CN103290141A - 16种高危型和5种低危型hpv检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种使用杂交探针检测20种HPV亚型的试剂盒。本发明创造性的使用taqman探针与一种多重PCR方法结合来检测HPV基因型，所有的操作在一管内完成，操作简单，不需要开盖操作，避免了污染的发生；使用TM值来判断相应的HPV基因亚型；并且提供了特殊的固体形式储存方式，大大方便了运输和储存。此试剂盒主要用于检测20种HPV亚型，其中15种高危型包括：16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68；5种低危型包括6,11,40,55,70。
Description
技术领域
本发明属于第三类医疗器械-分子诊断领域，涉及一种使用多重不对称PCR方法，结合荧光探针对15种高危型及5种低危型HPV进行分型的方法及试剂盒。
背景技术
人类乳头瘤病毒(HPV)感染分为良性和恶性感染，仅感染人类宿主,大约100多种HPV亚型已经得到基因组全序列。依据造成恶性肿瘤的潜在能力不同，可以分为高危性和低危型两种。低危型的HPV感染和多种临床症状有关，高危型HPV病毒是造成子宫颈癌的主要元凶。世界卫生组织及国际癌症研究署均确认HPV是引起宫颈癌的最主要病因，99.7%的宫颈癌患者都能发现高危型HPV感染。2004年国际癌症研究署发表研究称：“HPV感染是宫颈上皮内瘤变及宫颈癌发生的必要因素，可以认为，没有HPV持续性感染的妇女几乎没有患宫颈癌的危险。”这句话基本上可以归结为这样一个等式：高危型HPV+长时间持续感染（一般为10-15年）=宫颈癌。
宫颈癌的早期筛查方式是采用巴氏涂片以及改进后的液基薄层细胞学技术（TCT），这些方法只能从细胞学病变的角度来评估宫颈癌的发病情况，也就是说，要等到遭受病毒感染的细胞开始出现明显变化时才可以检测出来。
随着对HPV感染导致宫颈癌的认识加深，以及分子诊断技术的发展，HPV基因检测作为宫颈癌的一种筛查手段得到了更广泛的应用。分子检测方法比较传统的细胞学检测方式，不需要等到细胞出现变化时才分辨出HPV感染，可以在病毒感染细胞但尚未出现症状的潜伏期，在病毒感染的最早期阶段筛查出这一病毒，从而达到早预防早治疗的目的。
目前主要有两种分子手段来检测HPV感染: 聚合酶链式反应 (PCR) 扩增编码病毒外壳的 L1 基因, 此基因在HPV亚型中高度保守；第二种是Hybrid Capture II 试剂盒 (HCII; Digene, Gaithersburg, MD, USA), 这种试剂盒检测13种高危型HPV亚型,包括： 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 以及 68. HCII 可以测定病毒载量, 但是不能分型. 因为高危型HPV和肿瘤病变级别有很大的关系, 确定高危型后,继续对高危型HPV进行亚型确定对于感染高危性HPV的妇女健康管理具有较大意义。高危型分型一般PCR后使用PGMY线性杂交，或者LIPA的线性杂交，定位于L1基因，可以精确区分不同的亚型。 然而，这些试剂盒都一定的缺陷，通量不高，不能自动读取结果，人工操作的部分太多，这样对于宫颈癌的筛查极为不利，意味着浪费大量的人力物力，而且扩增后需要开管操作，实验室潜在的污染是个很大的问题。
Luminex（xMAP）平台是液相杂交平台，其技术原理为用不同配比的两种红色分类荧光染料将直径为5.6微米(或6.5微米)的聚苯乙烯微球染成不同的荧光色,从而获得多达100种荧光编码的微球.把针对不同待测物的抗体分子或者基因探针以共价交联的方式结合到特定的编码微球上,每个编码微球都对应相应的检测项目.先把针对不同待测物的荧光编码微球混合,然后加入待测物质或者待测的扩增片段,所形成的复合物再与标记荧光素发生结合反应.微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿激光,红激光用来判定微球的荧光编码,绿激光用来测定微球上报告分子的荧光强度.从而达到快速准确的定量检测目的.这种平台和HPV检测连用起到了很好的作用，解决了通量问题，可以自动判读。但是Xmap机器价格很高，不利于推广使用。
迫切的需要一种技术，即可以解决通量问题，又便于推广使用，在此需求基础上，我们把MAP PCR和荧光探针结合起来，可以一次性检测20种HPV病毒亚型，包括15种低危型及5种高危型HPV亚型，整个过程耗时2.5小时,易于操作，不需要开管，降低了污染。
发明内容
1.本发明目的在于提供一种方法和试剂盒，这种试剂盒可以检测 20 HPVs ；其中15 种高危型包括：16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68 ；5 种低危型包括 6, 11, 40, 55, 70 。
2.本试剂盒提供的方法可以在2管内完成这20种HPVs的分型检测，全程闭管检测，不需要开盖检测，极大的降低了实验室污染情况，而且操作简单。
3.本试剂盒运用将MAP多重pcr和荧光探针结合起来，形成一种在荧光平台多重检测的方法。具体包括引物设计使用MAP引物设计方法，将引物分为三段式引物，其中5个次黄嘌呤可以在序列的特定位置。
4.本发明提供了固体形式的原料储存方式，方便了运输及储存过程。
为了实现上述目的，本试剂盒具体方法为：
1）引物设计：引物设计使用MAP三段引物设计方法，其中n代表次黄嘌呤。
| 引物名 | 序列名称 | 引物序列 |
| HPV-F | SEQ ID NO：1 | GGCCnnnnnCGTCCnAnnGGAnACTGA TC |
| HPV-R | SEQ ID NO：2 | CCCGGTAnnnnnGCnCAGGGnCATAAnAATGG |
2）探针设计：
| 检测亚型 | 序列编号 | 探针序列 | 参考Tm值 | 修饰 |
| 6 | SEQ ID NO：3 | ATCCGTAACTACATCAACCAC ATACACCAA | Tm = 65.4°C | 5’JOE 3’ BHQ1 |
| 11 | SEQ ID NO：4 | ATCTGTGTCTAAATCACCTAC ATACACTAA | Tm = 60.1°C | 5’JOE 3’ BHQ1 |
| 16 | SEQ ID NO：5 | GTCATTATGTGCTGCGTTATC TACTTCAGAAAC | Tm = 64.1°C | 5’FAM 3’BHQ1 |
| 18 | SEQ ID NO：6 | TGC TTC TAC ACA CTC TCC TGT A | Tm = 58.0°C | 5’FAM 3’BHQ1 |
| 31 | SEQ ID NO：7 | TGT TTG TGC TGC AAT TGC AAA CAG TGA TAC | Tm = 71.6°C | 5’FAM 3’BHQ1 |
| 33 | SEQ ID NO：8 | TGC ACA CAA CAA ACT AGT GAC AG | Tm = 57.3°C | 5’JOE 3’ BHQ1 |
| 35 | SEQ ID NO：9 | GTG CTG CTG TCT CTT CTA GTG A | Tm = 61.4°C | 5’JOE 3’ BHQ1 |
| 39 | SEQ ID NO：10 | TCT ACC TCT ATA GAG TCT TCC ATA CCT TCT | Tm = 68.8°C | 5’JOE 3’ BHQ1 |
| 40 | SEQ ID NO：11 | TGC CAC ACA GTC GCC CAC ACC AA | Tm = 72.1°C | 5’red 610 3’BHQ2 |
| 45 | SEQ ID NO：12 | ACA CAA AAT CGA CTG CCA AGT A | Tm = 51.4°C | 5’red 610 3’BHQ2 |
| 51 | SEQ ID NO：13 | CAC TGC TGC GCT TTC CCC AA | Tm = 63.9°C | 5’red 610 3’BHQ2 |
| 52 | SEQ ID NO：14 | GCT GAG GTT AAA AAG GAA AGC A | Tm = 65.0°C | 5’red 610 3’BHQ2 |
| 53 | SEQ ID NO：15 | TTT CTG CAA CGT CAC AGT CTA TGT CCA | Tm = 62.9°C | 5’CY5 3’BHQ3 |
| 55 | SEQ ID NO：16 | TGC TGC TAC AAC TCA GTC TCC ATC TAC A | Tm = 70.9°C | 5’red 610 3’BHQ2 |
| 56 | SEQ ID NO：17 | ACT GCT ACA GAA GAG TAA GTA AA T ATG AT | Tm = 62.2°C | 5’CY5 3’BHQ3 |
| 58 | SEQ ID NO：18 | TAT GCA CTG AAG TAA CTA AGG AAG GT | Tm = 68.4°C | 5’CY5 3’BHQ3 |
| 59 | SEQ ID NO：19 | CTA CTT CTT CTA AAG CTA ATG TAT ACA CAC | Tm = 56.1°C | 5’FAM 3’BHQ1 |
| 66 | SEQ ID NO：20 | TGC AGC TAA AAGG ACA TTA ACT AA | Tm = 60.6°C | 5’FAM 3’BHQ1 |
| 68 | SEQ ID NO：21 | CTG AAT CAG CTG TAC CAA ATA TTT AT | Tm = 63.3°C | 5’FAM 3’BHQ1 |
| 70 | SEQ ID NO：22 | TG CAC CGA AAC GGC CAT ACC T | Tm = 65.4°C | 5’CY5 3’BHQ3 |
3）分组及Tm值参考：20种HPV分为两组，第一组包括12格高危型，分别是：16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58.参考值范围为理想值范围上下波动不超过0.5℃。第二组包括3种高危型和5种低危型，分别是：59，66，68，6，11，40，55。参考值范围为理想值范围上下波动不超过0.5℃，本试剂盒仅可使用配套的试剂做曲线分析，如果更换pcr反应液则结果解释无意义。
4)固体反应物制备：
反应体系和固体反应物的制备：每人份反应物包括正向引物每种为0.4μM，负向引物浓度为10μM, 2ul dUTPs (2.5 mM of each dUTP), 5mM MgCl2,1.5U热启动聚合酶，0.2U焦磷酸酶、0.2U UNG酶、10%的海藻糖，1%的甘油，每种荧光探针100nM，以上混合液低温冻干，依据上面的分组，分为A颗粒和B颗粒。
5）阳性参考品和阴性参考品的制备：
本试剂盒采取11型HPV作为阳性参考品。用引物对插入到pMD-T vector中的HPV的L1基因进行扩增。PCR反应体系为50ul，包含l0x buffer，5.0ul；25mM MgCl2，6.0 ul；l0mM dNTP，0.5ul；l00uM引物混合物，0. 5ul；ddH2O，35. 4ul；UNGase (IU/ul)，0.2ul；TaqDNA聚合酶，0.4ul；模板DNA，2.0ul；共50ul。-20±3℃避光、密封储存，避免反复冻融，有效期为自生产之日起一年。
5）提取。常规方法从患者组织中提取获得的核酸，其样本来源包括外周血，患者病变组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片、冰冻切片等，包括柱法提取和磁珠提取方法。
6）Q-PCR反应体系和反应程序：
95℃ 10min
95 ℃ 30 s, 53℃ 90s 68℃ 1min 15 次循环
95 ℃ 30 s, 58℃ 90s 68℃ 1min 45次循环
45℃到95℃做溶解曲线，每秒收集5次荧光。
附图说明：
图1：引物设计，三段式引物，其中p2段为次黄嘌呤，可以位于头部，尾部或者中间。
a,b,c分别代表引物不同的设计结构，P1段接头序列可能来自生物体本身DNA序列，也可能是人工制造序列。
图2：MAP扩增示意图，本试剂盒仅采用一对引物进行扩增优化。
图3：FAM通道检测图：可检测16、18、31型HPV；
图4：Hex通道检测图:可检测33、35、39型HPV；
图5：RED通道检测图：可检测45、51、52型HPV；
图6：Cy5通道检测图：可检测53、56、58型HPV；
图7：一例实际样本检测图，为HPV16和HPV68混合感染
具体实施方案：临床新鲜组织样本检测。
第一步：样本DNA的提取，本提取方法来自天根生化有限公司DP322中的方法。
1. 处理材料：
将擦拭过的样本棉签转置于2ml 离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，加入400 μl 缓冲液GA。振荡15 秒，室温放置5 分钟。
2. 加入20 μl 蛋白酶K 溶液，涡旋10 秒混匀，56℃放置60 分钟，其间每15 分钟涡旋混匀数次。
3. 加入400 μl 缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 分钟。
4. 加200μl 无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心。
5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR 中（吸附柱CR 放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g)离心30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR 放回收集管中。
6. 向吸附柱CR 中加入500 μl 缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g)离心30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR 放回收集管中。
7. 向吸附柱CR 中加入700 μl 漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g)离心30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR 放回收集管。
8. 向吸附柱CR 中加入500 μl 漂洗液PW，12,000 rpm (~13,400×g)离心30 秒，倒掉收集管中的废液。
9. 将吸附柱CR 放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g)离心2 分钟，倒掉废液。将吸附柱CR 室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10. 将吸附柱CR 转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50 μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5 分钟，12,000 rpm (~13,400×g)离心2 分钟。
11.制备的样本DNA待用。
第二步：PCR扩增
1 将试剂盒中冻干的PCR固体反应物A，B分别加超纯水10μl，加入DNA模板，加水补足至20ul。
2 反应程序为：
95 ℃ 15min
95 ℃ 30 s, 53℃ 30s 72℃ 50S 15 次循环
95 ℃ 30 s, 76℃ 90s 45次循环
45-95 溶解曲线 每秒收集荧光5次。通道选择FAM，HEX，ROX，CY5通道。
第三步：对照每个通道参考Tm值范围，来确定具体基因型。只有在范围内可以认为是突变。如果Tm值临界值附近，则应考虑加样误差。如重复做结果仍然一致，则遵循参考。
结果：2例临床样本分别为16型和68型，实验结果与测序法试剂盒结果相符。展示了该试剂盒的灵敏性和特异性。
结论：本发明所述试剂盒能够快速、准确检测HPV突变，对于预防肿瘤具有重大的意义。
Claims (5)
1.一种人类HPV基因分型的检测方法和试剂盒，其特征在于使用多重不对称PCR扩增，荧光杂交探针做溶解曲线以判断结果、以及包括固体形式存在的1xPCR反应物（由引物混合物、tris-cl、Kcl、MgCl2 、热启动聚合酶、UNG酶、焦磷酸酶和冻干保护剂组成）、其特殊之处在于：
a：特殊的三段式引物，其三段式引物设计及后继的扩增为独创的MAP（多重单链PCR扩增）技术，其序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2；
b：特殊的探针，所选取的20个探针具有良好的特异性和保守性，可以根据不同的Tm值的判断基因亚型，探针序列为SEQ ID NO:3~SEQ ID NO. 22；
c：特殊的存储条件:本试剂盒为PCR反应物提供了固体形式的存储方式。
2.权利要求1所述试剂盒，引物扩增策略为二轮扩增，分为双链对称扩增阶段和单链不对称扩增阶段。
3.权利要求1中的试剂盒，其冻干保护剂成分由海藻糖，甘油和粘合剂组成。
4.权利要求1中的试剂盒，其PCR产物的检测方法除了荧光探针杂交外，还可以是斑点杂交，反向斑点杂交、液相杂交平台。
5.权利1中所述的试剂盒，其用途在于对HPV20种基因亚型的分型检测。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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