CN102676700A - 同时检测水环境中三种主要手足口病病毒的定性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水环境中手足口病三种主要病毒（EV71、CVA10、CVA16）同时定性检测方法，该方法根据手足口病三种主要病毒（EV71、CVA10、CVA16）RNA在5’非编码区到病毒蛋白衣壳编码区VP2这一段核酸的保守性，设计手足口病三种主要病毒的半巢式PCR引物。建立了运用该半巢式PCR引物的进行水环境中手足口病病毒的定性PCR检测方法。该方法特异性好、灵敏度高，且可为后续基因分型奠定良好基础。

Description

同时检测水环境中三种主要手足口病病毒的定性检测方法

技术领域

本发明涉及一种同时检测水环境中三种主要手足口病病毒的定性检测方法，该方法根据手足口病病毒RNA的保守序列设计通用引物，利用巢式PCR检测手足口病病毒，适用于水环境中的手足口病病毒的快速检测。

背景技术

逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术是以RNA为模板进行逆转录，得到互补DNA（cDNA）的第一条链，再以该cDNA链为模板进行PCR扩增反应，由此可将极微量的RNA在数小时内以几何倍数进行特异性扩增。半巢式PCR（semi-nested PCR）技术是一种变异的PCR技术，其通过使用一对半PCR引物完成核酸片段的扩增。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为半巢式引物（因其一条引物与第一对PCR引物中的一条完全相同，但另外一条引物在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。半巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低；且通过两次PCR扩增后，其检测灵敏度大大提高。因此，半巢式PCR的扩增非常特异，且灵敏度很好。现有的关于水环境中进行手足口病病毒PCR检测的方法很少，大多是基于肠道病毒通用引物定性或定量RT-PCR检测技术，但由于肠道病毒属的病毒血清型繁多，致病类型各异，存在无法快速准确确定致病病原体、灵敏度不够高、受杂质干扰影响较大的缺点。虽然巢式PCR技术已应用于医学等领域的微生物检测，但并不能满足水环境监测的需要，因此目前还没有一套适用于水环境中手足口病病毒同时快速检测的有效方法。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种水环境中手足口病主要致病病毒--肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A10型（CVA10）、柯萨奇病毒A16型（CVA16）的定性检测方法，以解决水环境中手足口病病毒的同时定性检测的问题，并提高检测的灵敏度和特异性。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种同时检测水环境中手足口病三种主要病毒的定性检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

步骤一，手足口病三种主要病毒（EV71、CVA10、CVA16）半巢式PCR引物设计：

根据手足口病三种主要病毒（EV71、CVA10、CVA16）RNA在5’非编码区到病毒蛋白衣壳编码区VP2这一段核酸的保守性，设计手足口病三种主要病毒的半巢式PCR引物，同时由于该引物可扩增完整的病毒蛋白衣壳编码区VP4，也可为后续进一步基因分型奠定基础；所述的手足口病三种主要病原体（EV71、CVA10、CVA16）半巢式PCR引物包括第一轮PCR上游引物546F、第二轮PCR上游引物592F和下游引物1090R，其中，第一轮PCR上游引物546F的核苷酸序列为：5′-CGGAACCGACTACTTTGG-3′；第二轮PCR上游引物592F的核苷酸序列为：5′-TGGCTGCTTATGGTGACA-3′；下游引物1090R的核苷酸序列为：5′-GCARTASKMRGGCCAYTC-3′（R=A/G；S=G/C；K=G/T；M=A/C；Y=C/T）。

步骤二，对设计引物的特异性进行检测：

用EV71、CVA10、CVA16三种目标病毒及柯萨奇病毒B4型（CVB4）、脊髓灰质炎病毒1型（PV1）两种非目标病毒进行引物特异性检测；

1）RNA提取：利用RNA提取试剂盒提取病毒RNA；

2）去除基因组DNA：将5μL的RNA和2μL的5×g DNA Eraser Buffer混匀，加入1μL的g DNA Eraser，并用无核酸酶超纯水补足至10μL，42℃水浴2min，以去除体系内DNA对RNA的干扰；

3）逆转录：向上述反应液加入4μL 5×PrimeScript buffer，1μLPrimeScpript RT Enzyme Mix I，1μL RT Primer Mix，用无核酸酶超纯水补足至20μL，37℃水浴15min获得逆转录产物，85℃5s灭活反转录酶，用此反应液作为PCR模板；

4）半巢式PCR扩增：

第一轮PCR：取2.5μL的10×Ex Taq Buffer，2μL的dNTP Mixture，10μmol/L的上游引物546F和10μmol/L的下游引物1090R各1μL，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

第二轮PCR：取2.5μL的10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP Mixture，10μmol/L上游引物592F和10μmol/L下游引物1090R各1μL，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀释的第一轮PCR产物2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

两轮PCR扩增反应条件为：

①95℃预变性5min；

②扩增循环35次：95℃，30s；56℃，30s；72℃，60s；

③72℃延伸5min，4℃冷却；

5）琼脂糖凝胶电泳检测：配置1.5%的琼脂糖凝胶，100V电泳30min，在凝胶成像仪下进行成像检测。

步骤三，对设计引物的灵敏度进行检测：

用EV71、CVA10、CVA16三种目标病毒进行引物灵敏度检测；

1）RNA提取：利用RNA提取试剂盒提取病毒RNA；

2）去除基因组DNA：将5μL RNA和2μL 5×g DNA Eraser Buffer混匀，加入1μL g DNA Eraser，并用无核酸酶超纯水补足至10μL，42℃水浴2min，以去除体系内DNA对RNA的干扰；

3）逆转录：向上述反应液加入4μL 5×PrimeScript buffer，1μLPrimeScpript RT Enzyme Mix I，1μL RT Primer Mix，用无核酸酶超纯水补足至20μL，37℃水浴15min获得逆转录产物，85℃，5s灭活反转录酶，用此反应液作为PCR模板；

4）将所得cDNA定量后进行十倍梯度稀释，稀释范围10⁰至10⁵拷贝，作为模板备用；

5）PCR扩增：取2.5μL的10×Ex Taq Buffer，2μL的dNTP Mixture，10μmol/L的上游引物546F和10μmol/L的下游引物1090R各1μL，Ex Taq酶2U，向每个PCR管中分别加入各稀释梯度的模板cDNA2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

两轮PCR扩增反应条件为：

①95℃预变性5min；

②扩增循环35次：95℃，30s；56℃，30s；72℃，60s；

③72℃延伸5min，4℃冷却；

6）琼脂糖凝胶电泳检测：配置1.5%的琼脂糖凝胶，100V电泳30min，在凝胶成像仪下进行成像检测。

步骤四，水环境样品的定性检测：

1）样品采集：在水面下0.3m处取水样，水样采集后放入4℃冰箱内保存；

2）病毒浓缩：将含有肠道病毒的水样加入聚乙二醇（PEG）6000及NaCl至浓度分别为8%（vol/vol）与2.3%（wt/vol），于4℃，80rpm过夜搅拌混匀，约12h后，于9,000×g，4℃离心30min，收集沉淀，将沉淀用1mL超纯水吹打混匀；

3）RNA提取：利用RNA提取试剂盒提取病毒RNA；

4）去除基因组DNA：将5μL RNA和2μL 5×g DNA Eraser Buffer混匀，加入1μL g DNA Eraser，并用无核酸酶超纯水补足至10μL，42℃水浴2min，以去除体系内DNA对RNA的干扰；

5）逆转录：向上述反应液加入4μL 5×PrimeScript buffer，1μLPrimeScpript RT Enzyme Mix I，1μL RT Primer Mix，用无核酸酶超纯水补足至20μL，37℃水浴15min获得逆转录产物，85℃，5s灭活反转录酶，用此反应液作为PCR模板；

6）半巢式PCR扩增：

第一轮PCR：取2.5μL 10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP Mixture，10μmol/L上游引物546F和10μmol/L下游引物1090R各1μL，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

第二轮PCR：取2.5μL 10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP Mixture，10μmol/L上游引物592F和10μmol/L下游引物1090R各1μL，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀释的第一轮PCR产物2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

两轮PCR扩增反应条件为：

①95℃预变性5min；

②扩增循环35次：95℃，30s；56℃，30s；72℃，60s；

③72℃延伸5min，4℃冷却；

7）琼脂糖凝胶电泳检测：配置1.5%的琼脂糖凝胶，100V电泳30min，在凝胶成像仪下进行成像检测。

本发明的检测方法由于采用了半巢式PCR，大幅度提高了水环境中手足口病病毒RT-PCR检测技术的灵敏度，具有良好的特异性，同时对三种主要手足口病病毒进行特异性检测，也缩短了排查筛选手足口病病原体时间，与环境中常见的其他病原微生物没有交叉反应。与现有的水环境中手足口病病毒定性RT-PCR检测技术相比较，具有以下显著的优点：

（1）良好的特异性：

所设计的手足口病三种主要病毒同时检测的半巢式PCR引物经特异性实验证实具有较好的特异性，与环境中常见的其他病原微生物没有交叉反应。

（2）灵敏度大幅度提高

现有的环境水体中病毒定性RT-PCR一般采用普通PCR，或者定量PCR反应，但是经过连续两次成几何倍数的半巢式PCR扩增，灵敏度大幅提高。

（3）耗时短

以往的水环境中病毒检测多见于肠道病毒通用引物的检测，若需进行血清型区分，则需进行较为复杂的分析；本发明所采用的方法可直接进行水样中手足口病三种主要病毒的检测，缩短了肠道病毒血清型的排查时间。且若通过后续克隆连接转化，可通过扩增的蛋白质衣壳编码区VP4直接进行型别分析鉴定。

附图说明

图1是设计引物特异性及灵敏性的琼脂糖凝胶电泳检测图，其中：

（A）特异性检测（10⁵拷贝/PCR反应）M：marker；1：CVA10；2：CVA16；3：EV71；4：CVB4；5：PV1；N：阴性对照。

（B），（C）和（D）分别是针对CVA10，CVA16与EV71的cDNA进行灵敏度检测M：marker；1~6：10倍梯度稀释病毒cDNA（10⁵至10⁰拷贝/PCR反应）；N：阴性对照。

图2是该方法应用于某污水厂进水及二级处理水（未消毒）的半巢式PCR检测结果。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

按照本发明的技术方案，首先根据手足口病三种主要病毒（EV71、CVA10、CVA16）RNA在5’非编码区到病毒蛋白衣壳编码区VP2这一区域核酸的保守性，设计手足口病三种主要病毒的半巢式PCR引物。所述的手足口病三种主要病原体（EV71、CVA10、CVA16）半巢式PCR引物包括第一轮PCR上游引物546F、第二轮PCR上游引物592F和下游引物1090R，其中，第一轮PCR上游引物546F的核苷酸序列为：5′-CGGAACCGACTACTTTGG-3′；第二轮PCR上游引物592F的核苷酸序列为：5′-TGGCTGCTTATGGTGACA-3′；下游引物1090R的序列为：5′-GCARTASKMRGGCCAYTC-3′（R=A/G；S=G/C；K=G/T；M=A/C；Y=C/T）。经过在GenBank数据库上比对分析，与该手足口病三种主要病毒通用引物具有高度相似性的序列都来源于肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A10型（CVA10）、柯萨奇病毒A16型（CVA16），未发现相似性较高的其他微生物序列。

以下是发明人给出的具体实施例。

1、设备和试剂

（1）高速冷冻离心机；

（2）离心管；

（3）4℃冰箱；

（4）磁力搅拌器；

（4）金属浴；

（5）定性PCR仪；

（6）紫外凝胶成像仪；

（7）聚乙二醇（PEG），分子量6000；

（8）NaCl；

（9）病毒RNA提取试剂盒；

（10）去除基因组DNA试剂盒；

（11）逆转录试剂盒；

（12）定性PCR试剂盒；

（12）手足口病三种主要病原体（EV71、CVA10、CVA16）半巢式PCR引物，包括第一轮PCR上游引物546F、第二轮PCR上游引物592F和下游引物1090R，其中，第一轮PCR上游引物546F的核苷酸序列为：5′-CGGAACCGACTACTTTGG-3′；第二轮PCR上游引物592F的核苷酸序列为：5′-TGGCTGCTTATGGTGACA-3′；下游引物1090R的序列为：5′-GCARTASKMRGGCCAYTC-3′。第一轮PCR扩增片段约为545bp，第二轮PCR扩增片段约为500bp，引物均由专业生物工程公司合成。

2、测定程序

（1）样品采集：在水面下0.3m处取水样250mL，水样采集后立即放入4℃冰盒内保存，6h内进行检测。

（2）病毒的浓缩：将含有肠道病毒的水样加入聚乙二醇（PEG）6000及NaCl至浓度分别为8%（vol/vol）与2.3%（wt/vol），于4℃，80rpm过夜搅拌混匀，约12~14h后，于9,000×g，4℃离心30min，收集沉淀，将沉淀用1mL超纯水吹打混匀；3）RNA提取：利用RNA提取试剂盒提取病毒RNA；

（3）去除基因组DNA：将5μL RNA和2μL 5×g DNA Eraser Buffer混匀，加入1μL g DNA Eraser，并用无核酸酶超纯水补足至10μL，42℃水浴2min，去除体系内DNA对RNA的干扰，得到反应液；

（4）逆转录：向反应液中加入4μL 5×PrimeScript buffer，1μLPrimeScpript RT Enzyme Mix I，1μL RT Primer Mix，用无核酸酶超纯水补足至20μL，37℃水浴15min获得逆转录产物，85℃，5s灭活反转录酶，用此反应液作为PCR模板；

（5）半巢式PCR扩增：

第一轮PCR：取2.5μL 10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP Mixture，10μmol/L上游引物546F和10μmol/L下游引物1090R各1μL，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

第二轮PCR：取2.5μL 10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP Mixture，10μmol/L上游引物592F和10μmol/L下游引物1090R各1μL，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀释的第一轮PCR产物2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

两轮PCR扩增反应条件为：

①95℃预变性5min；

②扩增循环35次：95℃，30s；56℃，30s；72℃，60s；

③72℃延伸5min，4℃冷却；

（6）琼脂糖凝胶电泳检测：配置1.5%的琼脂糖凝胶，100V电泳30min，在凝胶成像仪下进行成像检测。

通过引物特异性和灵敏度检测，如图1所示，证明所设计引物特异性良好，灵敏度较高；将该方法应用于某污水厂进水及二级处理水（未消毒）的手足口病三种主要病毒的定性检测，如图2所示，三种手足口病病毒的检出呈现一定的季节变化规律，且经基因序列分析表明，阳性样品均为所检测目标病毒。

Claims (1)

1.一种同时检测水环境中手足口病三种主要病毒的定性检测方法，其特征在于，按下列步骤进行：

步骤一，手足口病三种主要病毒（EV71、CVA10、CVA16）半巢式PCR引物设计：

根据手足口病三种主要病毒（EV71、CVA10、CVA16）RNA在5’非编码区到病毒蛋白衣壳编码区VP2这一段核酸的保守性，设计手足口病三种主要病毒的半巢式PCR引物，同时由于该引物可扩增完整的病毒蛋白衣壳编码区VP4，也可为后续进一步基因分型奠定基础；

所述的手足口病三种主要病原体（EV71、CVA10、CVA16）半巢式PCR引物包括第一轮PCR上游引物546F、第二轮PCR上游引物592F和下游引物1090R，其中：

第一轮PCR上游引物546F  的核苷酸序列为：5′-CGGAACCGACTACTTTGG-3′；

第二轮PCR上游引物592F  的核苷酸序列为：5′-TGGCTGCTTATGGTGACA-3′；

下游引物1090R的序列为：5′-GCARTASKMRGGCCAYTC-3′（R=A/G；S=G/C；K=G/T；M=A/C；Y=C/T）。

步骤二，水环境样品的定性检测：

1）样品采集：在水面下0.3m处取水样，水样采集后放入4℃冰箱内保存；

2）病毒浓缩：将含有肠道病毒的水样加入聚乙二醇（PEG）6000及NaCl至浓度分别为8%（vol/vol）与2.3%（wt/vol），于4℃，80rpm过夜搅拌混匀，约12h后，于9,000×g，4℃离心30min，收集沉淀，将沉淀用1mL超纯水吹打混匀；

3）RNA提取：利用RNA提取试剂盒提取病毒RNA；

4）去除基因组DNA：将5μL RNA和2μL 5×g DNA Eraser Buffer混匀，加入1μL g DNA Eraser，并用无核酸酶超纯水补足至10μL，42℃水浴2min，去除体系内DNA对RNA的干扰，得到反应液；

5）逆转录：向反应液中加入4μL 5×PrimeScript buffer，1μLPrimeScpript RT Enzyme Mix I，1μL RT Primer Mix，用无核酸酶超纯水补足至20μL，37℃水浴15min获得逆转录产物，85℃，5s灭活反转录酶，用此反应液作为PCR模板；

6）半巢式PCR扩增：

第一轮PCR：取2.5μL 10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP Mixture，10μmol/L上游引物546F和10μmol/L下游引物1090R各1μL，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

第二轮PCR：取2.5μL 10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP Mixture，10μmol/L上游引物592F和10μmol/L下游引物1090R各1μL，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀释的第一轮PCR产物2μL，用无菌超纯水补足至25μL，以无菌超纯水作模板为阴性对照，在定性PCR仪上进行扩增；

两轮PCR扩增反应条件为：

①95℃预变性5min；

②扩增循环35次：95℃，30s；56℃，30s；72℃，60s；

③72℃延伸5min，4℃冷却；

7）琼脂糖凝胶电泳检测：配置1.5%的琼脂糖凝胶，100V电泳30min，在凝胶成像仪下进行成像检测。

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