CN114262758B

CN114262758B - 检测新型冠状病毒突变株的试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN114262758B
Application number: CN202210020398.XA
Authority: CN
Inventors: 范建; 蒋析文; 彭海龙; 莫斯喻
Original assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Current assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2024-04-05
Anticipated expiration: 2042-01-10
Also published as: CN114262758A

Abstract

本发明提供了检测新型冠状病毒及其突变株的试剂盒及检测方法，具体的地，本发明经过多轮筛选验证，从大量引物探针集合中获得了灵敏度高、特异性强、重复性好、对野生型新型冠状病毒无交叉反应，并且能够进行多重检测的引物探针集合，可以用于检测鉴定新型冠状病毒及其E484K、K417N突变。

Description

检测新型冠状病毒突变株的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术和分子诊断领域，具体地说，本发明涉及检测2019-nCoV新型冠状病毒E484K与K417N突变位点的核酸检测试剂盒及检测方法。

背景技术

新型冠状病毒临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。部分患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现，多在1周后恢复。多数患者预后良好，感染严重者可导致肺炎、严重畸形呼吸综合征、肾衰竭，更有甚者可导致死亡。这种新型冠状病毒(2019-nCoV)对人类具有有很强的感染力，所引起的肺部感染被命名为“新型冠状病毒肺炎”(NCIP)。

新型冠状病毒(2019-nCoV)属于β冠状病毒属成员，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，是目前已知的可以感染人的第7种冠状病毒。2019-nCoV作为一种RNA病毒，具有较高的突变率。随着突变株的越来越多，针对各突变型的鉴别需求，越来越大。目前传统的分离培养法培养检测2019新型冠状病毒耗时长、成本高，未能形成快速、完整的2019新型冠状病毒检测体系。因此，针对新型冠状病毒(2019-nCoV)以及各突变株有必要开发快速、灵敏、使用便捷的检测体系，以满足临床需要。

发明内容

本发明针对新型冠状病毒的E484K与K417N突变开发了检测的方法和试剂盒，以便能够高效率、高特异性、低成本的对感染患者进行检测。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒E484K与K417N突变的引物对集，所述引物对集包括：

第一引物对，所述第一引物对包括：

如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对集还包括：

第二引物对，所述第二引物对包括：

如SEQ ID NO.5所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.6所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对集还包括：

内标引物对，所述内标引物对包括：

如SEQ ID NO.9所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.10所示的反向引物。

本发明的第二方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒E484K与K417N突变的探针集，所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的第一探针；优选地，所述探针集还包括SEQ ID NO.3所示的封闭探针。

在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的第二探针；优选地，所述探针集还包括SEQ ID NO.7所示的封闭探针。

在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的内标探针。

在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团。

在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。

本发明的第三方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒E484K与K417N突变的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。

在另一优选例中，所述试剂盒包括引物探针混合液，所述引物探针混合液包括本发明第一方面所述的引物对集和本发明第二方面所述的探针集。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种成分：热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括阴性质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括阳性质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒中各引物和探针的浓度为0.1-1μM。

在另一优选例中，所述试剂盒中dNTPs浓度为0.2-0.4mM。

在另一优选例中，所述试剂盒中C-MMLV酶为1-3U，和/或热启动Taq酶为2.5-5U。

在另一优选例中，使用所述试剂盒过程中，配制RT-PCR反应体系中各引物和探针的浓度为0.1-1μM。

在另一优选例中，所述试剂盒中配制RT-PCR反应体系中各引物和探针的浓度为0.1-1μM。

在另一优选例中，所述试剂盒中配制RT-PCR反应体系中dNTPs浓度为0.2-0.4mM。

在另一优选例中，所述试剂盒中配制RT-PCR反应体系中C-MMLV酶为1-3U，和/或热启动Taq酶为2.5-5U。

本发明的第四方面，提供了一种检测新型冠状病毒E484K与K417N突变的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测对象的核酸样本；

(2)制备RT-PCR反应体系并进行RT-PCR检测：

其中，所述RT-PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针集。

在另一优选例中，所述核酸样本可来自咽拭子样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、痰液样本、粪便样本或环境样本。

在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。

在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。

在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括PCR反应酶系。

本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒E484K与K417N突变。

在另一优选例中，所述PCR为RT-PCR。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了K417N引物探针灵敏度检测(FAM通道)结果。

图2显示了E484K引物探针灵敏度检测(Texas Red通道)结果。

图3显示了内标通道测试结果(Cy5通道)。

图4显示了K417N突变位点的特异性检测(FAM通道)的检测结果。

图5显示了E484K突变位点的特异性检测(Texas Red通道)的检测结果。

图6显示了K417N和E484K突变位点双重检测特异性测试结果。

图7显示了内标通道测试结果。

图8显示了K417N和E484K突变位点双重检测干扰物质测试(FAM通道)。

图9显示了K417N和E484K突变位点双重检测干扰物质测试(Texas Red通道)。

图10：对照引物对K417N-F2和K417N-R2的检测结果。

图11：对照引物对K417N-F3和K417N-R的检测结果。

图12：对照引物对E484K-F2和E484K-R2的检测结果。

图13：对照引物对E484K-F3和E484K-R的检测结果。

图14：K417N和E484K突变位点双重检试剂盒精密度测试结果(FAM通道)。

图15：K417N和E484K突变位点双重检试剂盒精密度测试结果(Texas Red通道)。

具体实施方式

实时荧光RT-PCR是冠状病毒核酸检测常用方法之一，在医学和分子生物学领域已经得到了广泛应用。本发明针对新型冠状病毒K417N、E484K突变位点开发诊断试剂，目的在于提供一种新型冠状病毒K417N、E484K突变位点的检测试剂盒，以便能够高效率、高特异性、低成本的对新型冠状病毒突变株进行鉴别。本发明试剂盒同时包括内源性内标检测系统，用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程的监控，可减少假阴性结果的出现。本试剂盒具有抗干扰能力强、灵敏度高、特异性强、重复性好等特点。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

实时荧光PCR是基于荧光共振能量转移(FRET)原理的技术。其中，以TaqMan荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术利用热稳定DNA聚合酶Taq酶在具有5’-3’方向的聚合酶活性的同时，还具有对聚合延伸过程中遇到的与靶序列结合的核苷酸序列的5’-3’方向的核酸外切酶活性。TaqMan荧光探针在5’和3’端分别标记荧光发射基团和淬灭基团，探针的3’末端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用即被解除，荧光发射基团发射波长处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动至探针位置时，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性能降解特异性荧光标记探针，荧光报告基团和淬灭基团分离，荧光发射出来。

确诊感染新型冠状病毒主要的方法为核酸检测，但是，目前市面上的核酸检测试剂盒多用于检测野生型新型冠状病毒缺乏突变型新型冠状病毒检测产品，突变型的新型冠状病毒更具传染性。现阶段，检测新型冠状病毒是否发生突变主要依赖于基因测序。但是，对目前爆发的疫情来说，基因测序需考虑专家人员、测序设备，以及处理和存储数据所需的计算架构，同时基因测序涉及的成本和工作量都是巨大的，这是基因测序的局限性。而荧光PCR法在检测上可以弥补这些不足。

多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

影响多重PCR反应的因素有很多，比如：

(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。

(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。

(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。

(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。

虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。

本发明提供一种特异性检测新型冠状病毒核酸样品中K417N和E484K突变位点的PCR反应引物和探针组合，包括：

用于检测K417N突变位点的引物序列：

SEQ ID NO.1:5’-CTCCAGGGCAAACTGGAGAT-3’和

SEQ ID NO.2:5’-ACCAACCTTAGAATCAAGATTGTTAGA-3’，

K417N野生型blocker序列：

SEQ ID NO.3:5’-CAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGA-3’，

对应的检测探针的序列和标记为：

SEQ ID NO.4:5’FAM-CAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCT-eclipse-3’；

用于检测E484K突变位点的引物序列：

SEQ ID NO.5：5’-GTAAAGGAAAGTAACAATTAAAACCATT-3’和

SEQ ID NO.6:5’-TTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAA-3’，

E484K野生型blocker的序列：

SEQ ID NO.7：5’-TTAAAACCTTCAACACCATTACAA-3’，

对应的检测探针的序列和标记为：

SEQ ID NO.8：5’TEXAS RED-CATTACAAGGTGTGCTACCGGCCTG-eclipse-3’。

在一个实施例中，所述试剂盒还包括内标质控扩增引物和检测探针；内标质控扩增引物序列：

SEQ ID NO.9:5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC-3’和

SEQ ID NO.10:5’-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’

对应的检测探针的序列和标记为：

SEQ ID NO.11：5’Cy5-AACAGCGACACCCACTCCTCCACCT-BHQ2-3’。

内标既可监测样本采集，也可监测样本提取过程，防止样本核酸提取失败导致假阴性。本发明对病原体的探针标记不限于列出的同一波长的单个标记，包括不同标记的不同组合形式的多重检测试剂。

在一个优选地实施方式中，所述试剂盒中包括灭活的K417N和E484K突变位点假病毒阳性对照、以及灭菌生理盐水的阴性对照。

在一个优选地实施方式中，所述试剂盒PCR反应管包括含有K417N和E484K突变位点以及内标基因引物、探针，dNTPs及PCR缓冲液的PCR反应液,其中引物和探针的浓度为0.1-1μM，MgCl₂浓度为2-5mM。

在一个优选地实施方式中，所述试剂盒还提供含有热启动Taq酶和C-MMLV酶的PCR酶系，其中dNTPs浓度为0.2-0.4mM，C-MMLV酶为1-3U，热启动Taq酶为2.5-5U。

本发明提供的新型冠状病毒K417N和E484K突变位点检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

提取待测样本(提取试剂采用广州达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20170583号)，得到核酸样本(阳性质控和阴性质控同步参与提取)；取5μL加入到上述PCR反应液(17μL)和酶系混合物(3μL)中，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择FAM、Texas red和Cy5,PCR扩增程序如下；

50℃，2min，95℃，5min；1个循环

95℃，5sec，60℃，35sec；10个循环。

95℃，5sec，60℃，35sec(收集荧光)；35个循环。

PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体RNA的阴、阳性，检测结果可用于新型冠状病毒突变株的鉴别，为研究提供可靠的依据。

本发明的有益效果在于：

(1)使用本发明的试剂盒及检测方法，可以用于检测鉴定新型冠状病毒K417N和E484K突变。

(2)本发明的检测试剂盒，检测新型冠状病毒K417N和E484K突变的灵敏度高、特异性强。

(3)本发明经过多轮筛选验证，从大量引物探针集合中获得了对野生型毒株无交叉反应的引物探针组合，并且能够进行多重检测，显著提高了K417N和E484K突变的检测准确率和检测效率。

(4)本发明的检测试剂盒抗干扰能力极强，能够显著降低假阴性风险。

本发明适用于对新型冠状病毒的检测，为病毒鉴定分型和防控提供可靠的依据，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在疫情防控过程中，使用本发明的检测方法对环境中的病毒核酸进行检测，这些病毒核酸信息可以作为公众健康管理之需。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1试剂盒及检测方法

根据新型冠状病毒序列，分析其基因组的保守区域，根据K417N和E484K突变位点进行引物探针的设计。为了对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程进行监控，还设计了内源性内标引物和探针。通过多轮筛选和优化，最终确定一套灵敏度和特异性最优的引物和探针组合。序列如表1所示：

表1.试剂盒序列

其中，K417N-P1的5’端荧光发射基团为FAM，3’淬灭基团为eclipse；E484K-P1的5’端荧光发射基团为TEXAS RED，3’淬灭基团为eclipse；内标-P的5’端荧光发射基团为CY5，3’淬灭基团为BHQ2。

检测体系中引物和探针的浓度为0.2μM，MgCl₂浓度为3mM，待检样本核酸5μL。PCR酶系为热启动Taq酶和C-MMLV酶，C-MMLV酶为2U，热启动Taq酶为3U。体系中dNTPs浓度为0.3mM。

试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

提取待测样本(提取试剂采用广州达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20170583号)，得到核酸样本(阳性质控和阴性质控同步参与提取)；取5μL核酸样本加入到上述PCR反应液(引物探针混合液)和酶系混合物中，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择FAM、Texas red和Cy5,PCR扩增程序如下；

50℃，2min，95℃，5min；1个循环

95℃，5sec，60℃，35sec；10个循环。

95℃，5sec，60℃，35sec(收集荧光)；35个循环。

PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体RNA的阴、阳性，检测结果可用于野生型新型冠状病毒感染或突变株感染的辅助诊断以及药物疗效的观察，为研究提供可靠的依据。

实施例2灵敏度测试

将以已定值的K417N和E484K假病毒做为初始样本分别稀释至浓度为10⁶copies/ml，依次稀释至10⁴、10³、500、200、100copies/ml，各浓度样本中分别加入终浓度为10⁴copies/ml的含内标扩增片段的假病毒作为待检样本，测试检测试剂的灵敏度。

图1显示了K417N引物探针灵敏度检测(FAM通道)，由左至右分别为10⁴、10³、500、200copies/ml；

图2显示了E484K引物探针灵敏度检测(Texas Red通道)，由左至右分别为10⁴、10³、500、200copies/ml；

图3显示了内标通道测试结果(Cy5通道)。

检测结果表明，针对各靶标灵敏度可达200copies/ml。

实施例3特异性测试

在检测体系中添加不同的封闭探针，以10⁵copies/ml的野生型假病毒作为待检样本测试检测试剂的特异性。

由于野生型和突变株的基因序列及其接近，因此设计并筛选出能够显著区分野生型和突变株的封闭探针，难度较大。

将以106copies/ml的野生型K417N突变位点假病毒作为待检样本测试检测试剂的特异性。

图4显示了K417N突变位点的特异性检测(FAM通道)的检测结果，结果表明在添加K417N-S1封闭探针的情况，针对野生型的检测取得了良好的特异性。

将以10⁶copies/ml的野生型E484K突变位点假病毒作为待检样本测试检测试剂的特异性。

图5显示了E484K突变位点的特异性检测(Texas Red通道)的检测结果，结果表明在添加E484K-S1封闭探针的情况，针对野生型的检测取得了良好的特异性。

以生理盐水、SARS假病毒、鼻病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、冠状病毒OC43、呼吸道合胞病毒、人类冠状病毒NL63型、人类冠状病毒HKU1型作为特异性参考品，测试K417N和E484K双重检测的特异性。

图6显示了K417N和E484K突变位点双重检测特异性测试结果，显示具有良好的特异性。

图7显示了内标通道测试结果，表明检测程序正常。

实施例4抗干扰物测试

大量临床检测表明，临床样本中存在的干扰物质对检测结果会产生影响，导致检测结果出现波动，灵敏度降低甚至出现假阴性的情况。例如，临床检测普遍使用的咽拭子样本，有时会存在血液污染。需要使用检测试剂对血液污染样本进行检测，验证其抗干扰能力。

由于新型冠状病毒和其突变株的基因序列差异极小，因此开发能够准确识别新型冠状病毒突变株的检测试剂难度较大，很容易出现对野生型新型冠状病毒的交叉反应。而且随着临床监测中假阴性情况的出现，临床中需要抗干扰性能更强的检测试剂，因此需要验证试剂盒检测试剂的抗干扰能力，以获得抗干扰能力较强的检测试剂组合。

分别向K417N和E484K突变位点假病毒中加入5％含量的全血，5％的粘液、利巴韦林(1mg/mL)、青霉素(0.5mg/ml)、四环素(5mg/L)、氧氟沙星(3.06mg/L)、阿奇霉素(0.45mg/L)作为干扰物质测试样本，以不含干扰物质的样本作为对照，测试干扰物质对引物探针扩增的影响。

测试结果表明，所设计的数十组引物探针组合中，对添加全血、或粘液的样本大部分引物探针组合的灵敏度显著降低。本发明的引物探针组合的测试结果(500copies/ml)如图8、图9所示。

图8显示了K417N和E484K突变位点双重检测干扰物质测试FAM通道检测结果，表明在干扰物质存在下，仍然能够正常检测。

图9显示了K417N和E484K突变位点双重检测干扰物质测试Texas Red通道检测结果，表明在干扰物质存在下，仍然能够正常检测。

添加全血后的灵敏度测试表明，本发明的引物探针组合的灵敏度仍然能够达到200copies/ml。

检测K417N基因的对照引物对K417N-F2和K417N-R2在常规样本中检测灵敏度可达200copies/ml，其针对含全血样本的灵敏度检测结果如图10所示(由左至右分别为10⁶、10⁵、10⁴、10³copies/ml)，结果表明对照引物对K417N-F2和K417N-R2针对含全血样本的灵敏度显著降低。

检测K417N基因的对照引物对K417N-F3和K417N-R3在常规样本中检测灵敏度可达200copies/ml，其针对含全血样本的灵敏度检测结果如图11所示(由左至右分别为10⁶、10⁵、10⁴、10³copies/ml)，结果表明对照引物对K417N-F3和K417N-R3针对含全血样本的灵敏度同样显著降低。

检测E484K突变位点的对照引物对E484K-F2和E484K-R2在常规样本中检测灵敏度可达500copies/ml，其针对含全血样本的灵敏度检测结果如图12所示(由左至右分别为10⁵、10⁴、10³、500copies/ml)，结果表明对照引物对E484K-F2和E484K-R2针对含全血样本的灵敏度显著降低。

检测E484K突变位点的对照引物对E484K-F3和E484K-R3在常规样本中检测灵敏度可达200copies/ml，其针对含全血样本的灵敏度检测结果如图13所示(由左至右分别为10⁵、10⁴、10³、500copies/ml)，结果表明对照引物对E484K-F3和E484K-R3针对含全血样本的灵敏度显著降低。

各对照引物对针对含血液样本的抗干扰能力较差，在实际使用过程中，容易出现假阴性的检测结果。因此，不适合在临床中使用。

实施例5精密度测试

分别将K417N和E484K突变位点假病毒稀释至10⁴copies/ml和500copies/ml作为精密度参考品，分别重复10次，计算各浓度精密度参考品的变异系数。

图14显示了K417N和E484K突变位点双重检试剂盒精密度测试结果(FAM通道)，结果表明本发明试剂盒具有优异的精密度。

图15显示了K417N和E484K突变位点双重检试剂盒精密度测试结果(Texas Red通道)，结果表明本发明试剂盒具有优异的精密度。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 广州达安基因股份有限公司

<120> 检测新型冠状病毒突变株的试剂盒及检测方法

<130> 020092

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ctccagggca aactggagat 20

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

accaacctta gaatcaagat tgttaga 27

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cagggcaaac tggaaagatt gctga 25

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cagatgattt tacaggctgc gttatagct 29

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gtaaaggaaa gtaacaatta aaaccatt 28

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ttttgagaga gatatttcaa ctgaaa 26

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ttaaaacctt caacaccatt acaa 24

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

cattacaagg tgtgctaccg gcctg 25

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

ccaggtggtc tcctctgact tc 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

gtggtcgttg agggcaatg 19

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

aacagcgaca cccactcctc cacct 25

Claims

1.一种用于检测新型冠状病毒E484K与K417N突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对集和探针集，所述引物对集包括第一引物对、第二引物对和内标引物对：

所述第一引物对包括：

如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；

所述第二引物对包括：

如SEQ ID NO.5所示的正向引物和如SEQ ID NO.6所示的反向引物；

所述内标引物对包括：

如SEQ ID NO.9所示的正向引物和如SEQ ID NO.10所示的反向引物；

所述探针集包括如SEQ ID NO.4所示的第一探针、如SEQ ID NO.3所示的封闭探针、如SEQ ID NO.8所示的第二探针、如SEQ ID NO.7所示的封闭探针和如SEQ ID NO.11所示的内标探针。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物探针混合液，所述引物探针混合液包括所述的引物对集和所述的探针集。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种成分：热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品。

6.一种非诊断目的的检测新型冠状病毒E484K与K417N突变的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测对象的核酸样本；

(2)制备RT-PCR反应体系并进行RT-PCR检测：

其中，所述RT-PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、引物对集和探针集，所述引物对集包括第一引物对、第二引物对和内标引物对：

所述第一引物对包括：

如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；

所述第二引物对包括：

如SEQ ID NO.5所示的正向引物和如SEQ ID NO.6所示的反向引物；

所述内标引物对包括：

如SEQ ID NO.9所示的正向引物和如SEQ ID NO.10所示的反向引物；

7.引物对集和探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒E484K与K417N突变；

所述引物对集包括第一引物对、第二引物对和内标引物对：

所述第一引物对包括：

如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；

所述第二引物对包括：

如SEQ ID NO.5所示的正向引物和如SEQ ID NO.6所示的反向引物；

所述内标引物对包括：

如SEQ ID NO.9所示的正向引物和如SEQ ID NO.10所示的反向引物；