CN103409554B - 一种快速检测麻疹病毒/风疹病毒的核酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测麻疹病毒/风疹病毒的核酸检测试剂盒，试剂盒包括RT-PCR反应液、酶混合液、麻疹病毒/风疹病毒反应液、阳性对照和阴性对照。本发明克服了现有技术中麻疹病毒/风疹病毒检测试剂盒大多存在特异性差、灵敏性较低等缺陷，本发明具有高通量、操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点，在临床诊断、疾病监测等领域具有极大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸检测试剂盒，具体涉及一种快速检测麻疹病毒/风疹病毒的核酸检测试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性呼吸道传染病。主要通过飞沫传播，临床症状有发热、咳嗽、流涕、眼结膜充血、口腔粘膜有红晕的灰白小点。单纯麻疹预后良好，重症患者病死率较高。感染者是唯一的传染源，自发病前2天(潜伏期末)至出疹后5天内，眼结膜分泌物、鼻、口咽、气管的分泌物中都含有病毒，具有传染性。麻疹病毒是麻疹的病原体，分类上属于副粘病毒科麻疹病毒属，麻疹病毒只有一个血清型，人是麻疹病毒的自然界中唯一的宿主。风疹是由风疹病毒引起的一种急性呼吸道传染病。主要通过呼吸道和直接接触传播。其临床特征为上呼吸道轻度炎症、发热、全身红色斑丘疹、耳后、枕后及颈部淋巴结肿大，病情较轻，预后良好。孕妇在怀孕早期感染风疹，易导致胎儿发生先天性风疹综合症。风疹病毒为RNA病毒，属于披盖病毒属。风疹病毒抗原结构稳定，只有一种抗原型，只感染人类。
风疹与轻型麻疹症状相似，与人类小DNA病毒B19、猩红热、幼儿急疹和肠道病毒引起的出疹容易混淆。所以实验室鉴别诊断的地位愈来愈重要。常用的风疹、麻疹的实验室检测方法主要有病毒分离培养、血清学检测以及核酸检测等方法。由于Elisa法检测灵敏度低，假阳性高；病毒分离培养费时费力，不利于快速检测，且病毒培养具备一定的危险性。近年来运用荧光PCR技术检测的病毒种类越来越多。对于荧光PCR检测病毒来说，引物的设计至关重要，其直接影响检测的特异性。如果引物的特异性不够，则可能导致假阳性的出现。我们针对病毒特异的靶序列设计Taqman探针，用于检测病毒时很大程度上保证了结果的特异性。
目前国内的核酸诊断中应用最为广泛的是以荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术。检测探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5′→3′外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。在每次PCR循环中，都有新的报告基团被剪切，因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比。
双重荧光定量PCR技术则是在同一反应体系中加入两条不同荧光标记的探针。例如，针对靶基因1的探针标记FAM，针对靶基因2的探针标记HEX。PCR反应过程中，若待检样本包含靶基因1，则标记FAM的探针产生荧光信号；若待检样本包含靶基因2，则标记HEX的探针产生荧光信号。这样，同一管反应则可确定两个靶基因(如图1所示)。
现有的麻疹病毒/风疹病毒检测试剂盒大多存在特异性差、灵敏性较低等缺陷，有待改进。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是克服现有的麻疹病毒/风疹病毒检测试剂盒特异性差、灵敏性较低等缺陷，提供一种快速检测麻疹病毒/风疹病毒的核酸检测试剂盒，该试剂盒具有高通量、操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点，对麻疹病毒/风疹病毒的检测具有良好的应用前景。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种快速检测麻疹病毒/风疹病毒的核酸检测试剂盒，包括以下各组分：RT-PCR反应液、酶混合液、麻疹病毒/风疹病毒反应液、阳性对照和阴性对照。
其中，所述的麻疹病毒/风疹病毒反应液包括以下2组组分：
组分(1)：由一对检测麻疹病毒的引物和一条检测麻疹病毒的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；探针的碱基序列为SEQIDNo.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(2)：由一对检测风疹病毒的引物和一条检测风疹病毒的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示；探针的碱基序列为SEQIDNo.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。
其中，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED640等荧光报告基团，且组分(1)和组分(2)中的荧光报告基团不同；所述的荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra等任意两种荧光淬灭基团。
本发明对上述引物和探针的配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果：
检测麻疹病毒的引物及探针的配比为：SEQIDNo.1∶SEQIDNo.2∶SEQIDNo.3为5∶5∶2；优选的，引物SEQIDNo.1为500nM，SEQIDNo.2为500nM，探针SEQIDNo.3为200nM。
检测风疹病毒的引物及探针的配比为：SEQIDNo.4∶SEQIDNo.5∶SEQIDNo.6为5∶5∶2；优选的，引物SEQIDNo.1为500nM，SEQIDNo.2为500nM，探针SEQIDNo.3为200nM。
麻疹病毒/风疹病毒引物探针核苷酸序列见表1：
表1麻疹病毒/风疹病毒引物探针
| 名称 | 序列(5′→3′) |
| 麻疹-FP | ACTGGCATCTGAACTCGGTATC(SEQ ID No.1) |
| 麻疹-RP | GGTCCTGTCCTCAGTAGTATGC(SEQ ID No.2) |
| 麻疹-P | X1-TCTCTGAAACAAGCCTTGCATCCTCGG-Y1(SEQ ID No.3) |
| 风疹-FP | CCGCTTTGAGTCCAAGATTGTG(SEQ ID No.4) |
| 风疹-RP | TGGGGATCTCGCAGATACAGG(SEQ ID No.5) |
| 风疹-P | X2-TGGCCTCAAGGTCCCACGGAGCAA-Y2(SEQ ID No.6) |
注：X1和X2为荧光报告基团，Y1和Y2为荧光淬灭基团。
本发明快速检测麻疹病毒/风疹病毒的核酸检测试剂盒中，所述的酶混合液包括Taq酶和逆转录酶，逆转录酶为M-MLV逆转录酶，Taq酶为热启动Taq酶；
所述的RT-PCR反应液包括10×缓冲液、25mMMgCl2和10mMdNTPs；
所述的阳性对照为灭活的病毒培养液；所述的阴性对照为去RNA酶水。
本发明的试剂盒采用双重荧光定量PCR技术，设计麻疹病毒和风疹病毒探针，在同一反应体系中实现同时检测麻疹病毒和风疹病毒。引物和探针的设计采用primer5.0专用软件设计，将设计的引物和探针在NCBI的GeneBank进行比对，检测引物和探针的特异性。引物和探针在专业合成公司合成，采用紫外分光光度计测定光密度值(A260nm/A280nm在1.8-2.0之间为合格)。
本发明提供的一种快速检测麻疹、风疹病毒的核酸检测试剂盒具有如下技术效果：
1)本试剂盒操作简便且能有效防止污染，PCR荧光检测时间(从标本处理开始)仅为2-3小时，而且在同一反应体系中实现同时检测麻疹/风疹病毒。PCR荧光检测是全封闭操作，加入样本抽提产物之后可以不再打开管盖，减少了污染产生的机会。
2)能够同时检测出麻疹和风疹病毒，解决了现有产品只能在一管中检测一种病毒的问题。本发明还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观等优点，在临床诊断、疾病预防监测领域具有极大的应用前景。
附图说明
图1是双重荧光定量PCR技术原理图；
图2是本发明试剂盒检测样本的曲线图；
图3是本发明试剂盒检测麻疹病毒的灵敏度试验结果图；
图4是本发明试剂盒检测风疹病毒的灵敏度试验结果图；
图5是本发明试剂盒检测麻疹、风疹病毒的特异性试验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例与试验例中所用试剂均为市售。
实施例1一种快速检测麻疹病毒/风疹病毒的核酸检测试剂盒
上述试剂盒包括RT-PCR反应液、酶混合液、麻疹病毒/风疹病毒反应液、阳性对照和阴性对照；
其中，RNA酶抑制剂为DEPC水(其中，1L水中加入1mlDEPC)；RT-PCR反应液包括10×缓冲液、25mMMgCl2和10mMdNTPs；
麻疹病毒/风疹病毒反应液包括以下组分：
组分(1)：由一对检测麻疹病毒的引物和一条检测麻疹病毒的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；探针的碱基序列为SEQIDNo.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；检测麻疹病毒的引物SEQIDNo.1为500nM，SEQIDNo.2为500nM，探针SEQIDNo.3为200nM；
组分(2)：由一对检测风疹病毒的引物和一条检测风疹病毒的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示；探针的碱基序列为SEQIDNo.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；检测风疹病毒的引物SEQIDNo.4为500nM，SEQIDNo.5为500nM，探针SEQIDNo.6为200nM。
荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、CY3或CY5荧光报告基团，且组分(1)和组分(2)中的荧光报告基团不同；荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或BHQ3任意两种荧光淬灭基团。
酶混合液：包括Taq酶和逆转录酶，其中，Taq酶为热启动Taq酶，逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
阳性对照为灭活的病毒培养液；阴性对照为去RNA酶水。
试验例1本发明试剂盒的使用方法包括下列步骤：
1、提取样本RNA
1.1取200ul临床样品，加入400ulBindingBuffersupplementedwithPoly(A)，充分混匀后转入高纯化过滤管，8000rmp离心15s，弃去收集管中的废液。
1.2加入500ulInhibitorRemovalBuffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去收集管中的废液。
1.3加入450ulWashingBuffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去收集管中的废液。
1.4重复步骤1.3，然后高速离心10s，此步骤务必将废液去除干净.
1.5加入50ulElutionBuffer至过滤管中，室温静置2min，8000rmp离心1min，离心所得溶液即为纯化的RNA。
2在每个PCR反应管放入组分如表2中所示的麻疹病毒/风疹病毒检测试剂和RNA样本，其中麻疹病毒/风疹病毒反应液按照表3配制：
表2
| 反应液组分 | 加量(ul)/1人份 |
| RT-PCR反应液 | 7.5 |
| 酶混合液 | 5 |
| 麻疹病毒/风疹病毒反应液 | 4 |
| 去RNA酶水(阴性参考品) | 3.5 |
| RNA样本 | 5 |
| 总体积 | 25 |
表3
| 试剂名称 | 加入体积(μl)/50人份 |
| 麻疹FP | 6.25 |
| 麻疹RP | 6.25 |
| 麻疹P | 2.5 |
| 风疹FP | 6.25 |
| 风疹RP | 6.25 |
| 风疹P | 2.5 |
| 去RNA酶水 | 170 |
| 总计 | 200 |
3、在荧光定量PCR扩增仪中扩增，按照下列程序进行PCR扩增：
4、扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染麻疹病毒/风疹病毒。扩增曲线如图2所示。
结果判定：在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为麻疹病毒阳性；无典型“S”型扩增或CT＞35.0，判断为麻疹病毒阴性。在HEX通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为风疹病毒阳性；无典型“S”型扩增或CT＞35.0，判断为风疹病毒阴性。
5个临床样本具体检测结果见表4。
表4
试验例2本发明试剂盒的灵敏性试验
阳性参考品为灭活的病毒培养液，来源于江苏省疾病预防控制中心。
阴性参考品为去RNA酶水，用电子天平称取1g的DEPC，补纯化水至1000ml混匀，然后在灭菌锅中121℃，20min高温灭菌，做好标记，室温保存。
采用本发明试剂盒进行检测。
检测结果表明本发明试剂盒具有良好的灵敏性，并且CT值随浓度减少呈梯度改变，见图3、图4。
试验结果表明，本发明试剂盒对于麻疹病毒/风疹病毒的诊断具有高度的灵敏性。
试验例3本发明试剂盒的特异性试验
用本发明麻疹病毒/风疹病毒检测试剂盒检测流感病毒、呼吸道合胞病毒、人腺病毒、人副流感病毒、冠状病毒和博卡病毒。
检测结果表明：FAM通道仅对麻疹病毒进行扩增，HEX通道仅对风疹病毒进行扩增。
试验结果表明本发明检测试剂盒能特异性扩增流感病毒，而不与其它病毒核酸发生交叉反应，见图5。
Claims (7)
1.一种快速检测麻疹病毒/风疹病毒的核酸检测试剂盒，包括以下各组分：RT-PCR反应液、酶混合液、麻疹病毒/风疹病毒反应液、阳性对照和阴性对照；
其中，所述的麻疹病毒/风疹病毒反应液包括以下2组组分：
组分(1)：由一对检测麻疹病毒的引物和一条检测麻疹病毒的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；探针的碱基序列为SEQIDNo.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；所述的检测麻疹病毒的引物及探针的配比为：SEQIDNo.1:SEQIDNo.2:SEQIDNo.3为5:5:2；
组分(2)：由一对检测风疹病毒的引物和一条检测风疹病毒的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示；探针的碱基序列为SEQIDNo.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团，所述的检测风疹病毒的引物及探针的配比为：SEQIDNo.4:SEQIDNo.5:SEQIDNo.6为5:5:2。
2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LCRED640，且组分(1)和组分(2)中的荧光报告基团不同；所述的荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中任意两种荧光淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的检测麻疹病毒的引物及探针的配比为：引物SEQIDNo.1为500nM，SEQIDNo.2为500nM，探针SEQIDNo.3为200nM。
4.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的检测风疹病毒的引物及探针的配比为：引物SEQIDNo.1为500nM，SEQIDNo.2为500nM，探针SEQIDNo.3为200nM。
5.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的RT-PCR反应液包括10×缓冲液、25mMMgCl2和10mMdNTPs。
6.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的酶混合液包括Taq酶和逆转录酶，其中，Taq酶为热启动Taq酶，逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
7.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为灭活的病毒培养液；所述的阴性对照为去RNA酶水。
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