CN113046475B - 一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒，该引物组合物包括针对P681H突变位点的引物组合物和/或针对Y144del突变位点的引物组合物，针对P681H突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO：8所示的PNA探针和选自包括序列如SEQ ID NO：2～7的组合物、包括序列如SEQID NO：10、14～18的组合物中的一组或者两组引物组；针对Y144del突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO：20～24的引物和序列如SEQ ID NO：25的PNA探针。本发明基于LAMP技术提供了一种快速检测B.1.1.7新型冠状病毒突变株的引物组合物及试剂盒，特异性好、灵敏度高，无需复杂、昂贵的辅助设备，在30‑60min内即可实现核酸分子标志物的快速检测，检测结果可以通过目视法直接判断，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒。
背景技术
冠状病毒(Coronavirus，CoV)，因其包膜表面有一圈形似日冕的棘突而得名，广泛存在于自然界中，是一种呼吸道病毒，其宿主包括人类、脊椎动物和无脊椎动物。冠状病毒属套氏病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属，为有包膜的正股单链RNA病毒，直径为80～120nm，约有3万个碱基组成，其遗传物质是已知RNA病毒中最大的。国际病毒分类命名委员会在2012年根据其遗传学差异和血清学特性将冠状病毒分为α、β、γ、δ四群，其中β群CoV又进一步分为A、B、 C、D四个组。α、β两群易感染哺乳动物，包含了7种对人类致病的冠状病毒，分别为HCoV-OC43、HCoV-229E、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、 MERS-CoV和SARS-CoV-2；而γ、δ两群则主要感染禽类。冠状病毒是一种常见的、易引发呼吸道疾病的病原体，在引起成人社区获得性肺炎的病毒中，冠状病毒检出率与其他呼吸道病毒的检出率相似。SARS-CoV-2感染不仅会对人类的生命安全构成威胁，还会对全球社会经济造成极大损失，我们需要“未雨绸缪”，积极应对，对其流行病学和致病机制进行深入研究，积极研发新型特效药和疫苗，并开发出更有效的检测手段，把冠状病毒扼杀于“摇篮”阶段，为人类的健康保驾护航。
由于病毒自身的结构特征及宿主众多，导致该病毒极易发生变异，产生新类型的冠状病毒突变体，例如英国科学家发现了一种被称为B.1.1.7的新冠病毒变种，变异病毒与人受体亲和力提高了1000倍，变异病毒传播能力要比原始毒株高70％左右，而伦敦最近新冠感染病例超过60％都来自变异病毒，“超级传播者”被频繁报道，给疾病的防治带来了极大难度。变异新冠病毒不会增加疾病严重性，但其会导致更高的发病率，产生更多住院及死亡病例，所以需要采取更严格的公共卫生措施来控制这些变异病毒的传播，确保新冠肺炎“可防、可控、可治”，因此快速检测SARS-CoV-2，及时了解病毒株的主流突变情况，对于疫情的防控、疾病的诊疗和疫苗的研发等均具有重要的意义。其中，新型冠状病毒S 蛋白上的P681H和Y144del突变与病毒感染宿主细胞的能力密切相关。
目前逆转录实时PCR技术被认为是SARS-CoV-2检测“金标准”，然而该技术操作复杂，扩增速度较慢(2-3个小时)，需要在要求较高的实验室内才能进行，所需的检测设备价格昂贵，而且需要训练有素的专业技术人员才能进行检测，导致该技术难以推广，尤其是基础设施薄弱、偏远落后的地区难以推广。而环介导等温扩增技术(LAMP)是利用设计的四对特殊引物和具有连置换活性的 Bst DNA聚合酶(具有链置换特性)，在60-65℃恒温条件下进行特异、高效、快速的扩增靶核酸。本发明拟提供了一种试剂盒，采用LAMP的方法，可以同时实现新型冠状病毒S蛋白上P681H和Y144del两个重要突变位点的检测，达到快速鉴别B.1.1.7新型冠状病毒突变株的目的。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物，包括针对P681H突变位点的引物组合物和/或针对Y144del突变位点的引物组合物；该针对P681H突变位点的引物组合物包括引物组和PNA探针；该PNA探针的序列如SEQ ID NO：8所示；
上述引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LB引物和LF引物，选自包括序列如SEQ ID NO：2～7的组合物、包括序列如SEQ ID NO：10、 14～18的组合物中的一组或者两组；或
上述引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物和LB引物，包括序列如SEQ IDNO：9～13的引物；
上述针对Y144del突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO：20～24的引物和序列如SEQ ID NO：25的PNA探针。
进一步地，上述针对P681H突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO： 2～7的引物和序列如SEQ ID NO：8所示的PNA探针。
进一步地，上述针对P681H突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO： 9～13的引物和序列如SEQ ID NO：8所示的PNA探针。
进一步地，上述针对P681H突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO： 10、14～18的引物和序列如SEQ ID NO：8所示的PNA探针。
第二方面，本发明提供了包括上述引物组合物的快速检测突变型新型冠状病毒的扩增体系，其还包括模板、反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和/或荧光染料以及去离子水。
进一步地，在上述扩增体系中，F3引物和B3引物的终浓度为0.2μmol/L； FIP引物和BIP引物的终浓度为1.6μmol/L；LB引物和LF引物的终浓度为0.8 μmol/L；PNA探针的终浓度为0.8μmol/L。
进一步地，总体积为25μL的扩增体系包括如下组分：2×反应缓冲液12.5μL， F3引物1μL，B3引物1μL，FIP引物1μL，BIP引物1μL，LB引物1μL，LF 引物0或者1μL，PNA探针1μL，8U酶溶液1μL，中性红染料1μL，去离子水2.5μL 或1.5μL，模板2μL。
进一步地，上述扩增体系的反应条件为58℃-68℃，30-60min；所用的设备为普通PCR仪或恒温金属浴。
第二方面，本发明提供了包括上述引物组合物的快速检测突变型新型冠状病毒的试剂盒，其还包括反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和/或荧光染料以及去离子水。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明基于LAMP技术提供了一种快速检测B.1.1.7新型冠状病毒突变株的引物组合物及试剂盒，特异性好、灵敏度高，无需复杂、昂贵的辅助设备，在 30-60min内即可实现核酸分子标志物的快速检测，检测结果可以通过目视法直接判断，具有良好的应用前景。
附图说明
图1显示了本发明一实施例中检测P681H突变(图1A)和Y144del突变(图 1B)LAMP检测体系的灵敏度的结果图；从右到左依次阴性对照、4×101copies/ml、 4×102copies/ml、4×103copies/ml、4×104copies/ml、4×105copies/ml、4×106copies/ml和4×107copies/ml的阳性模拟样本；
图2显示了本发明一实施例中P681H突变(图2A)和Y144del突变(图2B) LAMP检测体系的灵敏度的荧光检测结果图；
图3显示了本发明一实施例中P681H突变(图3A)和Y144del突变(图3B) LAMP检测体系的特异性的荧光检测结果图。
具体实施方式
本发明针对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的靶基因片段，提供了一种采用LAMP技术的快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物，其包括针对P681H突变位点的引物组合物和/或针对Y144del突变位点的引物组合物；其中，靶片段的序列如下：
P681H突变型序列(第200个碱基由C变成了A)：
GTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACT CCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACAT ACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCATCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACC C(SEQ ID NO：1)；
Y144del突变序列(第200个碱基之后缺失了TAT三个碱基)：
AGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTG CTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTG TTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTA GTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCT TGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAG T(SEQ ID NO：19)。
具体地，针对P681H突变位点的引物组合物和针对Y144del突变位点的引物组合物均包括引物组和PNA探针，采用PNA探针对扩增体系中的非特异性模板(野生型核酸)进行封闭，以提高LAMP检测体系的特异性；具体的序列信息如下表1～2所示：
表1针对P681H突变位点的引物组合物的序列信息
表2针对Y144del突变位点的引物组合物的序列信息
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例提供含有上述引物组合物的快速检测突变型新型冠状病毒的试剂盒，其还包括模板、反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和去离子水。
该试剂盒在使用时配制的每一个LAMP扩增体系的总体积25μL，其包括如下体积的组分：2×反应缓冲液(RM)12.5μL，F3引物(终浓度0.2μmol/L)1μL， B3引物(终浓度0.2μmol/L)1μL，FIP引物(终浓度1.6μmol/L)1μL，BIP引物(终浓度1.6μmol/L)1μL，LB引物(终浓度0.8μmol/L)1μL，LF引物(终浓度0.8μmol/L)0或者1μL，PNA探针(终浓度0.8μmol/L)1μL，酶溶液(EM， 8U)1μL，中性红染料1μL，去离子水2.5或者1.5μL，模板2μL。
上述LAMP扩增体系的LAMP反应条件为：58℃-68℃，30-60min；所用的设备为普通PCR仪或恒温金属浴等能够稳定提供65℃恒温的设备。
使用该试剂盒检测是否突变的结果判断标准：反应结束后，反应液的颜色由原来的淡黄色变为红色，即判定为反应阳性。
验证实施例
本实施例对实施例1提供的扩增体系(其中，针对P681H突变位点的引物组合物采用上表1中的第一组引物体系)和试剂盒的灵敏度和特异性进行了检测，具体的步骤和实验结果如下：
1.灵敏度：分别构建含P681H和Y144del突变的靶片段的TA克隆质粒，将重组质粒与健康人的咽拭子样本混合，制作梯度浓度的模拟样本，具体浓度为 4×101copies/ml，4×102copies/ml，4×103copies/ml，4×104copies/ml，4×105copies/ml， 4×106copies/ml，4×107copies/ml，用实施例1提供的LAMP扩增体系进行检测，结果如图1所示。
此外，在上述不同浓度的模拟样本的扩增体系中同时加入SYBR，在AB 7300PCR仪器上进行实时荧光检测，结果如图2所示。
实验结果表明两种病毒突变的检测灵敏度均可达4×102copies/ml(图1～2)。
2.特异性：采用所建立的上述LAMP扩增体系对临床常见的呼吸道病原：甲型流感病毒RNA、乙型流感病毒RNA、鼻病毒RNA、呼吸道合胞病毒RNA 和野生型新型冠状病毒RNA进行扩增。在上述针对各个病毒RNA和阳性对照的扩增体系中同时加入SYBR，在AB 7300PCR仪器上进行实时荧光检测，结果如图3所示。
上述检测结果发现待测的呼吸道病原RNA均未发生非特异扩增，表明所建立的LAMP检测体系具有良好的特异性。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 复旦大学附属华山医院
<120> 一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 303
<212> DNA
<213> P681H突变型靶序列
<400> 1
gttaactgca cagaagtccc tgttgctatt catgcagatc aacttactcc tacttggcgt 60
gtttattcta caggttctaa tgtttttcaa acacgtgcag gctgtttaat aggggctgaa 120
catgtcaaca actcatatga gtgtgacata cccattggtg caggtatatg cgctagttat 180
cagactcaga ctaattctca tcggcgggca cgtagtgtag ctagtcaatc catcattgcc 240
tacactatgt cacttggtgc agaaaattca gttgcttact ctaataactc tattgccata 300
ccc 303
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctgaacatg tcaacaact 19
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caatagagtt attagagtaa gcaac 25
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgatgagaa ttagtctgag tctgacatat gagtgtgaca taccca 46
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgggcacgta gtgtagctag gaattttctg caccaagtga c 41
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgcatatacc tgcaccaa 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcaatccatc attgcctaca 20
<210> 8
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
taagaggagc cgc 13
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gttctaatgt ttttcaaaca cgt 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gagttattag agtaagcaac tga 23
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gcatatacct gcaccaatgg gttaggggct gaacatgtca a 41
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctcagactaa ttctcatcgg cggattttct gcaccaagtg ac 42
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcacgtagtg tagctagtca atc 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctgtttaata ggggctgaac 20
<210> 15
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gagtctgata actagcgcat ataccatgtc aacaactcat atgagtgt 48
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agactaattc tcatcggcgg gattttctgc accaagtgac 40
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgcaccaatg ggtatgtc 18
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cacgtagtgt agctagtcaa 20
<210> 19
<211> 406
<212> DNA
<213> Y144del突变靶序列
<400> 19
agaggtttga taaccctgtc ctaccattta atgatggtgt ttattttgct tccactgaga 60
agtctaacat aataagaggc tggatttttg gtactacttt agattcgaag acccagtccc 120
tacttattgt taataacgct actaatgttg ttattaaagt ctgtgaattt caattttgta 180
atgatccatt tttgggtgtt taccacaaaa acaacaaaag ttggatggaa agtgagttca 240
gagtttattc tagtgcgaat aattgcactt ttgaatatgt ctctcagcct tttcttatgg 300
accttgaagg aaaacagggt aatttcaaaa atcttaggga atttgtgttt aagaatattg 360
atggttattt taaaatatat tctaagcaca cgcctattaa tttagt 406
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gaagacccag tccctact 18
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
caaggtccat aagaaaaggc 20
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ggtaaacacc caaaaatgga tcattcgcta ctaatgttgt tattaaagtc 50
<210> 23
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
caacaaaagt tggatggaaa gtgatgagag acatattcaa aagtgca 47
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gttcagagtt tattctagtg cg 22
<210> 25
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
acaaataatg gtgt 14
Claims (6)
1. 一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物，其特征在于，包括针对P681H突变位点的引物组合物和针对Y144del突变位点的引物组合物；所述针对P681H突变位点的引物组合物包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LB引物和LF引物，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：2~7所示，所述针对P681H突变位点的引物组合物还包括序列如SEQ ID NO：8所示的PNA探针；所述针对Y144del突变位点的引物组合物包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物和LB引物，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：20~24所示，所述针对Y144del突变位点的引物组合物还包括序列如SEQ ID NO：25的PNA探针。
2.一种包括如权利要求1所述引物组合物的快速检测突变型新型冠状病毒的扩增体系，其特征在于，还包括模板、反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和/或荧光染料以及去离子水。
3.根据权利要求2所述的扩增体系，其特征在于，在所述扩增体系中，每条F3引物和B3引物的终浓度为0.2μmol/L；每条FIP引物和BIP引物的终浓度为1.6μmol/L；每条LB引物和LF引物的终浓度为0.8 μmol/L；每条PNA探针的终浓度为0.8μmol/L。
4.根据权利要求3所述的扩增体系，其特征在于，总体积为25μL的扩增体系包括如下组分：2×反应缓冲液 12.5μL，F3引物 1μL，B3引物 1μL，FIP引物 1μL，BIP引物 1μL，LB引物1μL，LF引物0或者1μL，PNA探针 1μL，8U酶溶液 1μL，中性红染料 1μL，去离子水 2.5μL或1.5μL，模板2μL。
5.根据权利要求2所述的扩增体系，其特征在于，所述扩增体系的反应条件为58℃-68℃，30-60min；所用的设备为普通PCR仪或恒温金属浴。
6.一种包括如权利要求1所述引物组合物的快速检测突变型新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，还包括反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和/或荧光染料以及去离子水。
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