CN104195264A - 一种快速检测柯萨奇病毒a6型/a10型的核酸检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种快速检测柯萨奇病毒a6型/a10型的核酸检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括RT-PCR反应液、酶混合液、柯萨奇病毒A6/A10反应液、阳性对照和阴性对照。本发明克服了现有技术中柯萨奇病毒A6型/A10型检测试剂盒大多存在特异性差、灵敏性较低等缺陷，提出了一种具有高通量、操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点的柯萨奇病毒A6型/A10型核酸检测试剂盒，在柯萨奇病毒A6型以及A10型的临床诊断、疾病监测等方面具有极大的应用前景。

Description

一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种核酸检测试剂盒，具体涉及一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
柯萨奇病毒是Dalldorf和Sickles在1948年首先于纽约柯萨奇分离出此病毒而得名。柯萨奇病毒属于肠道病毒属，单股RNA病毒，呈球形，无包膜。根据病毒致新生小白鼠病变的特点，可将柯萨奇病毒分为A、B两群共30个型。柯萨奇病毒可以引起脑膜炎和轻度麻痹、胸膜痛、肋间痛、呼吸性疾病、结膜炎以及手足口综合征。手足口病是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，是我国法定报告管理的丙类传染病。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。
引起手足口病的病原体主要是肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型，但随着流行趋势的变化，有数据表明在2012年9月到2013年8月广东省爆发的手足口病中，柯萨奇病毒A6型已经替代了肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型成为了最常见的病原体。近年来我国的广东省、北京市、上海市、台湾省、福建省等地也有规模性爆发柯萨奇病毒A6型/A10型引起的手足口病。所以该疾病的早期诊断十分重要。
目前国内的核酸诊断中应用最为广泛的是以荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术。检测探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5′→3′外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。在每次PCR循环中，都有新的报告基团被剪切，因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比。对于荧光PCR检测病毒来说，引物的设计至关重要，其直接影响检测的特异性。如果引物的特异性不够，则可能导致假阳性的出现。
双重荧光定量PCR技术则是在同一反应体系中加入两条不同荧光标记的探针。例如，针对靶基因1的探针标记FAM，针对靶基因2的探针标记VIC。PCR反应过程中，若待检样本包含靶基因1，则标记FAM的探针产生荧光信号；若待检样本包含靶基因2，则标记VIC的探针产生荧光信号。这样，同一管反应则可确定两个靶基因(如图1所示)。
现有的柯萨奇病毒A6型/A10型检测试剂盒大多存在特异性差、灵敏性较低等缺陷，有待改进。本发明针对柯萨奇病毒A6型以及A10型病毒的靶序列分别设计了一对特异性引物序列以及Taqman探针，在很大程度上保证了用于检测病毒时的结果的特异性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的柯萨奇病毒A6型/A10型检测试剂盒特异性差、灵敏性较低等缺陷，提供一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒，该试剂盒具有高通量、操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点，对柯萨奇病毒A6型/A10型的检测具有良好的应用前景。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明的一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒，包括以下各组分：RT-PCR反应液、酶混合液、柯萨奇病毒A6/A10反应液、阳性对照和阴性对照，其中，所述的柯萨奇病毒A6型/A10型反应液包括以下2组组分：
组分(1)：由一对检测柯萨奇病毒A6型的引物和一条检测柯萨奇病毒A6型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(2)：由一对检测柯萨奇病毒A10型的引物和一条检测柯萨奇病毒A10型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。
在本发明中，优选的，组分(1)和组分(2)中所述的荧光报告基团分别选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED640等荧光报告基团中的任一种，且组分(1)和组分(2)中的荧光报告基团不同；组分(1)和组分(2)中所述的荧光淬灭基团分别选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra等荧光淬灭基团中的任一种。
本发明对上述引物和探针的摩尔配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的摩尔配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果：
在本发明中，优选的，检测柯萨奇病毒A6型的引物及探针的配比为：SEQ IDNo.1:SEQ ID No.2:SEQ ID No.3为3:3:2；
在本发明中，优选的，检测柯萨奇病毒A10型的引物及探针的配比为：SEQ IDNo.4:SEQ ID No.5:SEQ ID No.6为1:1:1。
在本发明中，优选的，组分(1)和组分(2)中的探针摩尔比配比为：SEQ IDNo.3:SEQ ID No.6＝1:1。
柯萨奇病毒A6型/A10型引物探针核苷酸序列见表1：
表1柯萨奇病毒A6型/A10型引物探针
名称 序列(5′→3′)
A6型-FP TAAGCCGGATAGCAGGAAATC(SEQ ID No.1)
A6型-RP TGTAGGGTAACCATCATAAAAC(SEQ ID No.2)
A6型-P X1-CAGGTGTCTGTCCCGTTCATGTCGCCA-Y1(SEQ ID No.3)
A10型-FP TCAATCTTTGTTAAACTCAC(SEQ ID No.4)
A10型-RP TTAGGGCATAATCCGTATGCT(SEQ ID No.5)
A10型-P X2-AGTCCCTTTCATGTCCCCGGCCAGT–Y2(SEQ ID No.6)
注：X1和X2为荧光报告基团，Y1和Y2为荧光淬灭基团。
在本发明中，优选的，所述的酶混合液包括Taq酶和逆转录酶，逆转录酶为M-MLV逆转录酶，Taq酶为热启动Taq酶；
在本发明中，优选的，所述的RT-PCR反应液包括10×缓冲液、25mMMgCl2和10mMdNTPs；
在本发明中，优选的，所述的阳性对照为灭活的柯萨奇病毒A6型以及A10型的病毒培养液；所述的阴性对照为去RNA酶水。
进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的核酸检测试剂盒在制备检测柯萨奇病毒A6型或柯萨奇病毒A10型的试剂中的应用。
以上任一项所述的核酸检测试剂盒在制备同时检测柯萨奇病毒A6型及柯萨奇病毒A10型的试剂中的应用。
本发明的试剂盒采用双重荧光定量PCR技术，分别设计针对柯萨奇病毒A6型和A10型的特异性引物和探针，实现了在同一反应体系中同时检测柯萨奇病毒A6型和A10型的目的。引物和探针的设计采用primer 5.0专用软件设计，将设计的引物和探针在NCBI的GeneBank进行比对，检测引物和探针的特异性。引物和探针在专业合成公司合成，采用紫外分光光度计测定光密度值(A260nm/A280nm在1.8-2.0之间为合格)。
本发明提供的一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒具有如下技术效果：
1)本发明试剂盒操作简便且能有效防止污染，PCR荧光检测时间(从标本处理开始)仅为2-3小时，而且在同一反应体系中实现同时检测柯萨奇病毒A6型、A10型。PCR荧光检测是全封闭操作，加入样本抽提产物之后可以不再打开管盖，减少了污染产生的机会。
2)能够同时检测出柯萨奇病毒A6型和A10型，解决了现有产品只能在一管中检测一种病毒的问题。本发明还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观等优点，在临床诊断、疾病预防监测领域具有极大的应用前景。
附图说明
图1是双重荧光定量PCR技术原理图；
图2是本发明试剂盒检测样本3的曲线图；
图3是本发明试剂盒检测柯萨奇病毒A6型的灵敏度试验结果图；
图4是本发明试剂盒检测柯萨奇病毒A10型的灵敏度试验结果图；
图5是本发明试剂盒检测柯萨奇病毒A6型的特异性试验结果图；
图6是本发明试剂盒检测柯萨奇病毒A10型的特异性试验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例与试验例中所用试剂均为市售。
实施例1 一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒的制备
所述试剂盒包括RT-PCR反应液、酶混合液、柯萨奇病毒A6/A10反应液、阳性对照和阴性对照；
其中，RT-PCR反应液包括10×缓冲液、25mM MgCl2和10mM dNTPs；
其中，柯萨奇病毒A6型/A10型反应液包括以下组分：
组分(1)：由一对检测柯萨奇病毒A6型的引物和一条检测柯萨奇病毒A6型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团FAM，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ1；检测柯萨奇病毒A6型的引物SEQ ID No.1为600nM，SEQ ID No.2为600nM，探针SEQ ID No.3为400nM；
组分(2)：由一对检测柯萨奇病毒A10型的引物和一条检测柯萨奇病毒A10型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团VIC，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ2；检测柯萨奇病毒A10型的引物SEQ ID No.4为400nM，SEQ ID No.5为400nM，探针SEQ ID No.6为400nM。用去RNA酶水配制。
其中，酶混合液包括Taq酶和逆转录酶，其中，Taq酶为热启动Taq酶，逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
其中，阳性对照为灭活的病毒培养液；阴性对照为去RNA酶水。
实施例2 本发明试剂盒在检测柯萨奇病毒A6型/A10型中的应用
1、提取样本RNA
1.1取200ul临床样品，加入400ul Binding Buffer supplemented with Poly(A)，充分混匀后转入高纯化过滤管，8000rmp离心15s，弃去收集管中的废液。
1.2加入500ul Inhibitor Removal Buffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去收集管中的废液。
1.3加入450ul Washing Buffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去收集管中的废液。
1.4重复步骤1.3，然后高速离心10s，此步骤务必将废液去除干净.
1.5加入50ul Elution Buffer至过滤管中，室温静置2min，8000rmp离心1min，离心所得溶液即为纯化的RNA。
2、在每个PCR反应管放入组分如表2中所示的柯萨奇病毒A6型/A10型检测试剂(实施例1制备)和RNA样本：
表2
反应液组分 加量(ul)/1人份
RT-PCR反应液 7.5
酶混合液 5
柯萨奇病毒A6/A10反应液 4
去RNA酶水(阴性参考品) 3.5
RNA样本 5
总体积 25
3、在荧光定量PCR扩增仪中扩增，按照下列程序进行PCR扩增：
4、扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染柯萨奇病毒A6型/A10型。
结果判定：在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为柯萨奇病毒A6型阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.0，判断为柯萨奇病毒A6型阴性。在VIC通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为柯萨奇病毒A10型阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.0，判断为柯萨奇病毒A10型阴性。
5个临床样本具体检测结果见表4。其中样本3的扩增曲线如图2所示。
表4
试验例1 本发明试剂盒的灵敏性试验
阳性参考品为灭活的柯萨奇病毒A6型以及A10型病毒培养液。分别将柯萨奇病毒A6型和A10型病毒培养液的核酸提取液2×108copies/ml进行10倍的梯度稀释至2×107copies/ml、2×106copies/ml、2×105copies/ml、2×104copies/ml、2×103copies/ml、2×102copies/ml六个浓度进行灵敏度试验。
阴性参考品为去RNA酶水，用电子天平称取1g的DEPC，补纯化水至1000ml混匀，然后在灭菌锅中121℃，20min高温灭菌，做好标记，室温保存。
采用本发明试剂盒(实施例1制备)按照实施例2相同的方法进行检测。
检测结果表明本发明试剂盒具有良好的灵敏性，并且CT值随浓度减少呈梯度改变，结果见图3、图4。
试验结果表明，本发明试剂盒对于柯萨奇病毒A6型/A10型的诊断具有高度的灵敏性。
试验例2 本发明试剂盒的特异性试验
用本发明柯萨奇病毒A6型/A10型检测试剂盒(实施例1制备)检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、肠道腺病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒和风疹病毒等。
检测结果表明：FAM通道仅对柯萨奇病毒A6型进行扩增，VIC通道仅对柯萨奇病毒A10型进行扩增。
试验结果表明本发明检测试剂盒能特异性扩增柯萨奇病毒A6型/A10型，而不与其它病毒核酸发生交叉反应，结果见图5、图6。

Claims (10)

1.一种快速检测柯萨奇病毒A6型/A10型的核酸检测试剂盒，包括以下各组分：RT-PCR反应液、酶混合液、柯萨奇病毒A6/A10反应液、阳性对照和阴性对照，其中所述的柯萨奇病毒A6/A10反应液包括以下2组组分：
组分(1)：由一对检测柯萨奇病毒A6型的引物和一条检测柯萨奇病毒A6型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，所述探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(2)：由一对检测柯萨奇病毒A10型的引物和一条检测柯萨奇病毒A10型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.6所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，组分(1)和组分(2)中所述的荧光报告基团分别选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRed或LC RED640中的任一种，且组分(1)和组分(2)中的荧光报告基团不同；组分(1)和组分(2)中所述的荧光淬灭基团分别选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任一种。
3.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的检测柯萨奇病毒A6型的引物及探针的摩尔配比为：SEQ ID No.1:SEQ ID No.2:SEQ ID No.3为3:3:2。
4.根据权利要求1或3所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的检测柯萨奇病毒A10型的引物及探针的摩尔配比为SEQ ID No.4:SEQ ID No.5:SEQ IDNo.6为1:1:1。
5.根据权利要求1、3或4所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，组分(1)和组分(2)中的探针摩尔配比为SEQ ID No.3:SEQ ID No.6＝1:1。
6.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的RT-PCR反应液还包括10×缓冲液、25mM MgCl2和10mM dNTPs。
7.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的酶混合液包括Taq酶和逆转录酶，其中，Taq酶为热启动Taq酶，逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
8.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为灭活的柯萨奇病毒A6型以及A10型的病毒培养液；所述的阴性对照为去RNA酶水。
9.权利要求1-8任一项所述的核酸检测试剂盒在制备检测柯萨奇病毒A6型或柯萨奇病毒A10型的试剂中的应用。
10.权利要求1-8任一项所述的核酸检测试剂盒在制备同时检测柯萨奇病毒A6型及柯萨奇病毒A10型的试剂中的应用。
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