CN110699485A - 一种快速检测马立克氏病病毒的rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种快速检测马立克氏病病毒的rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种快速检测马立克氏病病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明RPA引物对序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；RPA探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明检测方法能在39℃条件下20分钟内完成检测，具有快速、灵敏、操作简便、适用于实验室及现场快速检测的特点，为MDV快速诊断及防控提供了技术参考。

Description

一种快速检测马立克氏病病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及 检测方法
技术领域
本发明涉及一种快速检测马立克氏病病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法，属于分子生物学检测技术领域。
背景技术
马立克氏病病毒(Marek`s Disease Virus，MDV)又称神经淋巴瘤病，属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，马立克病毒属，可以引起马立克氏病(Marek`s Disease)，会发生淋巴增殖性疾病，主要感染鸡、火鸡、山鸡和鹌鹑等禽类动物。在临床上，以内脏器官、外周神经、性腺、虹膜、肌肉和皮肤单独或多发的淋巴样细胞浸润为特征，感染的马立克氏病的病鸡可能出现的表观症状为瘫痪或者严重的甚至死亡。该病的病毒大量存在羽毛囊上皮细胞中，所以可以通过检测羽毛毛髓进行病毒检测。MD可以通过空气进行传播，一旦有个别感染，便会出现大批量的感染现象，严重危害着所有国家和地区的养禽业，是造成养禽业重大经济损失的传染性疾病之一。近年来，毒力较强的MDV病毒株引起的MD发病率呈上升趋势，致病性增强。预防MD主要靠活疫苗，一旦注射便终身带毒，还可能和其他的病毒进行交叉感染，疫苗在生理和环境的压力下容易进行变异，所以防控极其困难。因此需要一种及时、准确的检测技术，对该病的防控具有十分重要的意义。
目前，诊断马立克氏病的实验方法有病原分离法、PCR法，包括普通PCR方法和荧光定量PCR方法、间接免疫荧光法、琼脂扩散试验法(AGP)和ELISA方法，还有最近发展的环介导等温扩增方法(LAMP)。其中，PCR方法因其简便快捷而被广泛使用的检测方法，目前构建的PCR检测方法单独利用强弱毒株存在序列差异的132bp重复序列。传统诊断MD的方法依赖于AGP法检测病鸡羽髓样本和病理组织学切片观察大小不一的淋巴样瘤细胞浸润，操作时间过长且灵敏度较低。LAMP方法是一种等温扩增利用多条引物的方法，但引物设计麻烦且假阳性率高。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification RPA)是近年来发展起来的一种快速诊断不同病原的方法，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫诊断中。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，聚合酶进行后续的合成，整个过程仅需在37-42℃下反应20-30分钟即可。与普通PCR方法与荧光定量PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，不需要昂贵的仪器。与传统的MDV诊断方法：琼脂扩散实验(AGP)和间接ELISA方法相比，具有反应时间快的优点。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-35个碱基，扩增产物在300bp以内。目前国内外尚无采用实时荧光RPA检测MDV的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种快速检测马立克氏病病毒的RPA引物对、荧光探针、检测试剂盒及建立了快速检测马立克氏病病毒的方法，本发明方法能在39℃条件下20分钟左右完成检测，具有快速、灵敏、操作简便、适用于实验室及现场快速检测的特点，为MDV快速诊断及防控提供了技术参考。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种快速检测马立克氏病病毒的RPA引物对，所述RPA引物对上、下游引物序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：
F:5′-TTGTCTACATAGTMCGTCTGCTYCCTGCGTC-3′(SEQ ID No.1)；
R:5′-AAAGGAAAAGTCACGACATCCCCAACAGCC-3′(SEQ ID No.2)。
其中M表示兼并碱基A或C；Y表示兼并碱基C或T。
一种快速检测马立克氏病病毒的RPA荧光探针，其序列如SEQ ID No.3所示：
5′-CACGATTCCTTTTTCTCCTCCTTTCCAGCTTFNTQGTTTCTCCTCCTCAG-3′(SEQ ID No.3)。
其中TF表示连接有荧光基团的T，TQ表示连接有淬灭基团的T，TF和TQ之间的碱基N用四氢呋喃残基THF替换，3′末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。
所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC中的任一种；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任一种。
优选地，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1；
修饰后的探针序列为：
CACGATTCCTTTTTCTCCTCCTTTCCAGCT(dT-FAM)(THF)(dT-BHQ1)GTTTCTCCTCCTCAG-C3spacer。
在RPA体系中引入一个带有荧光标记的探针，一方面可以提高RPA检测的特异性，另一方面还能实现对RPA扩增进行实时监控。
本发明还提供一种快速检测马立克氏病病毒的RPA试剂盒，包含上述的RPA引物对和RPA荧光探针。
所述的RPA试剂盒，还包括其他重组酶聚合酶扩增(RPA)所需试剂：重组酶、SSB、DNA聚合酶、dNTP、Buffer、MgOA等；
优选的，所述的RPA试剂盒，还包括TwistAmpTM试剂盒(TwistDX，Cambridge，UnitedKingdom)中的所有试剂。
本发明还提供一种快速检测马立克氏病病毒的实时荧光RPA方法，步骤如下：
(1)提取待测样本DNA作为模板；
(2)用本发明的RPA引物对及RPA荧光探针对步骤(1)所得模板及对照样品进行RPA扩增；
(3)根据荧光信号即可快速实现MDV的诊断检测。
优选地，所述步骤(2)用本发明所述的RPA引物对及RPA荧光探针对步骤(1)所得模板及对照样品进行RPA扩增；具体地，使用TwistAmpTM试剂盒(TwistDX，Cambridge，UnitedKingdom)以50μL体积进行RPA反应。包括420nM正向RPA引物，420nM反向RPA引物，120nM RPA荧光探针，1μL病毒DNA和280mM镁离子。RPA反应在39℃下在实时恒温荧光检测器(DEAOUBiotechnology，China)中扩增20分钟，其中在扩增4分钟后添加步骤进行充分混合和短暂的离心。
本发明RPA实时荧光检测的引物对是针对MDV强毒株的meq保守序列设计筛选获得的，扩增特异性强，且敏感度高。本发明检测方法的灵敏度可以达到102拷贝。本发明成功建立了针对马立克氏病病毒的实时荧光RPA检测方法，为MDV快速诊断及防控提供了技术参考，具有广泛应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例一筛选的4组RPA引物对的扩增曲线图。
图2为本发明建立的快速检测马立克氏病病毒的重组酶聚合酶扩增RPA方法特异性试验结果。
图3为本发明建立的快速检测马立克氏病病毒的重组酶聚合酶扩增RPA方法灵敏度试验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，但本发明不限于此。本发明中所涉及的方法，如无特殊说明均为本领域常用方法，所涉及的试剂，如无特殊说明均可以从商业途径获得。
实施例一、快速检测马立克氏病病毒的重组酶聚合酶扩增RPA方法的建立
一、材料与方法
1.病毒的提取
按TIANGEN公司TIANamp Genomic DNAKit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书对病鸡的羽髓样本进行DNA提取。将200μL病毒溶液加入1.5mL离心管中，加入20μL蛋白酶K和200μL载体RNA溶液，摇动混合物并混合。在56℃水浴15分钟后，加入250μL无水乙醇，转移到管中，并以8000转/分钟离心1分钟。将洗涤溶液洗涤两次，然后加入TE，在室温下放置5分钟并离心以获得DNA/RNA。
2.目的基因的克隆
使用常规方法进行meq基因克隆。常规PCR扩增meq基因，扩增体系为：95℃/15min预变性，94℃/30Sec，55℃/30Sec和72℃/90Sec 35个循环，72℃延伸10分钟。通过琼脂糖凝胶电泳回收PCR目的产物，按照OMEGA公司
Figure BDA0002170056430000041
Gel Extraction Kit试剂盒说明书进行回收。
将4.5μL回收产物与0.5μLpMD-18T vector、5μL solution I总体积共10μL混匀，放4℃连接过夜克隆到pMD-18T载体中，构建质粒。
将10μL连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞中：将10μL连接产物加入100μL感受态细胞中轻轻混匀，冰浴30min；金属浴42℃热激90Sec后冰浴5min；加入1mL LB培养基后在200rpm，37℃的摇床上摇1h；涂布含有氨苄抗性的平板，挑取阳性菌落扩大培养。
按照OMEGA公司的
Figure BDA0002170056430000042
Plasmid Mini Kit I试剂盒说明书进行提取。将提取后的质粒送至上海生工生物股份有限公司广州分公司测序。
测序结果分析表明，成功扩增得到MDV的meq基因。
3.RPA引物和探针的设计及筛选
3.1根据TwistDX设计指南的建议，从NCBI下载MDV序列并使用DNAstar基于高度保守的meq基因序列设计MDV特异性RPA引物和探针。设计引物的长度范围为30至35个碱基，探针长度范围为48至52个碱基。RPA探针应该有四个基团，包括荧光基团，猝灭基团，四氢呋喃(THF)和3端封闭(C3spacer)。所有引物和探针均在设计完成后由上海生工生物工程有限公司合成。
RPA的关键在于扩增引物和探针的设计，RPA引物直接影响到重组率、扩增速度和检测灵敏度。故在设计RPA引物时，需要进行大量试验和探索。
本发明人根据引物设计和筛选原则，筛选出4组引物对和1条探针，如表1所示：
表1.
Figure BDA0002170056430000051
其中M、Y、R等表示兼并碱基。
3.2引物筛选结果
分别用表1中的四对引物和探针进行PCR扩增，从图1看出引物对1的扩增效果最好，扩增开始时间最快且扩增曲线呈现“S”曲线，故挑选引物对1继续试验。
4.RPA方法的建立
使用TwistAmpTM试剂盒(TwistDX，Cambridge，United Kingdom)以50μL体积进行RPA反应。包括420nM正向引物，420nM反向引物，120nM外探针，1μL病毒DNA和280mM镁离子。RPA反应在39℃下在实时恒温荧光检测器(DEAOU Biotechnology，China)中扩增20分钟，其中在扩增4分钟后添加步骤进行充分混合和短暂的离心。
结果表明，本发明成功针对MDV强毒株的meq保守序列，建立了实时荧光RPA检测方法。
实施例二、本发明快速检测马立克氏病病毒的重组酶聚合酶扩增RPA方法特异性试验与灵敏度试验
特异性试验：通过测试含有阳性核酸的MDV以及来自其他病原体的其他核酸，包括新城疫病毒(NDV)，禽传染性贫血病毒(CAV)，传染性法氏囊病病毒(IBDV)，禽传染性支气管炎病毒(IBV)，传染性喉气管炎病毒(ILTV)，禽流感病毒(AIV)和禽白血病病毒(ALV)和禽呼肠孤病毒(ARV)来确定构建的实时RPA方法的特异性。ddH2O做空白对照。
特异性试验结果如图2显示，除了MDV扩增之外，其他阴性核酸没有扩增，证明本发明方法特异性良好，与其他病原没有交叉反应。
灵敏度试验：实时RPA使用稀释的MDV阳性标准品，用easy dilution以10倍的比例稀释至7个浓度，模板为1*107copies/μL至1copies/μL，ddH2O做空白对照，检测方法的灵敏度。
灵敏度试验结果如图3所示，从图中可以看出最低检测值为1*102copies/μL。
实施例三、本发明快速检测马立克氏病病毒的重组酶聚合酶扩增RPA方法用于临床样品的检测
为了评估本发明构建的MDV实时RPA方法的实用性，检测25例疑似MDV感染的临床样本，同时使用实时PCR测定法进行比较。结果显示(表2)，25例疑似MDV感染的临床样本中RPA的阳性检出率为32％(8/25)，与实时PCR的阳性检出率一致。两种方法的阳性样品和阴性样品的一致性为100％。
表2
检测方法 阳性样品 阴性样品 检出率
RPA 8 17 32％
PCR 8 17 32％
实施例四、一种快速检测马立克氏病病毒的重组酶聚合酶扩增RPA的试剂盒
该试剂盒包括：
(1)实施例1所述的引物对和探针。
(2)阳性对照、阴性对照及RPA扩增试剂。
所述RPA扩增试剂包括：酶、dNTP、Reaction Buffer、Probe E-mix、Core ReactionMix、MgOA等；优选为TwistAmpTM试剂盒中所有试剂。
所述的阳性对照为MDV强毒株DNA；所述的阴性对照为纯水。
Figure IDA0002170056480000021
Figure IDA0002170056480000031

Claims (10)

1.一种快速检测马立克氏病病毒的RPA引物对，其特征是，所述RPA引物对上游引物序列如SEQ ID No.1所示，所述RPA引物对下游引物序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种快速检测马立克氏病病毒的RPA荧光探针，其特征是，序列如SEQ ID No.3所示：5′-CACGATTCCTTTTTCTCCTCCTTTCCAGCTTFNTQGTTTCTCCT CCTCAG-3′；其中TF表示连接有荧光基团的T，TQ表示连接有淬灭基团的T，TF和TQ之间的碱基N用四氢呋喃残基THF替换，3′末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。
3.如权利要求2所述的快速检测马立克氏病病毒的RPA荧光探针，其特征是，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC中的任一种；所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任一种。
4.如权利要求2或3所述的快速检测马立克氏病病毒的RPA荧光探针，其特征是，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ1。
5.如权利要求4所述的快速检测马立克氏病病毒的RPA荧光探针，其特征是，序列为：CACGATTCCTTTTTCTCCTCCTTTCCAGCT(dT-FAM)(THF)(dT-BHQ1)GTTTCTCCTCCTCAG-C3spacer。
6.一种快速检测马立克氏病病毒的RPA试剂盒，其特征是，包含权利要求1所述的RPA引物对和权利要求5所述的RPA荧光探针。
7.如权利要求6所述的快速检测马立克氏病病毒的RPA试剂盒，其特征是，所述RPA试剂盒还包括其他重组酶聚合酶扩增RPA所需试剂：重组酶、SSB、DNA聚合酶、dNTP、Buffer、MgOA。
8.如权利要求6或7所述的快速检测马立克氏病病毒的RPA试剂盒，其特征是，所述的RPA试剂盒，还包括TwistAmpTM试剂盒中的所有试剂。
9.一种快速检测马立克氏病病毒的实时荧光RPA方法，其特征是，步骤如下：
(1)提取待测样本DNA作为模板；
(2)用权利要求1所述的RPA引物对及权利要求2所述的RPA荧光探针对步骤(1)所得模板及对照样品进行RPA扩增；
(3)根据荧光信号即可快速实现MDV的诊断检测。
10.如权利要求9所述的快速检测马立克氏病病毒的实时荧光RPA方法，其特征是，所述步骤(2)用权利要求1所述的RPA引物对及权利要求2所述的RPA荧光探针对步骤(1)所得模板及对照样品进行RPA扩增；使用TwistAmpTM试剂盒以50μL体积进行RPA反应：包括420nM正向RPA引物，420nM反向RPA引物，120nM RPA荧光探针，1μL病毒DNA和280mM镁离子；RPA反应于39℃下在实时恒温荧光检测器中扩增20分钟。
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