CN113846185A

CN113846185A - 一种用于新冠病毒e484k/q、k417n/t变异快速检测的引物组合物和试剂盒

Info

Publication number: CN113846185A
Application number: CN202110770784.6A
Authority: CN
Inventors: 曹国君; 关明; 邢志芳; 许笑; 唐雪梅; 马艳春
Original assignee: North Campus Huashan Hospital Affiliated To Fudan University
Current assignee: North Campus Huashan Hospital Affiliated To Fudan University
Priority date: 2021-07-07
Filing date: 2021-07-07
Publication date: 2021-12-28

Abstract

本发明提供了一种用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T变异快速检测的引物组合物和试剂盒。该引物组合物包括检测E484K/Q的引物体系和检测K417N/T的引物体系；该检测E484K/Q的引物体系包括序列为SEQ ID NO.2～6或SEQ IDNO.2～5、8的引物以及序列为SEQ ID NO.7的探针；该检测K417N/T的引物体系包括序列为SEQ ID NO.10～14或SEQ ID NO.10～13、16的引物以及序列为SEQ ID NO.15的探针。本发明提供的引物组合物和试剂盒灵敏度高、特异性高，不受退火温度的限制，易于实现多靶标的同步检测，此外，无需复杂、昂贵的辅助设备，在30‑60min内即可准确检测出Delta变异株，目前市场上少有可以进行相关突变快速检测的试剂盒，具有良好的应用前景。

Description

一种用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T变异快速检测的引物组合物和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T 变异快速检测的引物组合物和试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒是冠状病毒科、单股正链RNA病毒。与以往的病毒感染不同，新型冠状病毒感染初期在患者体内大量复制，但并不会引起宿主明显的炎症反应，因此患者根本无法意识到自己已被感染，然而此时的患者已经具有传染性，从而导致周围的人也被感染，造成疫情大规模肆虐。目前新型冠状病毒疫苗的广泛使用，对于疫情的成功防控发挥了重要的作用，然而目前的疫苗仍处于不断完善阶段，即使接种了疫苗也不能保证不会再被新型冠状病毒感染，而且针对新型冠状病毒的特效药缺乏。因此，对新型冠状病毒进行准确、快速的检测，及时切断传染源仍然是目前疫情防控的最主要手段之一。

新型冠状病毒是一种RNA病毒，极易发生变异，刺突糖蛋白(S蛋白)是新型冠状病毒与宿主受体(ACE2)结合的关键蛋白，其变异对于病毒的传播速度和免疫逃逸有重要的影响，当前发生于S蛋白的重要变异有N501Y、D614G、 P681H、E484K、K417N、L452R和P681R等。目前新型冠状病毒的变异株主要分为三大类：关注的变异株(variant of concern,VOC)、感兴趣的变异株(variant of interest，VOI)或正调查的变异株(variant underinvestigation，VUI)、监控的变异株(variant under monitoring，VUM)。据报道，新型冠状病毒的VOC变异株传播速度显著增快，例如英国Alpha变异株(B.1.1.7)传染性增加56％，南非 Beta变异株(B.1.351)传染性也显著增加，巴西Gamma变异株传染性增加1.4-2.2 倍，印度Delta变异株(B.1.617.2)传染性提高100％，秘鲁Lambda变异株(C.37) 传染性和疫苗的抵抗力可能变强。其中目前传染速度最快的VOC是Delta变异株(B.1.617.2，印度变异株)，Delta变异株感染具有感染者病毒载量高、传播速度快(10天左右传播5代)、患者病情进展迅速、核酸转阴时间长等新特点，因此，准确的检测出新型冠状病毒并对其进行准确分型，及时了解新型冠状病毒的动态变化，对于新冠肺炎的诊断、疫情的防控和相关政策的制定具有重要意义。世界卫生组织专家称：Delta变异株正成为全球主要流行的变异毒株，而目前市场上少有可以进行相关突变快速检测的试剂盒。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种用于新冠病毒E484K/Q、 K417N/T变异快速检测的引物组合物和试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T变异快速检测的引物组合物，其包括检测E484K/Q的引物体系和检测K417N/T的引物体系；

该检测E484K/Q的引物体系包括序列为SEQ ID NO.2～6或SEQ ID NO.2～5、 8的引物以及序列为SEQ ID NO.7的探针；

该检测K417N/T的引物体系包括序列为SEQ ID NO.10～14或SEQ ID NO. 10～13、16的引物以及序列为SEQ ID NO.15的探针。

进一步地，设计检测E484K/Q的引物体系所针对的靶片段的序列如SEQ ID NO.1所示；设计检测K417N/T的引物体系所针对的靶片段的序列如SEQ ID NO. 9所示。

本发明的第二方面是提供一种用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T变异快速检测的试剂盒，其包括上述引物组合物。

进一步地，上述试剂盒还包括反应缓冲液、酶溶液、SYBR Green荧光染料和去离子水。

进一步地，上述试剂盒在检测E484K/Q或K417N/T变异时，所采用的扩增体系的总体积为25μL，包括：2×反应缓冲液12.5μL，引物F3 1μL，引物B31μL，引物FIP 1μL，引物BIP1μL，引物LF/LB1μL，探针1μL，酶溶液1μL，SYBR Green荧光染料1μL，模板2μL，去离子水将终体积补足至25μL。

进一步地，在上述扩增体系中，引物F3和B3的终浓度为0.2μmol/L，引物 FIP和BIP的终浓度为1.6μmol/L，引物LF/LB的终浓度为0.8μmol/L，探针的终浓度为0.8μmol/L；酶溶液的浓度8U。

进一步地，上述试剂盒在检测E484K/Q或K417N/T变异时，所采用的LAMP 反应程序为：58℃-68℃，70min(每个循环1min，扩增70个循环)。

进一步地，上述试剂盒在检测E484K/Q或K417N/T变异时，结果判读的标准为：CT值<50或50min内出扩增曲线，即判断为阳性。

本发明的第三方面是提供一种采用上述试剂盒的用于新冠病毒E484K/Q、 K417N/T变异快速检测的方法。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的引物组合物和试剂盒灵敏度高、特异性高，不受退火温度的限制，易于实现多靶标的同步检测，此外，无需复杂、昂贵的辅助设备，在30-60min 内即可准确检测出Delta变异株，目前市场上少有可以进行相关突变快速检测的试剂盒，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明一实施例中验证E484K/Q(图A)和K417N/T(图B)LAMP 检测体系的灵敏度的结果；其中，图中的扩增曲线从右向左，对应的模拟样本浓度分别为：2×10²copies/ml，2×10³copies/ml，2×10⁴copies/ml，2×10⁵copies/ml， 2×10⁶copies/ml；

图2是本发明一实施例中验证E484K/Q(图A)和K417N/T(图B)LAMP 检测体系的特异性的结果。

具体实施方式

本发明基于LAMP技术开发了一种针对Delta变异株的特征性新突变 (E484K/Q和K417N/T)进行快速检测和鉴定的引物组合物及试剂盒。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例提供了一种用于新冠病毒株B.1.617.2中的E484K/Q、K417N/T变异快速检测的引物组合物，该引物组合物包括发明人设计的特异性LAMP引物和PNA探针以对扩增体系中的非特异性模板(野生型核酸)进行封闭，提高 LAMP检测体系的特异性。

该引物组合物包括针对E484K/Q变异的LAMP引物和探针(如下表1)， E484K/Q变异靶片段(401bp，野生型)为：

ATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTAT AGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACC TGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTC AACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTT TAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTG GTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACC AGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATG TGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGT(SEQ ID NO.1)，其中，E484K的碱基突变位点为G23012A，E484Q的碱基突变位点为G23012C。

表1针对E484K/Q变异的LAMP引物和探针信息

该引物组合物包括针对K417N/T变异的LAMP引物和探针(如下表2)， K417N/T变异靶片段(401bp，野生型)为：

GTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTAT TCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTC TCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGT AATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGA TTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCT TGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTA TAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACT GAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGT(SEQ ID NO.9)，其中，K417N/T的碱基突变类型为AAG>AAT/AAC/ACG。

表2针对K417N/T变异的LAMP引物和探针信息

实施例2

本实施例提供了一种用于新冠病毒株B.1.617.2中的E484K/Q、K417N/T变异快速检测的试剂盒，其包括实施例1中的LAMP引物和探针。

采用该试剂盒检测E484K/Q或K417N/T变异时，所采用的扩增体系的总体积为25μL，包括：2×反应缓冲液(RM)12.5μL，引物F3 1μL(终浓度0.2μmol/L)，引物B31μL(终浓度0.2μmol/L)，引物FIP 1μL(终浓度1.6μmol/L)，引物BIP 1μL(终浓度1.6μmol/L)，引物LF/LB1μL(终浓度0.8μmol/L)，PNA1μL(终浓度0.8μmol/L)，酶溶液1μL(8U)，SYBR Green荧光染料1μL，模板2μL，去离子水将终体积补足至25μL；

所采用的LAMP反应程序为：58℃-68℃,70min(每个循环1min，扩增70 个循环)；所用的设备为实时PCR仪；

结果判断：CT值<50或50min内出扩增曲线，即判断为阳性。

验证实施例

本实施例对实施例2提供的试剂盒(均以表1和表2中的引物体系1为例) 进行性能检测，具体的检测过程和结果如下：

1.灵敏度：制作梯度浓度的模拟样本，具体浓度为2×10¹copies/ml， 2×10²copies/ml，2×10³copies/ml，2×10⁴copies/ml，2×10⁵copies/ml，2×10⁶copies/ml，用所建立的LAMP体系进行检测，实验结果如图1-2所示。由结果表明E484K/Q 和K417N/TLAMP检测体系的灵敏度均可达2×10²copies/ml。

2.特异性：采用所建立的LAMP体系对临床常见的呼吸道病原甲型流感病毒RNA、乙型流感病毒RNA、鼻病毒RNA、呼吸道合胞病毒RNA、肠道病毒 RNA和野生型新型冠状病毒模拟样本RNA进行扩增，仅阳性对照样本出现了扩增曲线，其他样本均为出现任何扩增，表明所建立的E484K/Q和K417N/T LAMP 检测体系具有良好的特异性(如图2)。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 复旦大学附属华山医院北院

<120> 一种用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T变异快速检测的引物组合物和试剂盒

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 401

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

attgctgatt ataattataa attaccagat gattttacag gctgcgttat agcttggaat 60

tctaacaatc ttgattctaa ggttggtggt aattataatt acctgtatag attgtttagg 120

aagtctaatc tcaaaccttt tgagagagat atttcaactg aaatctatca ggccggtagc 180

acaccttgta atggtgttga aggttttaat tgttactttc ctttacaatc atatggtttc 240

caacccacta atggtgttgg ttaccaacca tacagagtag tagtactttc ttttgaactt 300

ctacatgcac cagcaactgt ttgtggacct aaaaagtcta ctaatttggt taaaaacaaa 360

tgtgtcaatt tcaacttcaa tggtttaaca ggcacaggtg t 401

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

acaatcttga ttctaaggtt gg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

actctgtatg gttggtaacc 20

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cggcctgata gatttcagtt gaaatttacc tgtatagatt gtttaggaag 50

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gtagcacacc ttgtaatggt gtcaccatta gtgggttgga 40

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ctctctcaaa aggtttgaga ttag 24

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

taccacaact tccaa 15

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ctctctcaaa aggtttgaga tt 22

<210> 9

<211> 401

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gtttatgctt ggaacaggaa gagaatcagc aactgtgttg ctgattattc tgtcctatat 60

aattccgcat cattttccac ttttaagtgt tatggagtgt ctcctactaa attaaatgat 120

ctctgcttta ctaatgtcta tgcagattca tttgtaatta gaggtgatga agtcagacaa 180

atcgctccag ggcaaactgg aaagattgct gattataatt ataaattacc agatgatttt 240

acaggctgcg ttatagcttg gaattctaac aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat 300

aattacctgt atagattgtt taggaagtct aatctcaaac cttttgagag agatatttca 360

actgaaatct atcaggccgg tagcacacct tgtaatggtg t 401

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tgatctctgc tttactaatg tc 22

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gagattagac ttcctaaaca atc 23

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gtttgccctg gagcgatttt atgcagattc atttgtaatt agagg 45

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

taccagatga ttttacaggc tccaccaacc ttagaatcaa ga 42

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gcgttatagc ttggaattct aac 23

<210> 15

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

tgacctttct aacga 15

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gcgttatagc ttggaattct aaca 24

Claims

1.一种用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T变异快速检测的引物组合物，其特征在于，包括检测E484K/Q的引物体系和检测K417N/T的引物体系；

所述检测E484K/Q的引物体系包括序列为SEQ ID NO.2～6或SEQ ID NO.2～5、8的引物以及序列为SEQ ID NO.7的探针；

所述检测K417N/T的引物体系包括序列为SEQ ID NO.10～14或SEQ ID NO.10～13、16的引物以及序列为SEQ ID NO.15的探针。

2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，设计所述检测E484K/Q的引物体系所针对的靶片段的序列如SEQ ID NO.1所示；设计所述检测K417N/T的引物体系所针对的靶片段的序列如SEQ ID NO.9所示。

3.一种用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T变异快速检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物组合物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应缓冲液、酶溶液、SYBR Green荧光染料和去离子水。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒在检测E484K/Q或K417N/T变异时，所采用的扩增体系的总体积为25μL，包括：2×反应缓冲液12.5μL，引物F3 1μL，引物B31μL，引物FIP 1μL，引物BIP 1μL，引物LF/LB 1μL，探针1μL，酶溶液1μL，SYBR Green荧光染料1μL，模板2μL，去离子水将终体积补足至25μL。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，在所述扩增体系中，引物F3和B3的终浓度为0.2μmol/L，引物FIP和BIP的终浓度为1.6μmol/L，引物LF/LB的终浓度为0.8μmol/L，探针的终浓度为0.8μmol/L；酶溶液的浓度8U。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在检测E484K/Q或K417N/T变异时，所采用的LAMP反应程序为：58℃-68℃，70min。

8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在检测E484K/Q或K417N/T变异时，结果判读的标准为：CT值<50或50min内出扩增曲线，即判断为阳性。

9.一种采用如权利要求3-8任一项所述试剂盒的用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T变异快速检测的方法。