CN107177692A - 一种城市污水中隐孢子虫、贾第虫的快速检测及溯源方法 - Google Patents

一种城市污水中隐孢子虫、贾第虫的快速检测及溯源方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种城市污水中隐孢子虫、贾第虫的快速检测及溯源方法，所述方法包括以下步骤：1)采集适量城市污水，静置一定时间后，弃去上层污水，收集下层污水；2)重复步骤1)至一定水样总量；3)将收集到的水样离心，收集沉淀；4)提取所述沉淀中的DNA；5)对提取到的DNA进行PCR并测序，以检测该城市污水中的隐孢子虫和贾第虫；以及6)将步骤5)中得到的序列与GenBank中的序列进行比对，确定其虫种或基因型。本发明采用将污水离心沉淀后PCR的方法，提供了一种样本体积需求小、操作简便、结果准确、定种溯源效果理想、成本低廉的城市污水中隐孢子虫、贾第虫的快速检测及溯源方法。

Description

一种城市污水中隐孢子虫、贾第虫的快速检测及溯源方法
技术领域
本发明涉及污水检测领域，更具体地涉及一种城市污水中隐孢子虫、贾第虫的快速检测及溯源方法。
背景技术
隐孢子虫和贾第虫是常见的顶复门寄生原虫，具有很强的宿主适应性，可以感染人和多种动物，导致宿主产生腹泻，呕吐等症状。对于艾滋病人、器官移植病人等免疫缺陷人群，感染隐孢子虫甚至会危及生命。隐孢子虫和贾第虫在世界范围内有过多次爆发，最严重时造成四十多万人感染，超百人死亡，严重危害公共卫生安全。
根据我国2006年底修订完成的《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)中，隐孢子虫、贾第虫是仅有的两种被列入控制指标的原生生物。在采用雨污合流系统的城市污水处理过程中，由于泵站和污水处理厂的污水负荷有限，遇到极端天气时部分污水会直接排入城市水网，直接威胁饮用水源安全，具有非常严重的潜在风险。
目前城市污水常用的隐孢子虫与贾第虫检测方法为US EPA-1623法。该方法的主要步骤为过滤、洗脱、浓缩、分离纯化、荧光显色和镜检。该方法的主要缺点是需要的水样体积较大，比如原水需要20升，并且操作非常复杂，步骤较多，操作要求很高，镜检时误差也较大，定种溯源效果不理想。此外，如果采用此种方法，每个样品的检测成本相对较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种城市污水中隐孢子虫、贾第虫的快速检测及溯源方法，从而解决现有检测技术的样本体积大、操作复杂、要求高、误差大、定种溯源效果不理想以及成本高的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
提供一种城市污水中隐孢子虫、贾第虫的快速检测及溯源方法，所述方法包括以下步骤：1)采集适量城市污水，静置一定时间后，弃去上层污水，收集下层污水；2)重复步骤1)至一定水样总量；3)将收集到的水样离心，收集沉淀；4)提取所述沉淀中的DNA；5)对提取到的DNA进行PCR，以检测该城市污水中的隐孢子虫和贾第虫；以及6)将步骤5)中得到的序列与GenBank中的序列进行比对，确定虫种或基因型，明确宿主来源。
优选地，所述步骤5)中，以所述提取到的DNA为模板，采用巢式PCR技术分别扩增隐孢子虫18S rRNA基因和贾第虫tpi基因。
进一步优选地，扩增隐孢子虫18S rRNA基因的第一轮正向引物具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，第一轮反向引物具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，第二轮正向引物具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，第二轮反向引物具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
还优选地，扩增贾第虫tpi基因的第一轮正向引物具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，第一轮反向引物具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，第二轮正向引物具有SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列，第二轮反向引物具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
根据本发明所提供的方法，还包括通过对PCR扩增获得的DNA进行基因测序以及序列分析，分别得到隐孢子虫和贾第虫的基因型和基因亚型，进而推测污染源。
优选地，步骤1)包括：每次采集适量城市污水，静置20～30分钟，收集下层污水。
优选地，步骤2)包括：重复步骤1)至水样总量达到3～6L。
优选地，步骤3)包括：将收集到的水样分批次离心，3000转/分钟，4℃，离心13～15分钟，收集沉淀。
根据本发明，提供了一种城市污水中隐孢子虫、贾第虫的快速检测及溯源方法，该方法相对最接近现有技术US EPA-1623法的有益效果在于：
1)本发明采用了离心沉淀后PCR的方法，需要的水样体积小，每个样品仅需要大约3升水样即可，因此克服了传统技术样品需求量大，操作密集，成本高的缺点。
2)操作简便，只需直接离心后提取DNA进行PCR检测即可，无需染色镜检。
3)结果准确，通过对PCR扩增获得的DNA进行基因测序以及序列分析，可以显著提高水样中虫卵的检测水平，进行基因型层面的精确鉴定，为溯源提供坚实的证据。由于不同的基因型有不同的宿主，因此，根据鉴定所得到的基因型就可以推断出污水中的这些寄生虫来源于何种宿主，进而推断其污染源，有助于对城市污水从根源上进行防治。
4)成本低廉，以自定义操作和通用试剂盒取代了专用试剂盒，具有方便灵活，成本低廉的优点。
总之，本发明提供了一种样本体积需求小、操作简便、结果准确、定种溯源效果理想、成本低廉的城市污水中隐孢子虫、贾第虫的快速检测及溯源方法。
附图说明
图1是污水样品中隐孢子虫基于18S rRNA基因位点检测结果电泳图，其中，最左端M为DNA marker，1～28号为样本，P为阳性对照，N为阴性对照，其中，P1，P2为双阳性对照，N1为巢式PCR第一轮阳性对照，N2为巢式PCR第二轮阳性对照；
图2是污水样品中贾第虫基于tpi基因位点检测结果电泳图，其中，最左端M为DNAmarker，1～40号为样本，P为阳性对照，N1为巢式PCR第一轮阳性对照，N2为巢式PCR第二轮阳性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
主要仪器：容积至少为3升的塑料桶、采水器小型台式高速离心机(EppendorfCentifuge 5451D)；与离心机配套的500毫升离心瓶；FastPrepTM FP120(BIO 101)配套设备；紫外消毒柜(SpectrolinkerTM XL-1500UV Crosslinker)；CleanSpot PCR/UV工作台(Laborartory Products)；PCR仪(ABI PCR System 9700)；琼脂糖凝胶电泳仪(Thermo EC105)；紫外凝胶成像系统(Epi Chemi II Darkroom UVP)。
主要试剂：DNA提取试剂盒 SPIN for Soil Kit(MP Biomedicals)；Fermentas超纯水(Applied Biosystems)；Fermentas PCR Master Mix 2×(Applied Biosystems)；牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)；Ultra PureTM 10×TAE缓冲液(Invitrogen)；琼脂糖 LE Agarose(Lonza)；溴化乙锭(EB)(Sigma)；6×DNA上样缓冲液(BioLab)；TriDyeTM 100bp DNA Ladder(BioLab)。
根据本发明的一个优选实施例，提供一种利用离心沉淀和PCR技术检测污水中隐孢子虫与贾第虫的方法，具体步骤如下：
1)选取采样点，一般选择污水泵站，用集水器采集泵站污水池的污水，每次采集后沉淀30分钟，倒去上层污水，取下层沉淀较多的污水倒入3升的塑料桶中。
2)重复此步骤，至采样总量达到6升，装满2个塑料桶。
3)将水样倒入用500毫升离心瓶，离心机转速设置为3000转/分钟，温度设置为4℃，离心15分钟。
4)倒去上清，收集沉淀，转入15毫升离心管中。
5)重复步骤(3)，至水样全部被离心。
6)按照DNA提取试剂盒(FastDNA SPIN Kit for Soil)，根据说明书中提供的方法提取离心沉淀中的DNA，保存于-20℃待用。
7)PCR检测。
PCR体系如下表：
试剂 第一轮PCR加样体积 第二轮PCR加样体积
超纯水 18.5μL 16μL
Master Mix 25μL 25μL
BSA(10mg/ml) 2μL -
正向引物 1.25μL 2.5μL
反向引物 1.25μL 2.5μL
DNA模板 2μL 4μL*
总计 50μL 50μL
1)隐孢子虫18S rRNA基因：
a)第一轮
F1：CCTATCAGCTTTAGACGGTAGG
R1：TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
b)第二轮
F2：GACATATCATTCAAGTTTCTGACC
R2：CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
2)贾第虫tpi基因：
a)第一轮
f1：AATAAATIATGCCTGCTCGTCG
r1：ATGGACITCCTCTGCCTGCTC
b)第二轮
f2：CCCTTCATCGGIGGTAACTTCAA
r2：GTGGCCACCACICCCGTGCC
PCR循环参数如下：采用巢式PCR技术，即两轮PCR，第一轮的产物略长于第二轮的目标产物，最终用来测序的是第二轮的产物。
1)扩增隐孢子虫18S rRNA基因的PCR循环参数
2)扩增贾第虫tpi基因的PCR循环参数
实施例1
从污水泵站收集污水样品，经上述离心，DNA提取，PCR等步骤，用牛粪中的隐孢子虫阳性DNA样品(采集自江苏兴化某奶牛养殖场)作为阳性对照，对污水中的隐孢子虫进行检测。
结果如图1所示，样品1～4，8，11～12，15，26的扩增产物约为580bp，即为隐孢子虫18S rRNA基因，因此说明这些样品中含有隐孢子虫，而其他样品中则不含隐孢子虫。
实施例2
用实施例1中的DNA样品进行贾第虫检测，用牛粪中的贾第虫阳性DNA样品(同实施例1采集自江苏兴化某奶牛养殖场)作为阳性对照，对污水中的贾第虫进行检测。
结果如图2所示，样品1～4，8～9，11～15，19～20，27，30，35～36的扩增产物为530bp，即为贾第虫tpi基因，因此说明这些样品中含有贾第虫，而其他样品中则不含贾第虫。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
序列表
<110> 华东理工大学
<120>一种城市污水中隐孢子虫、贾第虫的快速检测及溯源方法
<160> 8
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> F1
<223>生工生物工程(上海)股份有限公司
<400> 1
cctatcagct ttagacggta gg 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> R1
<223>生工生物工程(上海)股份有限公司
<400> 2
tctaagaatt tcacctctga ctg 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> F2
<223>生工生物工程(上海)股份有限公司
<400> 3
gacatatcat tcaagtttct gacc 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> R2
<223>生工生物工程(上海)股份有限公司
<400> 4
ctgaaggagt aaggaacaac c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>f1
<223>生工生物工程(上海)股份有限公司
<400> 5
aataaatiat gcctgctcgt cg 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> r1
<223>生工生物工程(上海)股份有限公司
<400> 6
atggacitcc tctgcctgct c 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>f2
<223>生工生物工程(上海)股份有限公司
<400> 7
cccttcatcg giggtaactt caa 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> r2
<223>生工生物工程(上海)股份有限公司
<400> 8
gtggccacca cicccgtgcc 20

Claims (8)

1.一种城市污水中隐孢子虫、贾第虫的快速检测及溯源方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)采集适量城市污水，静置一定时间后，弃去上层污水，收集下层污水；
2)重复步骤1)至一定水样总量；
3)将收集到的水样离心，收集沉淀；
4)提取所述沉淀中的DNA；
5)对提取到的DNA进行PCR并测序，以检测该城市污水中的隐孢子虫和贾第虫；以及
6)将步骤5)中得到的序列与GenBank中的序列进行比对，确定虫种或基因型，明确宿主来源。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，以所述提取到的DNA为模板，采用巢式PCR技术分别扩增隐孢子虫18S rRNA基因和贾第虫tpi基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，扩增隐孢子虫18S rRNA基因的第一轮正向引物具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，第一轮反向引物具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，第二轮正向引物具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，第二轮反向引物具有SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，扩增贾第虫tpi基因的第一轮正向引物具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，第一轮反向引物具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，第二轮正向引物具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，第二轮反向引物具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过对PCR扩增获得的DNA进行基因测序以及序列分析，分别得到隐孢子虫和贾第虫的基因型和基因亚型，进而推测污染源。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)包括：每次采集适量城市污水，静置20～30分钟，收集下层污水。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)包括：重复步骤1)至水样总量达到3～6L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)包括：将收集到的水样分批次离心，3000转/分钟，4℃，离心13～15分钟，收集沉淀。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170919

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