CN106191308A - 用于检测巨细胞病毒、eb病毒和腺病毒的引物及探针组合 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多种呼吸道病毒检测用的引物和探针，旨在提供一种用于检测巨细胞病毒、EB病毒和腺病毒的引物及探针组合。所述用于检测巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒的引物对与探针的序列如SEQ ID NO：1‑9所示。本发明还进一步提供了同时检测巨细胞病毒、EB病毒和腺病毒的试剂盒。本发明将多重PCR与Taqman荧光探针技术结合起来，在一次检测过程中可对多种可能引发急性呼吸道感染的病原体进行同时检测，达到快速诊断、指导治疗的目的。能缩短工作时间，减少原料耗损，并且具有敏感性、特异性更强、有效解决PCR污染、自动化程度更高等特点。

Description

用于检测巨细胞病毒、EB病毒和腺病毒的引物及探针组合
技术领域
本发明涉及多种呼吸道病毒检测用的引物和探针。特别地，本发明是一种能同时对巨细胞病毒、EB病毒和腺病毒三种病毒进行特异性检测的引物和探针。
背景技术
急性呼吸道感染90％以上是由病毒引起的，其中以呼吸道病毒最常见。常见呼吸道病毒包括：甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、EB病毒等。巨细胞病毒(Cytomegaoviyns，CMV)具有典型的疱疹病毒形态，对宿主或培养细胞具有高度的种特异性，人巨细胞病毒只能感染人，仅在人纤维细胞中增值。CMV感染小儿多表现为无症状性感染，只有少数为症状性感染，且又多发生于先天性和围生期感染患儿。在严重免疫缺陷时，可出现肺炎、肝炎等全身疾患。EB病毒(epstein-barr virus,EBv)，又称人类疱疹病毒4型(Human herpesvirus 4(HHV-4))。EB病毒长期潜伏在淋巴细胞内，以环状DNA形式游离在胞浆中，并整合在染色体内。EB病毒在人群中广泛感染，幼儿感染后多数无明显症状，或引起轻症咽炎和上呼吸道感染。腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。衣壳里是线状双链DNA分子，腺病毒分两个属，共约100余血清型。一般会造成呼吸系统的不适，对啮齿类动物有致癌能力，或能转化体外培养的啮齿类动物细胞，但对人体不出现致癌性。
血清学和直接检测法(包括电镜法)是目前呼吸道病毒检测的最常用方法。病毒的细胞培养和血清学检测操作繁琐、耗时长，不利于急性诊断，在病毒载量较低时，易造成漏检。而呼吸道病毒感染作为临床最常见的疾病之一，病原学复杂，精确的病原学分析不仅是确诊依据，也是合理选择治疗方案的基础。随着分子生物学及基因诊断技术的进步，在分子水平检测微生物，为感染性疾病诊断提供了新的检测手段。PCR技术的出现，解决了长期困扰临床的问题，这对于及时控制病情，挽救患者的生命，有积极应用价值。本研究采用的多重荧光PCR技术，操作简便、检测迅速、检出率高，同时检测3种病原体，并确定病原体感染类型，有利于对疾病进行及时诊断并选择正确的治疗方案。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于检测巨细胞病毒、EB病毒和腺病毒的引物及探针组合。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
本发明提供了一种用于同时检测巨细胞病毒、EB病毒和腺病毒的引物及探针组合，包括：
用于检测巨细胞病毒的引物对，该引物对包括：
上游引物CMV F，其序列为5’-GCAAATATGGAAACATACGTGAACA-3’(SEQ ID NO：1)；和
下游引物CMV R，其序列为5’-GCACCCATATTGTWAGTGATGCA-3’(SEQ ID NO：2)；
用于检测巨细胞病毒的探针，该探针为CMV Probe探针，其序列为：5’-CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCWG FAM-BHQ-3’(SEQ ID NO：3)；
用于检测EB病毒的引物对，该引物对包括：
上游引物EB F，其序列为5’-GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT-3’(SEQ ID NO：4)；和
下游引物EB R，其序列为5’-GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC-3’(SEQ ID NO：5)；
用于检测EB病毒的探针，该探针为EB Probe探针，其序列为：5’-TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA HEX-BHQ1-3’(SEQ ID NO：6)；
用于检测腺病毒的引物对，该引物对包括：
上游引物ADV F，其序列为5’-GTTGTCAATGTCTTAATTCGTATCAATAATT-3’(SEQ IDNO：7)；
下游引物ADV R，其序列为5’-GTAGCCTMCCTTCGGCACCTAA-3’(SEQ ID NO：8)；
用于检测腺病毒的探针，该探针为ADV Probe探针，其序列为：5’-TAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAA ROX-TAMRA-3’(SEQ ID NO：9)。
本发明进一步提供了一种用于同时检测巨细胞病毒、EB病毒和腺病毒的试剂盒，该试剂盒包括总体积为20ul的下述试剂：
在所述巨细胞、EB病毒、腺病毒引物工作液中，包括：
终浓度为0.24uM的用于检测巨细胞病毒的引物对，该引物对包括：
上游引物CMV F，其序列为5’-GCAAATATGGAAACATACGTGAACA-3’；和
下游引物CMV R，其序列为5’-GCACCCATATTGTWAGTGATGCA-3’；
终浓度为0.24uM的用于检测EB病毒的引物对，该引物对包括：
上游引物EB F，其序列为5’-GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT-3’；和
下游引物EB R，其序列为5’-GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC-3’；
终浓度为0.24uM的用于检测腺病毒的引物对，该引物对包括：
上游引物ADV F，其序列为5’-GTTGTCAATGTCTTAATTCGTATCAATAATT-3’；
下游引物ADV R，其序列为5’-GTAGCCTMCCTTCGGCACCTAA-3’；
在所述巨细胞、EB病毒、腺病毒探针工作液中，包括：
终浓度为0.12uM的用于检测巨细胞病毒的探针，该探针为CMV Probe探针，其序列为：5’-CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCWG FAM-BHQ-3’；
终浓度为0.12uM的用于检测EB病毒的探针，该探针为EB Probe探针，其序列为：5’-TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA HEX-BHQ1-3’；
终浓度为0.12uM的用于检测腺病毒的探针，该探针为ADV Probe探针，其序列为：5’-TAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAA ROX-TAMRA-3’。
本发明的实现原理：
本发明利用一对靶核酸序列的特异性引物和探针，采用一步法实时荧光定量RT-PCR试剂盒，通过PCR技术实现靶核酸序列片断的扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，在PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片断上的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号可以被检测，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而可以通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明将多重PCR与Taqman荧光探针技术结合起来，即在一次检测过程中，可对多种可能引发急性呼吸道感染的病原体进行同时检测，达到快速诊断、指导治疗的目的，从而克服常规PCR的局限性，解决了临床上的检测通量的瓶颈问题，缩短工作时间，减少原料耗损，并且具有敏感性、特异性更强、有效解决PCR污染、自动化程度更高等特点。荧光探针定量PCR检测技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及定量分析的优点。同时克服了传统PCR技术易污染、假阳性率高且不能定量的缺点，成为目前最先进的检测技术。
具体实施方式
1.引物和探针的设计：通过分别对所有已知的巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒的基因序列进行比较分析，选择高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为20碱基左右。最优引物探针序列组合如下：
(1)巨细胞病毒引物和探针：
上游引物CMV F：GCAAATATGGAAACATACGTGAACA
下游引物CMV R：GCACCCATATTGTWAGTGATGCA
探CMV Probe：CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCWG-FAM-BHQ
(2)EB病毒引物和探针：
上游引物EB F：GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT
下游引物EB R：GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC
探针EB Probe：TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA-HEX-BHQ1
(3)腺病毒引物和探针：
上游引物ADV F：GTTGTCAATGTCTTAATTCGTATCAATAATT
下游引物ADV R：GTAGCCTMCCTTCGGCACCTAA
探针ADV Probe：TAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAA
ROX-TAMRA
2.反应体系的优化：利用灭活的巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒作为待检样品，用Trizol试剂抽提病毒基因组DNA，分装后贮存于－80℃。
2.1引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒引物浓度分别从0.1μM至1.6μM作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳引物浓度是0.24μM。
2.2探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒探针浓度分别从0.1μM至0.5μM作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是0.12μM
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒实时荧光RT-PCR反应体系为25μl，
按照一步法荧光定量RT-PCR试剂盒说明进行反应液的配置。
试剂盒中的引物10uM和探针5uM浓度，是指原始浓度(即工作液浓度)，引物对的终浓度2.4uM或探针的终浓度0.12uM是在反应体系里引物与探针的终浓度。终浓度＝工作液浓度×0.6/25(试剂盒组分共20ul，检测样本5ul)。
3.仪器检测通道的选择
选择的荧光检测通道应与探针所标记的报告荧光基团一致，具体按照仪器使用说明书进行设置。
4.PCR反应条件如下
42℃30min进行逆转录反应；95℃3min,1个循环；94℃10s,55℃40s,40个循环，在55℃40s阶段收集荧光。
5.检测结果分析
如果待检样本中含有巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒，则显示阳性扩增曲线，如果FAM通道有扩增信号，则判断为巨细胞病毒感染；如果HEX通道有扩增信号，则判断为EB病毒感染；如果ROX通道有扩增信号，则判断为腺病毒感染，其检测灵敏度可以达到1000拷贝/ml，如果待检样本中没有巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒，则显示阴性扩增曲线，即无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的特异性和灵敏度。

Claims (2)

1.一种用于同时检测巨细胞病毒、EB病毒和腺病毒的引物及探针组合，其特征在于，包括：
用于检测巨细胞病毒的引物对，该引物对包括：
上游引物CMV F，其序列为5’-GCAAATATGGAAACATACGTGAACA-3’；和
下游引物CMV R，其序列为5’-GCACCCATATTGTWAGTGATGCA-3’；
用于检测巨细胞病毒的探针，该探针为CMV Probe探针，其序列为：5’-CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCWG FAM-BHQ-3’；
用于检测EB病毒的引物对，该引物对包括：
上游引物EB F，其序列为5’-GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT-3’；和
下游引物EB R，其序列为5’-GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC-3’；
用于检测EB病毒的探针，该探针为EB Probe探针，其序列为：5’-TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA HEX-BHQ1-3’；
用于检测腺病毒的引物对，该引物对包括：
上游引物ADV F，其序列为5’-GTTGTCAATGTCTTAATTCGTATCAATAATT-3’；
下游引物ADV R，其序列为5’-GTAGCCTMCCTTCGGCACCTAA-3’；
用于检测腺病毒的探针，该探针为ADV Probe探针，其序列为：5’-TAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAA ROX-TAMRA-3’。
2.一种用于同时检测巨细胞病毒、EB病毒和腺病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括总体积为20ul的下述试剂：
在所述巨细胞、EB病毒、腺病毒引物工作液中，包括：
终浓度为0.24uM的用于检测巨细胞病毒的引物对，该引物对包括：
上游引物CMV F，其序列为5’-GCAAATATGGAAACATACGTGAACA-3’；和
下游引物CMV R，其序列为5’-GCACCCATATTGTWAGTGATGCA-3’；
终浓度为0.24uM的用于检测EB病毒的引物对，该引物对包括：
上游引物EB F，其序列为5’-GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT-3’；和
下游引物EB R，其序列为5’-GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC-3’；
终浓度为0.24uM的用于检测腺病毒的引物对，该引物对包括：
上游引物ADV F，其序列为5’-GTTGTCAATGTCTTAATTCGTATCAATAATT-3’；
下游引物ADV R，其序列为5’-GTAGCCTMCCTTCGGCACCTAA-3’；
在所述巨细胞、EB病毒、腺病毒探针工作液中，包括：
终浓度为0.12uM的用于检测巨细胞病毒的探针，该探针为CMV Probe探针，其序列为：5’-CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCWG FAM-BHQ-3’；
终浓度为0.12uM的用于检测EB病毒的探针，该探针为EB Probe探针，其序列为：5’-TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA HEX-BHQ1-3’；
终浓度为0.12uM的用于检测腺病毒的探针，该探针为ADV Probe探针，其序列为：5’-TAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAA ROX-TAMRA-3’。
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