CN106868205A - 同时检测ev71型肠道病毒和a10型柯萨奇病毒的检测试剂及试剂盒 - Google Patents

同时检测ev71型肠道病毒和a10型柯萨奇病毒的检测试剂及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN106868205A
CN106868205A CN201710079233.9A CN201710079233A CN106868205A CN 106868205 A CN106868205 A CN 106868205A CN 201710079233 A CN201710079233 A CN 201710079233A CN 106868205 A CN106868205 A CN 106868205A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
types
coxsackie virus
enterovirus
sense primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710079233.9A
Other languages
English (en)
Inventor
李泓彦
詹馨恵
姚飞平
杨彪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Ai Weidi Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Ai Weidi Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Ai Weidi Biological Technology Co Ltd filed Critical Shenzhen Ai Weidi Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201710079233.9A priority Critical patent/CN106868205A/zh
Publication of CN106868205A publication Critical patent/CN106868205A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂及试剂盒。该检测试剂包括上游引物EV71F1、下游引物EV71R1、探针EV71P1、上游引物CA10F2、下游引物CA10R2以及探针CA10P2。采用该检测试剂处理样本后，能够实现同时对样本中EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒扩增，实现对一管标本同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒两个项目。节省检测时间，灵敏度较高。

Description

同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂及 试剂盒
技术领域
本发明涉及诊断技术领域，特别是涉及一种同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂及试剂盒。
背景技术
手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以EV71型肠道病毒(EV71)和A16型柯萨奇病毒(Cox A16，CA16)最为常见。但随着流行趋势的变化，有数据表明在2014年到2015年广东省爆发的手足口病中，A10型的柯萨奇病毒(Cox A10，CA10)已经取代了A16型的柯萨奇病毒(Cox A16，CA16)，成为了柯萨奇病毒常见的病原体。近年来我国北京市、上海市、广东省、福建省、台湾省等地均有规模爆发EV71型肠道病毒和A10型的柯萨奇病毒引起的手足口病，所以这两种肠道病毒的早期检测十分重要。
然而，目前暂未报道有同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂及试剂盒。
发明内容
基于此，有必要提供一种同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂及试剂盒。
一种同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂，包括：
用于扩增EV71型肠道病毒的上游引物EV71F1，所述上游引物EV71F1的序列为SEQID No.1所示的序列；
用于扩增EV71型肠道病毒的下游引物EV71R1，所述下游引物EV71R1的序列为SEQID No.2所示的序列；
用于检测EV71型肠道病毒的探针EV71P1，所述探针EV71P1的两端分别结合有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团；
用于扩增A10型柯萨奇病毒的上游引物CA10F2，所述上游引物CA10F2的序列为SEQID No.3所示的序列；
用于扩增A10型柯萨奇病毒的下游引物CA10R2，所述下游引物CA10R2的序列为SEQID No.4所示的序列；以及
用于检测A10型柯萨奇病毒的探针CA10P2，所述探针CA10P2的两端分别结合有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
在一个实施方式中，所述探针EV71P1的序列为SEQ ID No.5所示的序列。
在一个实施方式中，所述探针CA10P2的序列为SEQ ID No.6所示的序列。
在一个实施方式中，所述第一荧光报告基团和所述第二荧光报告基团均选自FAM荧光基团、ROX荧光基团、VIC荧光基团、JOE荧光基团、TET荧光基团、CY3荧光基团、CY5荧光基团、Texas Red荧光基团和LC RED640荧光基团中的一种；所述第一荧光淬灭基团和所述第二荧光淬灭基团均选自BHQ1淬灭基团、BHQ2淬灭基团、BHQ3淬灭基团、Dabcy1淬灭基团和Tamra淬灭基团中的一种。
在一个实施方式中，所述探针EV71P1的5’端结合有第一荧光报告基团，所述探针EV71P1的3’端结合有第一荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团为FAM荧光基团，所述第一荧光淬灭基团为BHQ1淬灭基团。
在一个实施方式中，所述探针CA10P2的5’端结合有第二荧光报告基团，所述探针CA10P2的3’端结合有第二荧光淬灭基团，所述第二荧光报告基团为VIC荧光基团，所述第二荧光淬灭基团为BHQ1淬灭基团。
在一个实施方式中，所述上游引物EV71F1、所述下游引物EV71R1、所述探针EV71P1的摩尔比为1:1:1，所述上游引物CA10F2、所述下游引物CA10R2、所述探针CA10P2的摩尔比为1:1:1，所述探针EV71P1与所述探针CA10P2的摩尔比为1:1。
一种同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的试剂盒，包括上述的检测试剂。
在一个实施方式中，还包括PCR反应液、酶混合液、阳性对照品以及阴性对照品。
在一个实施方式中，所述PCR反应液包括终浓度为20mmol/L～30mmol/L的MgCl2和终浓度为5mmol/L～15mmol/L的dNTPs；所述酶混合液包括热启动Taq酶和MMLV逆转录酶；所述阳性对照品为灭活的EV71型肠道病毒及A10型柯萨奇病毒的病毒培养液；所述阴性对照品为去RNA酶的无菌水。
用上述检测试剂对样本进行处理后，上游引物EV71F1、下游引物EV71R1、探针EV71P1、上游引物CA10F2、下游引物CA10R2以及探针CA10P2相互配合，能够实现同时对样本中EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒扩增。然后通过荧光PCR分别检测第一荧光报告基团的信号以及第二荧光报告基团的信号的强度，判定样本中是否含有EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒，实现同一个样本同时检测是否感染EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒。该检测试剂能够对一管标本同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒两个项目，节省一半的时间，而且只需操作一次，减少了污染产生的机会。用上述检测试剂检测的灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观，在临床诊断、疾病预防检测领域具有极大的应用前景。
附图说明
图1为实施例2中双重荧光定量PCR反应的原理图；
图2为实施例2中样本1的PCR扩增曲线图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对本发明做进一步的解释说明。
一实施方式的同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂，包括用于扩增EV71型肠道病毒的上游引物EV71F1、用于扩增EV71型肠道病毒的下游引物EV71R1、用于检测EV71型肠道病毒的探针EV71P1、用于扩增A10型柯萨奇病毒的上游引物CA10F2、用于扩增A10型柯萨奇病毒的下游引物CA10R2以及用于检测A10型柯萨奇病毒的探针CA10P2。
其中，用于扩增EV71型肠道病毒的上游引物EV71F1的序列为SEQ ID No.1所示的序列，下游引物EV71R1的序列为SEQ ID No.2所示的序列。检测EV71型肠道病毒的探针EV71P1的两端分别结合有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团。
用于扩增A10型柯萨奇病毒的上游引物CA10F2的序列为SEQ ID No.3所示的序列，下游引物CA10R2的序列为SEQ ID No.4所示的序列。检测A10型柯萨奇病毒的探针CA10P2的两端分别结合有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
在其中一个实施例中，探针EV71P1的序列为SEQ ID No.5所示的序列。可以理解，在其他实施例中，探针EV71P1的序列不仅限于SEQ ID No.5所示的序列，只要能够检测EV71型肠道病毒即可。
在其中一个实施例中，探针CA10P2的序列为SEQ ID No.6所示的序列。可以理解，在其他实施例中，探针CA10P2的序列不仅限于SEQ ID No.6所示的序列，只要能够检测A10型柯萨奇病毒即可。
具体地，上游引物EV71F1、下游引物EV71R1、探针EV71P1、上游引物CA10F2、下游引物CA10R2以及探针CA10P2可以采用primer 5.0专用软件设计，将设计的引物和探针预先在NCBI的GeneBank进行比对，检测引物和探针的特异性。引物和探针在专业合成公司合成，采用紫外分光光度计测定光密度值(A260nm/A280nm在1.8～2.0之间为合格)。用检测试剂对样本进行处理后，可通过双重荧光定量PCR技术，由于检测试剂中含有针对EV71病毒和柯萨奇A10型病毒的特异性引物和探针，因此能够实现了在同一反应体系中同时检测EV71病毒和柯萨奇A10型病毒的目的。
其中，第一荧光报告基团和第二荧光报告基团均可选自FAM荧光基团、ROX荧光基团、VIC荧光基团、JOE荧光基团、TET荧光基团、CY3荧光基团、CY5荧光基团、Texas Red荧光基团和LC RED640荧光基团中的任意一种。第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团均可选自BHQ1淬灭基团、BHQ2淬灭基团、BHQ3淬灭基团、Dabcy1淬灭基团和Tamra淬灭基团中的任意一种。
第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同，便于在荧光PCR中通过不同的荧光信号通道分别检测判定样本中是否含有EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒。如果能够检测到第一荧光报告基团的信号，而没有第二荧光报告基团的信号，则说明样本中含有EV71型肠道病毒并且不含有A10型柯萨奇病毒。如果能够检测到第二荧光报告基团的信号，而没有第一荧光报告基团的信号，则说明样本中含有A10型柯萨奇病毒并且不含有EV71型肠道病毒。如果能够检测到第一荧光报告基团和第二荧光报告基团的信号，则说明样本中同时含有有EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒；如果能够同时没有检测到第一荧光报告基团和第二荧光报告基团的信号，则说明样本中不含有EV71型肠道病毒并且不含有A10型柯萨奇病毒。第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团可以相同，也可以不同，本实施例中，二者相同。
本实施例中，探针EV71P1的5’端结合有第一荧光报告基团，探针EV71P1的3’端结合有第一荧光淬灭基团，第一荧光报告基团为FAM荧光基团，第一荧光淬灭基团为BHQ1淬灭基团。探针CA10P2的5’端结合有第二荧光报告基团，探针CA10P2的3’端结合有第二荧光淬灭基团，第二荧光报告基团为VIC荧光基团，第二荧光淬灭基团为BHQ1淬灭基团。
在其中一个实施例中，检测试剂为混合均匀的混合物，上游引物EV71F1、下游引物EV71R1、探针EV71P1的摩尔比为1:1:1。上游引物CA10F2、下游引物CA10R2、探针CA10P2的摩尔比为1:1:1，探针EV71P1与探针CA10P2的摩尔比为1:1。该混合配比的检测试剂灵敏度高，特异性好。采用检测试剂对样本进行处理后，若检测样本中含有EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒，能够实现对EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒迅速扩增，实现在同一个样本同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒。
上述检测试剂，上游引物EV71F1、下游引物EV71R1、探针EV71P1、上游引物CA10F2、下游引物CA10R2以及探针CA10P2相互配合，能够实现同时对样本中EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒扩增。然后通过荧光PCR分别检测第一荧光报告基团的信号以及第二荧光报告基团的信号的强度，判定样本中是否含有EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒，实现同一个样本同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒。灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观。
此外，本发明还提供一实施方式的同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的试剂盒，该试剂盒中含有上述的检测试剂。
在其中一个实施例中，试剂盒中还包括PCR反应液、酶混合液、阳性对照品以及阴性对照品。
在其中一个实施例中，PCR反应液为RT-PCR反应液，PCR反应液中包括终浓度为20mmol/L～30mmol/L的MgCl2和终浓度为5mmol/L～15mmol/L的dNTPs。当然，PCR反应液还可以含有反应缓冲液，例如为Tris-HCl缓冲液等。PCR反应液为样本的扩增提供需要的原料以及扩增条件。酶混合液可以包括热启动Taq酶和MMLV逆转录酶，提高扩增的效率。阳性对照品为灭活的EV71型肠道病毒及A10型柯萨奇病毒的病毒培养液，阴性对照品为去RNA酶的无菌水。
使用时，提取样本中的RNA，将PCR反应液、酶混合液、检测试剂以及按一定比例与提取的RNA混合，通过实时荧光定量PCR扩增，根据荧光曲线判断是否感染EV71型肠道病毒或者A10型柯萨奇病毒。实现同一个样本同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒。一管标本同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒两个项目，节省一半的时间，而且只需操作一次，减少了污染产生的机会。
上述试剂盒检测的灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观，在临床诊断、疾病预防检测领域具有极大的应用前景。
下面为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
提供一种同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的试剂盒，
所述试剂盒包括RT-PCR反应液、检测试剂、酶混合液、阳性对照和阴性对照。
其中，RT-PCR反应液包括10×缓冲液、终浓度为25mmol/L的MgCl2和终浓度为10mmol/L的dNTPs。
检测试剂包括用于扩增EV71型肠道病毒的上游引物EV71F1、用于扩增EV71型肠道病毒的下游引物EV71R1、用于检测EV71型肠道病毒的探针EV71P1、用于扩增A10型柯萨奇病毒的上游引物CA10F2、用于扩增A10型柯萨奇病毒的下游引物CA10R2以及用于检测A10型柯萨奇病毒的探针CA10P2。上游引物EV71F1的序列为SEQ ID No.1所示的序列，下游引物EV71R1的序列为SEQ ID No.2所示的序列。上游引物CA10F2的序列为SEQ ID No.3所示的序列，下游引物CA10R2的序列为SEQ ID No.4所示的序列。探针EV71P1的5’端结合有第一荧光报告基团，探针EV71P1的3’端结合有第一荧光淬灭基团，第一荧光报告基团为FAM荧光基团，第一荧光淬灭基团为BHQ1淬灭基团。探针CA10P2的5’端结合有第二荧光报告基团，探针CA10P2的3’端结合有第二荧光淬灭基团，第二荧光报告基团为VIC荧光基团，第二荧光淬灭基团为BHQ1淬灭基团。上游引物EV71F1的浓度为为400nmol/L，下游引物EV71R1的浓度为400nmol/L，探针EV71P1的浓度为为400nmol/L。上游引物CA10F2的浓度为400nmol/L，下游引物CA10R2的浓度为400nmol/L，探针CA10P2的浓度为400nmol/L。
酶混合液包括Taq酶和逆转入酶，其中，Taq酶为热启动Taq酶，逆转入酶为MMLV逆转入酶。
阳性对照品为灭活的EV71型肠道病毒及A10型柯萨奇病毒的病毒培养液，阴性对照品为去RNA酶的无菌水。
实施例2
采用实施例1的试剂盒检测样本中的EV71型肠道病毒及A10型柯萨奇病毒
1、提取样本RNA，例如可采用商品化核酸RNA提取试剂盒OMEGA E.Z.N.A.TotalRNA Kit I(OMEGA，R6834-01)从病毒分离培养物中提取病毒RNA。具体步骤如下：
1.1取200ul临床样品，加入400ul Binding buffer supplemented with poly(A)，充分混匀后转入高纯化过滤管，8000rmp离心15s，弃去过滤管中的废液。
1.2加入500ul Inhibitor Removal Buffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去过滤管中的废液。
1.3加入450ul Washing buffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去过滤管中的废液；
1.4重复步骤1.3，然后高速离心10s，此步骤务必将废液去除干净；
1.5加入50ul Elution buffer至过滤管中，室温静置2min，8000rmp离心1min，离心所得溶液即为纯化的RNA。
2、在每个PCR反应管放入组分如表1中所示的EV71/A10型柯萨奇病毒检测试剂(实施例1制备)和RNA样本。
表1：反应液组分
反应液组分 加样(ul)/人份
RT-PCR反应液 7
酶混合液 4.5
检测试剂 5
去RNA酶的无菌水(阴性参考品) 3.5
RNA样本 5
总体积 25
3、在荧光定量PCR扩增仪中扩增，按照下列程序进行PCR扩增:
4、扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染EV71型肠道病毒及A10型柯萨奇病毒
如图1所示，由于针对EV71型肠道病毒的探针EV71P1上标记FAM，针对A10型柯萨奇病毒的探针CA10P2上标记VIC。PCR反应过程中，若待检样本包含EV71型肠道病毒，则标记FAM的探针产生荧光信号。若待检样本包含A10型柯萨奇病毒，则标记VIC的探针产生荧光信号。这样，同一管反应则可确定两个靶基因。
结果判定：在FAM通道内荧光曲线呈“S”型且CT≤35.0，判断为EV71型肠道病毒阳性；无典型“S”型扩增或CT＞35.0，判断为EV71型肠道病毒阴性；在VIC通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为A10型柯萨奇病毒阳性，无典型“S”型扩增或CT＞35.0，判断为A10型柯萨奇病毒阴性。
5个临床样本具体检测结果见表2。其中样本1的扩增曲线如图2所示。
表2：检测结果
从表2中的结果表明，样本1感染EV71型肠道病毒，但未感染A10型柯萨奇病毒。样本2感染EV71型肠道病毒，但未感染A10型柯萨奇病毒。样本3同时感染了EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒。样本4未感染EV71型肠道病毒，但感染A10型柯萨奇病毒。样本5未感染EV71型肠道病毒，也未感染A10型柯萨奇病毒。以上结果表明实施例1提供的该试剂盒能够在一管标本同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒两个项目，节省一半的时间，而且只需操作一次，减少了污染产生的机会。检测的灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观，在临床诊断、疾病预防检测领域具有极大的应用前景。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市艾伟迪生物科技有限公司
<120> 同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂及试剂盒
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 上游引物EV71F1
<400> 1
gcgggattag ttggagagat a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 下游引物EV71R1
<400> 2
ttgcgcgtaa cctgttatat c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 上游引物CA10F2
<400> 3
tcaatctttg ttaaactcac 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 下游引物CA10R2
<400> 4
ttagggcata atccgtatgc t 21
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 探针EV71P1
<400> 5
accatttggg ttagttgtgc cttca 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 探针CA10P2
<400> 6
agtccctttc atgtccccgg ccagt 25

Claims (10)

1.一种同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂，其特征在于，包括：
用于扩增EV71型肠道病毒的上游引物EV71F1，所述上游引物EV71F1的序列为SEQ IDNo.1所示的序列；
用于扩增EV71型肠道病毒的下游引物EV71R1，所述下游引物EV71R1的序列为SEQ IDNo.2所示的序列；
用于检测EV71型肠道病毒的探针EV71P1，所述探针EV71P1的两端分别结合有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团；
用于扩增A10型柯萨奇病毒的上游引物CA10F2，所述上游引物CA10F2的序列为SEQ IDNo.3所示的序列；
用于扩增A10型柯萨奇病毒的下游引物CA10R2，所述下游引物CA10R2的序列为SEQ IDNo.4所示的序列；以及
用于检测A10型柯萨奇病毒的探针CA10P2，所述探针CA10P2的两端分别结合有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
2.根据权利要求1所述的同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂，其特征在于，所述探针EV71P1的序列为SEQ ID No.5所示的序列。
3.根据权利要求1所述的同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂，其特征在于，所述探针CA10P2的序列为SEQ ID No.6所示的序列。
4.根据权利要求1所述的同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂，其特征在于，所述第一荧光报告基团和所述第二荧光报告基团均选自FAM荧光基团、ROX荧光基团、VIC荧光基团、JOE荧光基团、TET荧光基团、CY3荧光基团、CY5荧光基团、Texas Red荧光基团和LC RED640荧光基团中的一种；所述第一荧光淬灭基团和所述第二荧光淬灭基团均选自BHQ1淬灭基团、BHQ2淬灭基团、BHQ3淬灭基团、Dabcy1淬灭基团和Tamra淬灭基团中的一种。
5.根据权利要求1所述的同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂，其特征在于，所述探针EV71P1的5’端结合有第一荧光报告基团，所述探针EV71P1的3’端结合有第一荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团为FAM荧光基团，所述第一荧光淬灭基团为BHQ1淬灭基团。
6.根据权利要求1所述的同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂，其特征在于，所述探针CA10P2的5’端结合有第二荧光报告基团，所述探针CA10P2的3’端结合有第二荧光淬灭基团，所述第二荧光报告基团为VIC荧光基团，所述第二荧光淬灭基团为BHQ1淬灭基团。
7.根据权利要求1所述的同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的检测试剂，其特征在于，所述上游引物EV71F1、所述下游引物EV71R1、所述探针EV71P1的摩尔比为1:1:1，所述上游引物CA10F2、所述下游引物CA10R2、所述探针CA10P2的摩尔比为1:1:1，所述探针EV71P1与所述探针CA10P2的摩尔比为1:1。
8.一种同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～7任一项所述的检测试剂。
9.根据权利要求8所述的同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液、酶混合液、阳性对照品以及阴性对照品。
10.根据权利要求9所述的同时检测EV71型肠道病毒和A10型柯萨奇病毒的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括终浓度为20mmol/L～30mmol/L的MgCl2和终浓度为5mmol/L～15mmol/L的dNTPs；所述酶混合液包括热启动Taq酶和MMLV逆转录酶；所述阳性对照品为灭活的EV71型肠道病毒及A10型柯萨奇病毒的病毒培养液；所述阴性对照品为去RNA酶的无菌水。
CN201710079233.9A 2017-02-14 2017-02-14 同时检测ev71型肠道病毒和a10型柯萨奇病毒的检测试剂及试剂盒 Pending CN106868205A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710079233.9A CN106868205A (zh) 2017-02-14 2017-02-14 同时检测ev71型肠道病毒和a10型柯萨奇病毒的检测试剂及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710079233.9A CN106868205A (zh) 2017-02-14 2017-02-14 同时检测ev71型肠道病毒和a10型柯萨奇病毒的检测试剂及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106868205A true CN106868205A (zh) 2017-06-20

Family

ID=59165968

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710079233.9A Pending CN106868205A (zh) 2017-02-14 2017-02-14 同时检测ev71型肠道病毒和a10型柯萨奇病毒的检测试剂及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106868205A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676700A (zh) * 2012-05-21 2012-09-19 西安建筑科技大学 同时检测水环境中三种主要手足口病病毒的定性检测方法
CN104195264A (zh) * 2014-08-13 2014-12-10 江苏硕世生物科技有限公司 一种快速检测柯萨奇病毒a6型/a10型的核酸检测试剂盒及其应用
CN105238880A (zh) * 2015-10-28 2016-01-13 菲鹏生物股份有限公司 肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676700A (zh) * 2012-05-21 2012-09-19 西安建筑科技大学 同时检测水环境中三种主要手足口病病毒的定性检测方法
CN104195264A (zh) * 2014-08-13 2014-12-10 江苏硕世生物科技有限公司 一种快速检测柯萨奇病毒a6型/a10型的核酸检测试剂盒及其应用
CN105238880A (zh) * 2015-10-28 2016-01-13 菲鹏生物股份有限公司 肠道病毒实时荧光定量检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
肖性龙等: "内标多重荧光RT-PCR同时检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型", 《微生物学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105506188B (zh) 用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光rt-pcr引物和荧光探针、试剂盒及检测方法
CN107513584B (zh) 一种检测肠道病毒的五重荧光定量试剂盒
CN102605055B (zh) 副溶血性弧菌多重定量pcr检测试剂盒及检测方法
CN100378230C (zh) H5、h7、h9亚型禽流感病毒的实时荧光定量pcr检测方法
CN104846125B (zh) 一种用于检测mers的荧光rt‑pcr引物、探针和试剂盒及检测方法
CN111518960A (zh) 一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法
CN103468811B (zh) 小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重pcr检测引物组和试剂盒
CN107557496A (zh) 一种用于检测MERS‑CoV病毒的荧光RT‑RAA引物、探针及检测方法
CN103131798A (zh) 一种诺如病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒及其应用
CN111270014A (zh) 一种封闭式SARS-CoV-2等温扩增核酸检测试剂盒
CN113930547B (zh) 猪流行性腹泻病毒n基因的rt-raa荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法
WO2021190633A1 (zh) 用于检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的引物及其试剂盒、检测方法和应用
CN111270021A (zh) 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、组合物、试剂盒及应用
CN102534050B (zh) 用于诊断草鱼呼肠孤病毒的三重pcr检测引物组、试剂盒及方法
CN103045754B (zh) 一步法检测z/s亚型埃博拉病毒的实时荧光定量rt‑pcr方法及其试剂盒
CN109609693A (zh) 一种同时检测多种肠道病毒的方法
CN104711373A (zh) 耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法
CN108531627A (zh) 一种用于检测b族链球菌的rpa荧光定量引物对、探针、试剂盒及检测方法
CN101724714B (zh) 一种检测乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒
CN109207640B (zh) 一种检测多种呼吸道病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用
CN101812538B (zh) 一种检测肠道病毒71型的荧光定量rt-pcr试剂盒
CN102816870B (zh) 柯萨奇病毒a6型rt-lamp核酸检测引物及试剂盒
CN112725543A (zh) 人源诺如病毒gii.4型的特征性核酸鉴别引物组、试剂盒和检测方法
CN114075611A (zh) 一种双靶标SARS-CoV-2病毒核酸检测引物组、应用及荧光试剂盒
CN116024386B (zh) 用于检测新型冠状病毒及区分Omicron不同突变株的引物探针组合和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170620