KR102495807B1 - 코로나바이러스 오미크론 변이 검출용 프라이머와 프로브 및 이의 용도 - Google Patents
코로나바이러스 오미크론 변이 검출용 프라이머와 프로브 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 SARS-CoV-2 오미크론 변이를 검출할 수 있는 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물을 이용하면 SARS-CoV-2 오미크론 변이를 야생형과 구분하여 정확하고 신속하게 검출할 수 있어, 빠르고 정확한 진단이 필요한 의료현장에서 변이검출을 위해 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 코로나바이러스 오미크론 변이 검출용 프라이머 세트와 프로브 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 실시간(real time, rt) 역전사(Reverse Transcription, RT)-중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에서 사용되는 프라이머 세트와 프로브에 관한 것이다. 본 발명은 코로나바이러스 오미크론 변이의 S 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머와 프로브를 이용하여 코로나바이러스 오미크론 변이를 검출할 수 있다.
2019년 11월 중국 우한에서 처음 발견되어 범 지구적인 팬데믹 전염병으로 번진 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)은 새로운 유형의 변종 코로나바이러스인 SARS-CoV-2에 의해 발병하는 급성 호흡기 전염병이다. SARS-CoV-2의 유전자 서열이 공개되면서 WHO는 SARS-CoV-2의 분자 유전자 진단법을 홈페이지에 공개하였다
SARS-CoV-2는 제1급 감염병 신종감염병증후군으로 분류되어 있고 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하는 RNA 바이러스이다. 현재까지는 비말(침방울), 접촉을 통해 전파되고 있는데 특히 기침이나 재채기를 할 때 생긴 비말(침방울)을 통한 전파와 사스 코로나바이러스 2에 오염된 물건을 만진 뒤 눈, 코, 입을 만지는 경우 전파가 가능한 것으로 알려져 있다. 보통 1 내지 14일의 잠복기로 알려져 있고 평균 4 내지 7일 정도의 잠복기를 갖는다. 주요 증상으로는 발열, 권태감, 기침, 호흡곤란 및 폐렴 등 경증에서 중증가지 다양한 상기도 호흡기 감염증이 나타나고 그 외 가래, 인후통, 두통, 객혈과 오심, 설사 등을 동반하고 이를 치료하기 위해 수액 보충, 해열제 등 대증치료와 범용 항바이러스제를 임상에서 투약하고 있으나, 특이적인 항바이러스제는 전무한 상태이다. 이러한 SARS-CoV-2의 감염을 진단하기 위해서는 상기도 또는 하기도 검체에서 바이러스를 분리하여 특이 유전자를 실시간 유전자 증폭을 통해서 감염 여부를 진단하는 방법을 선택하고 있다.
SARS-CoV-2는 2019년 11월 첫 감염증을 일으키는 것으로 보고된 이후, 2020년 12월에 알파변이를 시작으로 수많은 변이가 발생되어 보고되고 있다. 그 중 2021년 11월 남아프리카공화국에서 새롭게 발견된 SARS-CoV-2의 B.1.1.529변이를 WHO에서 오미크론 변이로 명명하였다. 오미크론 변이는 퓨린 절단부 변이가 중첩된 첫 변이주이며, 백신회피 변이 위치가 5개 이상으로 확인되었고, 뉴클레오캡시드 단백질 변이가 2곳이 발견되었다.
오미크론 변이 SARS-CoV-2로 인한 감염증은 종래보다 치명률이 다소 낮은 것으로 보고되고 있으나 아직 충분한 임상 데이터가 확보되지 않아 안심할 수는 없으며, 치명률이 낮더라도 기존 변이들과는 차원이 다른 전파력으로 신규 확진 규모와 이에 따른 중증환자 수를 대폭 늘려 국가 의료체계를 붕괴시킬 수 있는 위험이 있다. 2022년 현재 이미 변이의 최초 발견지인 남아프리카공화국에서는 변이검출 중 90% 이상을 차지하여 우점종에 등극한 것으로 알려졌으며, 다른 국가에서도 높은 전파력으로 다른 변이를 누르고 우점종을 차지할 것으로 전망된다.
이러한 오미크론 변이의 높은 전염력과 전파성으로 인한 확진자의 급증과 의료체계 붕괴를 미연에 방지하기 위하여 신뢰도 높게 오미크론 변이를 검출할 수 있는 검사방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다. SARS-CoV-2의 N, S 및 M 유전자는 매우 풍부하게 발현되므로, RdRp와 E gene에 비하여 진단에 매우 민감한 타겟으로 쓰일 수 있는 것으로 보고되고 있다(Toptan et al., 2020, Int J Mol Sci.).
따라서 본 발명자들은 SARS-CoV-2의 오미크론 변이의 S 유전자를 타겟으로, 실시간 중합효소 연쇄반응을 통하여 높은 민감도와 특이도로 진단할 수 있는 프라이머와 프로브를 개발하고자 하였다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 SARS-CoV-2 오미크론 변이를 야생형과 구별하여 검출할 수 있도록 하는 조성물로서, 구체적으로는 실시간 중합효소 연쇄반응용 프라이머 세트 및 프로브를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트와 서열번호 3의 프로브를 포함하는, SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 세트와 서열번호 6의 프로브를 포함하는, SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 조성물이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 프로브는 5' 말단에 형광표지물질을 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 형광표지물질은 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 프로브는 3' 말단에 소광자(quencher)를 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 및 아이오와 블랙(Iowa black)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 조성물은 서열번호 7의 프로브를 더 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 서열번호 7의 프로브는 서열번호 3 또는 서열번호 6의 프로브와 서로 다른 형광물질로 5' 말단이 표지될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 PCR 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, (a) 대상체로부터 검체를 채취하는 단계; 및 (b) 상기 채취된 검체의 유전물질을 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트와 서열번호 3의 프로브를 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real time RT Polymerase Chain Reaction, rt-RT-PCR)을 수행하는 단계; 를 포함하는 SARS-CoV-2 오미크론 변이의 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, (a) 대상체로부터 검체를 채취하는 단계; 및 (b) 상기 채취된 검체의 유전물질을 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 세트와 서열번호 6의 프로브를 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real time RT Polymerase Chain Reaction, rt-RT-PCR)을 수행하는 단계; 를 포함하는 SARS-CoV-2 오미크론 변이의 검출 방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 검체는 대상체의 객담, 인두도말, 타액, 및 비강도말에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 검출 방법의 상기 (b) 단계의 상기 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응은 서열번호 7의 프로브를 더 포함하여 이루어질 수 있다.
본 발명은 SARS-CoV-2 오미크론 변이를 정확하고 신속하게 검출할 수 있으며, 특히 기타 호흡기질환 바이러스 및 SARS-CoV-2 야생형과 구별하여 오미크론 변이를 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용해 간단하게 SARS-CoV-2 야생형 및 오미크론 변이를 동시에 검출할 수 있고, 높은 민감도와 특이도를 갖는다.
도 1은 오미크론 변이 시료를 주형으로 RT-PCR 실험하여 형광을 나타낸 도표이다.
도 2는 서열번호 1 내지 3의 프라이머 세트 및 프로브의 특이도를 실험한 도표이다.
도 3은 서열번호 4 내지 6의 프라이머 세트 및 프로브의 특이도를 실험한 도표이다.
도 4는 서열번호 1 내지 3의 프라이머 세트 및 프로브의 검출한계를 실험한 도표이다.
도 5는 서열번호 4 내지 6의 프라이머 세트 및 프로브의 검출한계를 실험한 도표이다.
도 6은 HEX로 표지된 야생형 프로브의 검출한계를 실험한 도표이다.
도 2는 서열번호 1 내지 3의 프라이머 세트 및 프로브의 특이도를 실험한 도표이다.
도 3은 서열번호 4 내지 6의 프라이머 세트 및 프로브의 특이도를 실험한 도표이다.
도 4는 서열번호 1 내지 3의 프라이머 세트 및 프로브의 검출한계를 실험한 도표이다.
도 5는 서열번호 4 내지 6의 프라이머 세트 및 프로브의 검출한계를 실험한 도표이다.
도 6은 HEX로 표지된 야생형 프로브의 검출한계를 실험한 도표이다.
본 발명은 SARS-CoV-2 오미크론 변이의 S 유전자를 기반으로 프라이머 세트 및 프로브를 제작하여 SARS-CoV-2 야생형 및 기타 호흡기 질환 바이러스와 구별하여 SARS-CoV-2 오미크론 변이를 검출할 수 있도록 하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 실시한 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time RT PCR) 방법을 이용함으로써 종래에 conventional RT-PCR에 비해 검출 시간을 단축할 수 있다. 본 발명은 기존의 일반 PCR법으로 발생될 수 있는 결과 분석의 에러와 소요 시간을 줄이고, SARS-CoV-2 오미크론 변이의 검출이 가능하다.
구체적으로, 본 발명은 SARS-CoV-2 오미크론 변이의 S 유전자에 대한 프라이머 및 프로브를 포함하는 SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로, 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 프로브는 SARS-CoV-2 오미크론 변이의 S 유전자를 표적하여 제작되었다. 또한, 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 6의 프로브 역시 상기 S 유전자를 표적하여 제작되었다. 상기 프라이머 및 프로브 세트, 및 이를 포함하는 조성물은 실시간(real-time) RT-PCR을 이용한 SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출법에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 프로브는 형광물질로 표지되어 SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출에 이용될 수 있으며, 형광의 강도 또는 형광의 파장을 통해 샘플 내에 SARS-CoV-2 오미크론 변이 존부의 감별이 가능하다. 일 측에 따르면, 본 발명의 상기 프로브와 함께 SARS-CoV-2 야생형을 탐지하는 서로 다른 형광표지 프로브를 함께 사용할 수 있으며, 이 경우 SARS-CoV-2 오미크론 변이와 야생형을 형광표지로 구별할 수 있다.
한편, 본 발명의 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 및 서열번호 4 및 5의 프라이머 세트는 종래 SARS-CoV-2 검출에 이용되던 프라이머와는 달리 SARS-CoV-2 오미크론 변이를 특이적이고 민감하게 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머 (primer)"란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에서 “프로브”란 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 핵산단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 핵산 존재여부를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소등으로 표지될 수 있다.
본 발명의 프로브는 바람직하게는 5'-말단에 형광물질로 표지될 수 있으며, 3'-말단은 소광자(quencher)가 접합된 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 형광물질은 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등일 수 있으며, 또한 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black) 등일 수 있다.
본 발명의 조성물은 SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출을 위한 PCR에 이용될 수 있으며 상기 PCR은 바람직하게는 실시간 역전사 PCR일 수 있다.
본 발명에서, 서열번호 7은 SARS-CoV-2 야생형을 검출하기 적합하게 설계된 프로브이며, 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 6의 오미크론 프로브와 서로 다른 형광으로 5' 말단이 표지될 수 있다. 따라서, 야생형 프로브와 오미크론 프로브를 동시에 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 경우, SARS-CoV-2 야생형과 오미크론 변이를 동시에 구별하여 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, (a) 대상체로부터 검체를 채취하는 단계; (b) 상기 채취된 검체의 RNA를 역전사효소를 이용해 상보적 DNA(cDNA)로 역전사하는 단계; (c) 상기 역전사된 cDNA를 주형으로, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트와 서열번호 3의 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real time Polymerase Chain Reaction, rt-PCR)을 수행하는 단계; 를 포함하는 SARS-CoV-2 오미크론 변이의 검출 방법이 제공된다. 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트와 서열번호 3의 프로브는 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 세트와 서열번호 6의 프로브로 대체될 수 있다.
본 발명에서 상기 검체는 생물학적 시료로서 비인두 세척액, 기관지폐포세척액, 흉수, 비강 도말, 비강 흡인액, 비인두도말, 비인두흡인액, 혈액, 체액, 타액, 가래 및 객담 중 어느 하나이상이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 객담 및 인두도말일 수 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
실시예1. 프라이머 세트와 프로브 설계 및 PCR 수행
공개된 SARS-CoV-2 오미크론 변이의 염기서열을 바탕으로 타겟 유전자를 S 유전자로 설정하고 프라이머와 프로브를 설계하였다. 제작된 프라이머와 프로브의 구체적인 정보는 하기 표 1에 나타내었다. 하기 오미크론 프로브는 5' 말단이 FAM으로 표지되었으며, 3' 말단에는 BHQ1 소광자를 포함한다. 하기 야생형 프로브는 5' 말단이 HEX로 표지되었으며, 3' 말단에는 BHQ1 소광자를 포함한다.
| 서열번호 | 표적유전자 | 프라이머 | 서열 (5' -> 3') | 위치(길이) | 크기(bp) |
| 1 | S gene | 프라이머 S1 F | TCGAAGACCCAGTCCCTACT | 328-347(20) | 210 |
| 2 | 프라이머 S1 R | ACCCTGTTTTCCTTCAAGGTC | 517-537(21) | ||
| 3 | 오미크론 프로브S1 | TGTAATGATCCATTTTTGGACCACA | 400-424(25) | ||
| 4 | 프라이머 S2 F | TCAGCCTTTTCTTATGGACCT | 501-521(21) | 169 | |
| 5 | 프라이머 S2 R | CAATGGTTCTAAAGCCGAAA | 650-669(20) | ||
| 6 | 오미크론 프로브 S2 | GCGTGAGCCAGAAGATCTCC | 621-640(20) | ||
| 7 | 야생형 프로브 | GGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAA | 423-449(27) |
이어서, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트와 서열번호 3의 프로브를 포함하는 프라이머 믹스와 상기 서열번호 4 및 5의 프라이머 세트와 서열번호 6의 프로브를 포함하는 프라이머 믹스를 하기 표 2의 조성물과 함께 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real time RT PCR)을 수행하였다. PCR 조건은 하기 표 3과 같다. 하기 야생형 프로브의 서열은 서열목록에 서열번호 7로 첨부된 바와 같으며, 5' 말단이 HEX로 표지되었다.
| 구분 | 부피 |
| 2XMastermix | 10 μl |
| 프라이머 F (10 pmol) | 1 μl |
| 프라이머 R (10 pmol) | 1 μl |
| 야생형 프로브(HEX) (10 pmol) | 0.5 μl |
| 오미크론 프로브(FAM) (4 pmol) | 0.5 μl |
| 템플레이트 DNA | 5 μl |
| 증류수 | 2 μl |
| 전체 부피 | 20 μl |
| 단계별 온도 | 시간 | |
| 50℃ | 30 min | |
| 95℃ | 15 min | |
| 95℃ | 40 sec | 40 cycles |
| 58℃ | 60 sec | |
실시예 2. 오미크론 변이 검출의 민감도 및 특이도 테스트
상기 표 2 및 표 3의 조건하에서, SARS-CoV-2 야생형과 SARS-CoV-2 오미크론 변이 시료를 주형으로 RT-PCR을 수행하여 Ct 값을 측정함으로써 프라이머 세트 및 프로브의 민감도와 특이도를 확인하였으며, 그 결과를 각각 도 1 및 표 4에 나타내었다. 하기 표 4에 나타나는 바와 같이, 오미크론 변이 주형의 시료에서는 오미크론 프라이머의 FAM 형광만이 검출되었고, 야생형 주형의 시료에서는 형광이 검출되지 않았다. 이로써, 본 발명의 프라이머 세트가 오미크론 변이에만 양성으로 검출됨을 확인하였다.
| 시료 | Ct[FAM] |
| Omicron_S1 RNA | 18.43 |
| Omicron_S2 RNA | 20.45 |
| WT_RNA | N/A |
| DW | N/A |
프라이머 세트의 특이도를 확인하기 위하여 뎅기 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 지카 바이러스, 일본뇌염 바이러스, SARS-CoV-2 야생형 및 오미크론 변이의 시료를 대상으로 RT-PCR을 수행하였다. 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트와 서열번호 3의 프로브로 이루어진 조성물에 대한 결과를 도 2 및 표 6에 나타내었고, 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 세트와 서열번호 6의 프로브로 이루어진 조성물에 대한 결과를 도 3 및 표 7에 나타내었다. 각 검체의 분양정보는 표 5에 나타낸 바와 같다.
| 검체 번호 | 검체명 | 분양 기관 |
| NCCP: 41501 | Dengue virus1 (RNA) | 국가병원체자원은행 |
| KBPV-VR-29D | Dengue virus2 (RNA) | 병원성바이러스은행 |
| KBPV-VR-30D | Dengue virus3 (RNA) | 병원성바이러스은행 |
| KBPV-VR-31D | Dengue virus4 (RNA) | 병원성바이러스은행 |
| KBPV-VR-27D | Japanese encephalitis virus (RNA) | 병원성바이러스은행 |
| NCCP: 43245 | Zika virus (RNA) | 국가병원체자원은행 |
| NCCP: 43132 | Chikungunya virus (RNA) | 국가병원체자원은행 |
| NCCP: 43329 | SARS-CoV-2 | 국가병원체자원은행 |
| 시료 | Ct[FAM] |
| Dengue 1 | N/A |
| Dengue 2 | N/A |
| Dengue 3 | N/A |
| Dengue 4 | N/A |
| Chikungunya | N/A |
| Zika | N/A |
| JEV | N/A |
| Wildtype | N/A |
| Omicron | 26.03 |
| DW | N/A |
| 시료 | Ct[FAM] |
| Dengue 1 | N/A |
| Dengue 2 | N/A |
| Dengue 3 | N/A |
| Dengue 4 | N/A |
| Chikungunya | N/A |
| Zika | N/A |
| JEV | N/A |
| Wildtype | N/A |
| Omicron | 25.42 |
| DW | N/A |
상기 표 6 및 표 7과 도 2 및 도 3에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 조성물들은 모두 유사한 호흡기 감염질환 유발 바이러스 및 SARS-CoV-2 야생형에서는 형광을 발현하지 않고, SARS-CoV-2 오미크론 변이만을 특이적으로 검출하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 검출한계 테스트
검출한계 농도를 확인하기 위하여 시료 농도를 달리하며 Ct값을 측정하였다. 먼저, 오미크론 변이 시료를 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트와 FAM 표지된 오미크론 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여 검출한 결과를 도 4 및 표 8에 나타내었다.
| 농도(copy/ul) | 시료 | Ct[FAM] |
| 1X107 | Omicron RNA |
21.32 |
| 1X106 | 24.20 | |
| 1X105 | 26.22 | |
| 1X104 | 29.32 | |
| 1X103 | 33.30 | |
| 1X102 | 36.06 | |
| 1X101 | 38.46 | |
| 1X100 | N/A | |
| DW | N/A |
검출한계 테스트 결과 상기 조성물의 경우, FAM 표지 오미크론 프로브는 40 cycle 내에 1x101 copy/ul 까지 검출이 되는 것을 확인하였다.
다음으로 오미크론 변이 시료를 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 세트와 FAM 표지된 오미크론 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여 검출한 결과를 도 5 및 표 9에 나타내었다.
| 농도(copy/ul) | 시료 | Ct[FAM] |
| 1X107 | Omicron RNA |
18.43 |
| 1X106 | 21.63 | |
| 1X105 | 24.76 | |
| 1X104 | 26.90 | |
| 1X103 | 28.19 | |
| 1X102 | 31.95 | |
| 1X101 | 34.32 | |
| 1X100 | 38.57 | |
| DW | N/A |
검출한계 테스트 결과 상기 조성물의 경우, FAM 표지 오미크론 프로브는 40 cycle 내에 1x101 copy/ul 까지 검출이 되어 높은 검출한계를 보여주었다.
다음으로 HEX 표지된 야생형 프로브의 검출한계를 상기와 같은 방법으로 확인하여 그 결과를 도 6 및 표 10에 나타내었다.
| 농도(copy/ul) | 시료 | Ct[HEX] |
| 1X107 | COVID-19 Wild type RNA |
16.19 |
| 1X106 | 19.59 | |
| 1X105 | 24.02 | |
| 1X104 | 25.94 | |
| 1X103 | 29.43 | |
| 1X102 | 32.24 | |
| 1X101 | 35.51 | |
| 1X100 | 38.17 | |
| DW | N/A |
검출한계 테스트 결과 HEX 표지 프로브는 40 cycle 내에 1x100 copy/ul 까지 검출이 되는 것을 확인하여 야생형 프로브 또한 높은 검출한계를 보여줌을 확인할 수 있었다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
<110> BIONICS Co., Ltd.
<120> Primers and probes for detecting corona virus omicron mutations
and uses thereof
<130> APC-2021-1050
<150> KR 10-2021-0176607
<151> 2021-12-10
<160> 7
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer S1 for SARS-CoV-2 omicron S gene
<400> 1
tcgaagaccc agtccctact 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer S1 for SARS-CoV-2 omicron S gene
<400> 2
accctgtttt ccttcaaggt c 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe S1 for SARS-CoV-2 omicron S gene
<400> 3
tgtaatgatc catttttgga ccaca 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer S2 for SARS-CoV-2 omicron S gene
<400> 4
tcagcctttt cttatggacc t 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer S2 for SARS-CoV-2 omicron S gene
<400> 5
caatggttct aaagccgaaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe S2 for SARS-CoV-2 omicron S gene
<400> 6
gcgtgagcca gaagatctcc 20
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe for SARS-CoV-2 wildtype S gene
<400> 7
gggtgtttat taccacaaaa acaacaa 27
Claims (14)
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트와 서열번호 3의 프로브를 포함하는, SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 조성물.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 3의 프로브는 5' 말단에 형광표지물질을 포함하는, SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 형광표지물질은 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 3의 프로브는 3' 말단에 소광자(quencher)를 포함하는, SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 및 아이오와 블랙(Iowa black)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 조성물.
- 제 3항의 조성물에 있어서, 서열번호 7의 프로브를 더 포함하는, SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 조성물.
- 제 7항에 있어서, 상기 서열번호 7의 프로브는 상기 서열번호 3의 프로브의 상기 형광표지물질과 서로 다른 형광표지물질을 포함하는, SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 조성물.
- 제 1항의 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 PCR 키트.
- 제 9항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 7의 프로브를 더 포함하는, SARS-CoV-2 오미크론 변이 검출용 PCR 키트.
- 대상체로부터 얻은 검체의 유전물질을 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트와 서열번호 3의 프로브를 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real time RT Polymerase Chain Reaction, rt-RT-PCR)을 수행하는 단계;
를 포함하는 SARS-CoV-2 오미크론 변이의 검출 방법.
- 삭제
- 제 11항에 있어서, 상기 검체는 대상체의 객담, 인두도말, 타액, 및 비강도말에서 선택되는 어느 하나 이상인, SARS-CoV-2 오미크론 변이의 검출 방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응은 서열번호 7의 프로브를 더 포함하여 수행되는 것인, SARS-CoV-2 오미크론 변이의 검출 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20210176607 | 2021-12-10 | ||
| KR1020210176607 | 2021-12-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102495807B1 true KR102495807B1 (ko) | 2023-02-06 |
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ID=85224063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220018356A KR102495807B1 (ko) | 2021-12-10 | 2022-02-11 | 코로나바이러스 오미크론 변이 검출용 프라이머와 프로브 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102495807B1 (ko) |
-
2022
- 2022-02-11 KR KR1020220018356A patent/KR102495807B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Erster 등, medRxiv, ‘SPECIFIC DETECTION OF SARS-COV-2 B.1.1.529 (OMICRON) VARIANT BY FOUR RT-qPCR DIFFERENTIAL ASSAYS’ (2021.12.07.)* * |
| GenBank Accession number: OL672836 (2021.11.30.)* * |
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|---|---|---|---|
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| GRNT | Written decision to grant |