CN108085416A

CN108085416A - 一种禽肿瘤病三重荧光pcr检测试剂盒及其检测方法

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Publication number: CN108085416A
Application number: CN201711392289.6A
Authority: CN
Inventors: 罗青平; 汪最; 邵华斌; 温国元; 张蓉蓉; 张腾飞; 王红琳; 卢琴; 罗玲; 汪宏才; 赵星
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2018-05-29

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒检测用三重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法。所述检测试剂盒包括三重荧光PCR检测混合液、阴性对照品和阳性对照品；其中，所述三重荧光PCR检测混合液中含有分别用于扩增、检测J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒的三对引物及其各自对应的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑9所示。利用本发明的试剂盒和引物探针能快速检测J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生病病毒，具有操作简便、灵敏度高、特异性好等优点；及时发现和确诊可疑病例，提高对三种肿瘤病的监测水平。

Description

一种禽肿瘤病三重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒检测用三重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

禽白血病是由反转录病毒科的禽白血病病毒(ALV)和肉瘤病群病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称，可导致病鸡发育缓慢、产蛋率低等，是一种慢性消耗性疾病。本病通过垂直和水平两种方式传播感染鸡群，是一种免疫抑制性疾病，引起机体抵抗力下降和免疫抑制，导致其它细菌性和病毒性疾病的继发感染。20世纪90年代初从肉用型鸡中分离到一种新的ALV，称为J亚群病毒，据推测是由外源性ALV与禽内源性ALV基因重组而来。目前J亚群禽白血病在我国各地广泛存在，而且该亚群病毒有很广的宿主范围，导致禽群死淘率明显升高、生产性能降低等，已成为危害我国养禽业最严重的疾病之一。

马立克氏病是由疱疹病毒科的马立克氏病病毒(MDV)引起的鸡的一种传染性肿瘤病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征，在外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤发生单核细胞浸润。马立克病在临床上引起肿瘤和死亡的同时，更重要的是损害感染鸡的免疫器官，造成免疫抑制状态，导致机体抵抗力下降和对接种疫苗的免疫应答降低或不应答，引发其他多种疾病的并发和继发感染，造成巨大的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)已将马立克病归为动物B类传染性疾病。该病是第一个能用疫苗预防的肿瘤性疾病，因此受到了医学界、兽医学界、病毒学界的广泛关注。

网状内皮组织增生症是指由反转录病毒科的网状内皮组织增生症病毒(REV)引起的禽的一群病理综合症，包括急性网状细胞肿瘤形成、矮小综合征和淋巴组织与其它组织形成慢性肿瘤。本病呈世界性分布，我国在1988年分离到一株矮小综合症毒株命名为REV-C45，该病最严重的后果是造成特异性和非特异性免疫抑制，感染禽对其它病原的抵抗力下降，进而出现继发或并发感染，使鸡场蒙受重大经济损失。REV既可水平传播又可垂直传播，通过污染疫苗传播也是重要的传播途径。实际上，鸡自然感染REV的病例并不多见，大部分感染是由于接种污染REV的疫苗发生的。

荧光定量PCR术是上世纪九十年代末才发展起来的新技术，它具有快速、特异性、灵敏度高、成本相对低等优点，被广泛应用于临床检测的各个方面。目前已开发出利用荧光定量PCR技术分别针对上述三种病毒进行的快速检测试剂盒，但是由于是单一检测，三种病毒检测下来，既麻烦又浪费成本。因此在荧光定量PCR技术的基础上，建立单管三重荧光PCR同时检测J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒的方法具有非常重要的意义。

发明内容

针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒三重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法。该检测试剂盒可用于单管同步检测J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒，可用于临床对可疑感染病鸡进行病原学鉴别诊断。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒三重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括三重荧光PCR检测混合液、阴性对照品和阳性对照品；其中，所述三重荧光PCR检测混合液中含有分别用于扩增、检测J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒的三对引物及其各自对应的探针。

按上述方案，优选地，所述三对引物及其各自对应的探针具体为：

(一)第一对引物及其对应的探针：

(1)J亚群禽白血病病毒上游引物：5’－GCAAGAAGGACTCTAAGA－3’(SEQ ID NO:1)；

(2)J亚群禽白血病病毒下游引物：5’－GGTTGTTGCAATAGATGAA－3’(SEQ ID NO:2)；

(3)J亚群禽白血病病毒探针：5’－荧光报告基团－CCGCCAGCAACAAGCAAGAA－荧光淬灭基团－3’(SEQ ID NO:3)；

(二)第二对引物及其对应的探针：

(1)马立克病毒上游引物：5’－CATGCTTCATGGAGTTTGTCTACATAG－3’(SEQ ID NO:4)；

(2)马立克病毒下游引物：5’－GCCTATCTGAGGAGGAGAAACAGAA－3’(SEQ ID NO:5)；

(3)马立克病毒探针：5’－荧光报告基团－CCGTCTGCTTCCTGCGTCTTCTCCGAG－荧光淬灭基团－3’(SEQ ID NO:6)；

(三)第三对引物及其对应的探针：

(1)网状内皮组织增生病病毒上游引物：5’－GATGCTTGCCTTCAACAAACATTTC－3’(SEQ ID NO:7)；

(2)网状内皮组织增生症病毒下游引物：5’－ACTGCCATATTAGCTTCTGTAATCATG－3’(SEQ ID NO:8)；

(3)网状内皮组织增生症病毒探针：5’－荧光报告基团－AGCCTGCTCTTGATGCCGATTCCGA－荧光淬灭基团－3’(SEQ ID NO:9)。

按上述方案，优选地，所述J亚群禽白血病病毒探针标记的荧光报告基团为JOE荧光基团，荧光淬灭基团为BHQ1；所述马立克病毒探针标记的荧光报告基团为TAMRA荧光基团，荧光淬灭基团为BHQ1；所述网状内皮组织增生症病毒探针标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，荧光淬灭基团为BHQ1。

按上述方案，优选地，所述三重荧光PCR检测混合液还含有qPCR MIX和双蒸水。

按上述方案，优选地，所述三重荧光PCR检测混合液的组成配比具体为：

J亚群禽白血病病毒上游引物：0.4μL/test；

J亚群禽白血病病毒下游引物0.4μL/test；

J亚群禽白血病病毒探针：0.5μL/test；

马立克病毒上游引物：0.6μL/test；

马立克病毒下游引物：0.6μL/test；

马立克病毒探针：0.4μL/test；

网状内皮组织增生病毒上游引物：0.6μL/test；

网状内皮组织增生症病毒下游引物：0.6μL/test；

网状内皮组织增生症病毒探针：0.6μL/test；

qPCR MIX：12.5μL/test；

双蒸水：5.8μL/test。

按上述方案，优选地，所述J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒三重荧光PCR检测试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。

按上述方案，优选地，所述阳性对照品包括：

含有SEQ ID NO:10所示目的扩增序列的J亚群禽白血病病毒质粒、

含有SEQ ID NO:11所示目的扩增序列的马立克病毒质粒、

含有SEQ ID NO:12所示目的扩增序列的网状内皮组织增生症病毒质粒；

其中，所述SEQ ID NO:10序列为

5’－GCAAGAAGGACTCTAAGAAGAAGCCGCCAGCAACAAGCAAGAAAGACCCGGAGAAGACACCCTTGCTGCCATCGAGAGGTTACTTCTTCTTTCAAATGATACTTGTGTGCGTGGTTATTATTTCCGTTGTCCCAGGGGTGGGGGGAGTTCATCTATTGCAACAACC－3’；

所述SEQ ID NO:11序列为

5’－GCCTATCTGAGGAGGAGAAACAGAAGCTGGAAAGGAGGAGAAAAAGGAATCGTGACGCCGCTCGGAGAAGACGCAGGAAGCAGACGGACTATGTAGACAAACTCCATGAAGCATG-3’；

所述SEQ ID NO:12序列为

5’－GATGCTTGCCTTCAACAAACATTTCCTTTTATGGTTTATGAGCCTGCTCTTGATGCCGATTCCGAGAAATGATATCAGCGAAATATATCAAGTACAATGGCGGCTAAGGCAAGCAAGCATGATTACAGAAGCTAATATGGCAGT－3’。

按上述方案，优选地，所述阳性对照品中，J亚群禽白血病病毒质粒的浓度为5×10³～5×10⁷copy/mL；马立克病毒质粒的浓度为5×10³～5×10⁷copy/mL；网状内皮组织增生症病毒质粒的浓度为5×10³～5×10⁷copy/mL。

按上述方案，优选地，所述阴性对照品为DEPC-H₂O。

按上述方案，优选地，所述阳性对照品中，J亚群禽白血病病毒质粒、马立克病毒质粒以及网状内皮组织增生症病毒质粒可以单独包装，也可以混合包装。

本发明还提供了上述J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒三重荧光PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括下述步骤：

1、配制PCR反应体系：取待测品、阳性对照品和阴性对照品各2μL，分别加入23μL三重荧光PCR检测混合液，得待测品、阳性对照品和阴性对照品的PCR反应体系；

2、PCR扩增反应：反应条件为95℃5min；95℃10sec和51℃30sec交替循环40次；

3、荧光检测：PCR反应结束后，检测PCR反应体系的荧光信号值；

4、结果判定。

按上述方案，优选地，步骤(3)所述荧光检测中，荧光通道选用JOE、TAMRA以及FAM通道，单点荧光检测在51℃。

按上述方案，优选地，步骤1中所述待测品由下述方法提取得到：从病鸡组织中提取病毒的核酸(DNA/RNA)，反转录得cDNA，得待测品。

按上述方案，优选地，步骤4所述结果判定中还包括试剂盒质量控制的步骤，具体为：试剂盒中各对照品须达到表1中的要求，否则实验视为无效。

表1试剂盒质量标准

按上述方案，优选地，步骤(4)中结果判定中，样本cDNA检测结果的判断标准如表2所示。

表2检测结果判断标准

与现有技术相比，本发明具有下述优点：

本发明设计了三对PCR引物，分别为特异性扩增J亚群禽白血病病毒、马立克病毒和网状内皮组织增生症病毒序列，三对PCR引物可在同一PCR反应管里同时进行扩增，实现三重检测，大大缩短检测时间，操作简便。特异性引物和探针的设计保证了引物和探针的高度保守和特异性，避免了两对引物和探针之间无互补配对或交叉扩增的情况。本发明选用的三个荧光基团的荧光波长相差较大且信号强度相近，避免了信号之间的相互干扰。利用本发明的试剂盒和引物探针能快速检测J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生病病毒，具有操作简便、灵敏度高、特异性好等优点；可及时发现和确诊可疑病例，提高对三种肿瘤病的监测水平。

附图说明

图1：实施例5中J亚群禽白血病病毒灵敏度检测曲线图；

图2：实施例5中马立克病毒灵敏度检测曲线图；

图3：实施例5中网状内皮组织增生症病毒灵敏度检测曲线图；

图4：实施例6中样本1检测曲线图；

图5：实施例6中样本2检测曲线图；

图6：实施例6中样本3检测曲线图；

图7：实施例6中样本4检测曲线图；

图8：实施例6中样本5检测曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1

J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒的三重荧光PCR检测用引物及探针的合成，具体步骤如下：

在J亚群禽白血病病毒探针的5’标记JOE荧光基团，3’标记荧光淬灭基团BHQ1；在马立克病毒探针的5’标记TAMRA荧光基团，3’标记荧光淬灭基团BHQ1；在网状内皮组织增生病毒探针的5’标记FAM荧光基团，3’标记荧光淬灭基团BHQ1。合成J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒的引物和探针。其中，各引物及其各自对应的探针具体为：

(一)J亚群禽白血病病毒的引物和探针：

J亚群禽白血病病毒上游引物：5’－GCAAGAAGGACTCTAAGA－3’(SEQ ID NO:1)

J亚群禽白血病病毒下游引物：5’－GGTTGTTGCAATAGATGAA－3’(SEQ ID NO:2)

J亚群禽白血病病毒探针：5’JOE－CCGCCAGCAACAAGCAAGAA–BHQ1 3’(SEQ ID NO:3)；

(二)马立克病毒的引物和探针：

马立克病毒上游引物：5’－CATGCTTCATGGAGTTTGTCTACATAG－3’(SEQ ID NO:4)

马立克病毒下游引物：5’－GCCTATCTGAGGAGGAGAAACAGAA－3’(SEQ ID NO:5)

马立克病毒探针：5’TAMRA-CCGTCTGCTTCCTGCGTCTTCTCCGAG–BHQ1 3’(SEQ ID NO:6)；

(三)网状内皮组织增生症病毒的引物和探针：

网状内皮组织增生症病毒上游引物：5’－GATGCTTGCCTTCAACAAACATTTC－3’(SEQID NO:7)

网状内皮组织增生症病毒下游引物：5’－ACTGCCATATTAGCTTCTGTAATCATG－3’(SEQ ID NO:8)

网状内皮组织增生病毒探针：5’FAM－AGCCTGCTCTTGATGCCGATTCCGA－BHQ13’(SEQID NO:9)。

实施例2

三重荧光PCR检测混合液的制备，具体步骤如下：

将实施例1合成的：

禽白血病J亚群病毒上游引物：0.4μL/test；

禽白血病J亚群病毒下游引物0.4μL/test；

禽白血病J亚群病毒探针：0.5μL/test；

马立克病毒上游引物：0.6μL/test；

马立克病毒下游引物：0.6μL/test；

马立克病毒探针：0.4μL/test；

网状内皮组织增生病毒上游引物：0.6μL/test；

网状内皮组织增生症病毒下游引物：0.6μL/test；

网状内皮组织增生症病毒探针：0.6μL/test；

qPCR MIX(购自诺唯赞)：12.5μL/test；

双蒸水：5.8μL/test；

混匀，得J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒三重荧光PCR检测混合液。

实施例3

J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组增生症病毒三重荧光PCR检测试剂盒中阳性对照品的制备：

(一)病毒质粒的构建

1、J亚群禽白血病病毒质粒的构建：采用PCR法对J亚群禽白血病病毒样本(由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存)的核酸进行扩增，获得含SEQ ID NO:10所示目的扩增序列的核酸片段，引物序列如SEQ ID NO:1-2所示。将扩增的片段纯化后，通过TA克隆至pMD18-T载体上，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化入DH5α，扩增，获得J亚群禽白血病病毒质粒。

2、马立克病毒质粒的构建：采用PCR法对马立克病毒样本(疫苗株CV1988)的核酸进行扩增，获得含SEQ ID NO:11所示目的扩增序列的核酸片段，引物序列如SEQ ID NO:4-5所示。将扩增的片段纯化后，通过TA克隆至pMD18-T载体上，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化入DH5α，扩增，获得马立克病毒质粒。

3、网状内皮组织增生症病毒质粒的构建：采用PCR法对网状内皮组织增生症病毒样本(由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存)的核酸进行扩增，获得含SEQ ID NO:12所示目的扩增序列的核酸片段，引物序列SEQ ID NO:7-8所示。将扩增的片段纯化后，通过TA克隆至pMD18T载体上，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化入DH5α，扩增，获得网状内皮组织增生症病毒质粒。

(二)阳性对照品的制备

各取步骤(一)制得的浓度为3×10⁷copies/mL的J亚群禽白血病病毒质粒(ALV-J)、马立克病毒质粒(MDV)和网状内皮组织增生症病毒质粒(REV)等体积混合获得1×10⁷copies/mL阳性对照品S1。按1:10、1:100、1:1000、1:10000稀释，获得阳性对照品S2(1×10⁶copies/mL)、S3(1×10⁵copies/mL)、S4(1×10⁴copies/mL)、S5(1×10³copies/mL)。共得S1-S5 5份浓度不同的阳性对照品。

实施例4

J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组增生症病毒三重荧光PCR检测试剂盒的组装，具体步骤如下：

组装5组检测试剂盒，分别包括：

(1)实施例2制得的三重荧光PCR检测混合液23μL；

(2)实施例3制得的阳性对照品S1-S5各2μL，具体如表3所示；

(3)阴性对照品：DEPC-H₂O 2μL。

表3 5组J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组增生症病毒三重荧光PCR检测试剂盒的组成

实施例5

J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组增生症病毒三重荧光PCR检测试剂盒的灵敏度分析，步骤如下：

1、试剂准备：

取实施例4中组装的J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组增生症病毒三重荧光PCR检测试剂盒1-5中的三重荧光PCR检测混合液(各23μL)，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒后置于PCR管中，然后将阳性对照品S1-5(各2μL)分别加入上述5组PCR管中，盖好管盖，立即进行PCR扩增反应。

2、PCR扩增：

反应管置于定量荧光PCR仪上，设置下述循环参数：

95℃5min；再接95℃×10sec→51℃×30sec，循环40次；单点荧光检测在51℃。反应体系为25μL。

3、检测结果：详见表4，扩增曲线见附图1-3。

表4试剂盒灵敏度检测结果

表4结果表明S1-S5在JOE、TAMRA和FAM通道检测均为阳性，表明试剂盒检测J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒的检测灵敏度能达到1×10³copies/mL。

实施例6

J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组增生症病毒三重荧光PCR检测试剂盒的使用验证。以实施例4中制备的检测试剂盒3为例，进行使用验证，具体步骤如下：

1实验方法：

经其它金标准法(病毒培养分离等)鉴定为J亚群禽白血病病毒样本1份、马立克病毒样本1份、网状内皮组织增生症病毒样本1份、DF-1细胞基因组1份和健康鸡组织样本1份，依次编号为样本1-5。

1.1样本处理：

将各组织样品分别剪入2mL EP管中，加入1mL PBS和3粒小钢珠，机械震荡15min，反复冻融3次，12000rpm离心5min，取上清200μL加入裂解液(购自奥科鼎盛生物，货号：34516KC5)，然后提取样本的DNA/RNA。

将提取的DNA/RNA经过反转录(反转录试剂盒购自诺唯赞)得到cDNA。

1.2试剂准备：

按照实施例4组装7份检测试剂盒，其分别含有23μL三重荧光PCR检测混合液、阴性对照品(DEPC-H2O)2μL和阳性对照品S3 2μL。

1.3加样：

取上述三重荧光PCR检测混合液各23μL，分别置于7只PCR管中，然后将样本1-5的cDNA模板、阴性对照品(DEPC-H2O)和阳性对照品(实施例3中的S3)各2μL分别加入各PCR管中，盖好管盖，立即进行PCR扩增反应。反应体系均为25μL。

1.4PCR扩增：

反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：

95℃5min；再接95℃×10sec→51℃×30sec，循环40次；单点荧光检测在51℃。

1.5阈值设定：

阈值设定原则以阈值线刚好超过DEPC-H₂O的最高点。

1.6质量控制：

阳性对照品(实施例3中的S3)须达到表1要求，否则实验视为无效。

2试验结果：详见表5，扩增曲线见附图4-8。

表5检测结果

由表5数据可知，样本1的检测结果为J亚群禽白血病病毒阳性；样本2的检测结果为马立克病毒阳性；样本3的检测结果为网状内皮组织增生症病毒阳性；样本4-5的检测结果为阴性；阳性对照三种病毒均为阳性，阴性对照三种病毒均为阴性。所以试剂盒检测结果与临床检测结果一致，可见本发明试剂盒具有较好的特异性。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种禽肿瘤病三重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法

<130> pcngs

<160> 12

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> J亚群禽白血病病毒上游引物

<400> 1

gcaagaagga ctctaaga 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> J亚群禽白血病病毒下游引物

<400> 2

ggttgttgca atagatgaa 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> J亚群禽白血病病毒探针

<400> 3

ccgccagcaa caagcaagaa 20

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 马立克病毒上游引物

<400> 4

catgcttcat ggagtttgtc tacatag 27

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 马立克病毒下游引物

<400> 5

gcctatctga ggaggagaaa cagaa 25

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 马立克病毒探针

<400> 6

ccgtctgctt cctgcgtctt ctccgag 27

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 网状内皮组织增生症病毒上游引物

<400> 7

gatgcttgcc ttcaacaaac atttc 25

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 网状内皮组织增生症病毒下游引物

<400> 8

actgccatat tagcttctgt aatcatg 27

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 网状内皮组织增生症病毒探针

<400> 9

agcctgctct tgatgccgat tccga 25

<210> 10

<211> 166

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 禽白血病J亚群病毒目的扩增序列

<400> 10

gcaagaagga ctctaagaag aagccgccag caacaagcaa gaaagacccg gagaagacac 60

ccttgctgcc atcgagaggt tacttcttct ttcaaatgat acttgtgtgc gtggttatta 120

tttccgttgt cccaggggtg gggggagttc atctattgca acaacc 166

<210> 11

<211> 115

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 马立克病毒目的扩增序列

<400> 11

gcctatctga ggaggagaaa cagaagctgg aaaggaggag aaaaaggaat cgtgacgccg 60

ctcggagaag acgcaggaag cagacggact atgtagacaa actccatgaa gcatg 115

<210> 12

<211> 144

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 网状内皮组织增生症病毒目的扩增序列

<400> 12

gatgcttgcc ttcaacaaac atttcctttt atggtttatg agcctgctct tgatgccgat 60

tccgagaaat gatatcagcg aaatatatca agtacaatgg cggctaaggc aagcaagcat 120

gattacagaa gctaatatgg cagt 144

Claims

1.一种J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒三重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括三重荧光PCR检测混合液、阴性对照品和阳性对照品；其中，所述三重荧光PCR检测混合液中含有分别用于扩增、检测J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒的三对引物及其各自对应的探针；所述三对引物及其各自对应的探针具体为：

(一)第一对引物及其对应的探针：

(1)J亚群禽白血病病毒上游引物：5’－GCAAGAAGGACTCTAAGA－3’；

(2)J亚群禽白血病病毒下游引物：5’－GGTTGTTGCAATAGATGAA－3’；

(3)J亚群禽白血病病毒探针：5’－荧光报告基团－CCGCCAGCAACAAGCAAGAA－荧光淬灭基团－3’；

(二)第二对引物及其对应的探针：

(1)马立克病毒上游引物：5’－CATGCTTCATGGAGTTTGTCTACATAG－3’；

(2)马立克病毒下游引物：5’－GCCTATCTGAGGAGGAGAAACAGAA－3’；

(3)马立克病毒探针：5’－荧光报告基团－CCGTCTGCTTCCTGCGTCTTCTCCGAG－荧光淬灭基团－3’；

(三)第三对引物及其对应的探针：

(1)网状内皮组织增生病病毒上游引物：5’－GATGCTTGCCTTCAACAAACATTTC－3’；

(2)网状内皮组织增生症病毒下游引物：5’－ACTGCCATATTAGCTTCTGTAATCATG－3’；

(3)网状内皮组织增生症病毒探针：5’－荧光报告基团－AGCCTGCTCTTGATGCCGATTCCGA－荧光淬灭基团－3’。

2.根据权利要求1所述的三重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，

所述J亚群禽白血病病毒探针标记的荧光报告基团为JOE荧光基团，荧光淬灭基团为BHQ1；

所述马立克病毒探针标记的荧光报告基团为TAMRA荧光基团，荧光淬灭基团为BHQ1；

所述网状内皮组织增生症病毒探针标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，荧光淬灭基团为BHQ1。

3.根据权利要求1所述的三重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述三重荧光PCR检测混合液还含有qPCR MIX和双蒸水，所述三重荧光PCR检测混合液的组成配比具体为：

J亚群禽白血病病毒上游引物：0.4μL/test；

J亚群禽白血病病毒下游引物0.4μL/test；

J亚群禽白血病病毒探针：0.5μL/test；

马立克病毒上游引物：0.6μL/test；

马立克病毒下游引物：0.6μL/test；

马立克病毒探针：0.4μL/test；

网状内皮组织增生病毒上游引物：0.6μL/test；

网状内皮组织增生症病毒下游引物：0.6μL/test；

网状内皮组织增生症病毒探针：0.6μL/test；

qPCR MIX：12.5μL/test；

双蒸水：5.8μL/test。

4.根据权利要求1所述的三重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括：

含有SEQ ID NO:10所示目的扩增序列的J亚群禽白血病病毒质粒、

含有SEQ ID NO:11所示目的扩增序列的马立克病毒质粒、

其中，所述SEQ ID NO:10序列为

所述SEQ ID NO:11序列为

5’－GCCTATCTGAGGAGGAGAAACAGAAGCTGGAAAGGAGGAGAAAAAGGAATCGTGACGCCGCTCGGAGAAGACGCAGGAAGCAGACGGACTATGTAGACAAACTCCATGAAGCATG－3’；

所述SEQ ID NO:12序列为

5’－GATGCTTGCCTTCAACAAACATTTCCTTTTATGGTTTATGAGCCTGCTCTTGATGCCGATTCCGAGAAATGATATCAGCGAAATATATCAAGTACAATGGCGGCTAAGGCAAGCAAGCATGATTACAGAAGCTAATATGGCAGT－3’；

所述阴性对照品为DEPC-H₂O。

5.根据权利要求4所述的三重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品中，所述J亚群禽白血病病毒质粒的浓度为5×10³～5×10⁷copy/mL；所述马立克病毒质粒的浓度为5×10³～5×10⁷copy/mL；所述网状内皮组织增生症病毒质粒的浓度为5×10³～5×10⁷copy/mL。

6.权利要求1-5任一项所述J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒三重荧光PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)配制PCR反应体系：取待测品、阳性对照品和阴性对照品各2μL，分别加入23μL三重荧光PCR检测混合液，得待测品、阳性对照品和阴性对照品的PCR反应体系；

(2)PCR扩增反应：反应条件为95℃5min；95℃10sec和51℃30sec交替循环40次；

(3)荧光检测：PCR反应结束后，检测PCR反应体系的荧光信号值；

(4)结果判定。

7.根据权利要求6所述的三重荧光PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(1)中所述待测品由下述方法提取得到：从病鸡组织中提取病毒的DNA或RNA，反转录得cDNA，得待测品。

8.根据权利要求6所述的三重荧光PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)所述荧光检测中，荧光通道选用JOE、TAMRA以及FAM通道，单点荧光检测在51℃。

9.根据权利要求6所述的三重荧光PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(4)所述结果判定中还包括试剂盒质量控制的步骤，具体为：试剂盒中各对照品须达到以下表1中的要求，否则实验视为无效。

表1试剂盒质量标准

10.根据权利要求6所述的三重荧光PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(4)中所述结果判定中，样本cDNA检测结果的判断标准如表2所示。

表2检测结果判断标准