 서열번호 24 내지 29의 프라이머를 포함하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 프라이머 세트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 프로브와 서열번호 31의 염기서열로 이루어진 퀀쳐(quencher)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 프로브는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 형광물질이 부착된 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 32 내지 37의 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 검출용 LAMP 프라이머 세트.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트; 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 프라이머 세트; 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 프라이머 세트; 및 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 신종 코로나바이러스 검출용 다중 LAMP 프라이머 세트.
  18. (1) 생물학적 시료의 게놈 DNA(gDNA)를 분리하는 단계;
    (2) 상기 분리된 gDNA를 주형으로 하고 제14항의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (3) 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 신종 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 생물학적 시료는 객담(sputum), 기관지 흡인(bronchial aspiration) 및 기관지세척액(bronchial washing), 및 인후 도말(throat swab)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 (3) 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 및 인광 측정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 신종 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법.
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