CN101440396A

CN101440396A - 用于隐孢子虫种属与蓝氏贾第虫检测的多重悬浮芯片及其制备方法

Info

Publication number: CN101440396A
Application number: CNA2008100517281A
Authority: CN
Inventors: 李建华; 张楠; 李巍; 张西臣; 宫鹏涛; 李淑红
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2008-12-31
Filing date: 2008-12-31
Publication date: 2009-05-27
Anticipated expiration: 2028-12-31
Also published as: CN101440396B

Abstract

本发明提供了一种用于隐孢子虫种属与蓝氏贾第虫检测的多重悬浮芯片，包括诊断引物和与微球耦联的特异性寡聚核苷酸探针，其中，寡聚核苷酸探针序列为隐孢子虫种或属特异或贾第虫种特异性的基因中的序列。结合了多重PCR技术与液相杂交技术，能有效的消除假阳性，在保证精准特异性的同时，其敏感性比普通的PCR技术提高10－1000倍。可以同时对隐孢子虫属、微小隐孢子虫及蓝氏贾第虫等水源性的两种原虫进行鉴定和检测，具有高特异性、高灵敏度、快速、低成本易于推广等特点。

Description

用于隐孢子虫种属与蓝氏贾第虫检测的多重悬浮芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种分子生物学检测芯片，具体涉及一种用于隐孢子虫种属与蓝氏贾第虫检测的多重悬浮芯片，还涉及该芯片的制备方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

隐孢子虫(Cryptosproidium spp.)包括：微小隐孢子虫(C.parvum)、安氏隐孢子虫(C.andersoni)、贝氏隐孢子虫(C.baileyi)、火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)、人源隐孢子虫(C.hominis)及猪隐孢子虫(Porcine Cryptosporidium)，是一种危害广泛的人兽共患寄生虫原虫病，可造成哺乳动物尤其是反刍动物和人的严重腹泻。

蓝氏贾第虫(Giardia lambila Stiles，1915)是一种世界范围分布的人兽共患原虫，它可引起人或动物的蓝氏贾第虫病，主要症状是腹泻。

隐孢子虫与蓝氏贾第虫同属水源性呈爆发性广泛流行的原虫，病理反应均为严重腹泻。因此，开发一种特异灵敏的隐孢子虫属、微小隐孢子虫种及蓝氏贾第虫的多重检测方法已经是迫在眉睫。

隐孢子虫病与贾第虫病的现行诊断方法主要有病原学诊断、免疫学诊断及分子生物学诊断三大类。病原学诊断多通过粪便显微镜检及改良的抗酸染色法检查，此法费时费力且检出率低下。免疫学诊断有间接血凝试验(IHA)、免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、单克隆抗体(McAb)等方法，然这些免疫学方法特异性和敏感性都也较低。PCR技术是一种特异敏感直观的检测方法，其特异性检测可以通过分析属特异及种特异的诊断序列，设计属和种特异引物，其敏感性可通过优化扩增条件来提高，最后通过电泳分析直接观察扩增结果。但是，PCR存在着较高的假阳性机率，其敏感性也有所欠缺，

目前尚未有用于检测隐孢子虫及蓝氏贾第虫的悬浮芯片的报道。

发明内容

本发明公开一种用于隐孢子虫种属与蓝氏贾第虫检测的多重悬浮芯片，可以同时检测隐孢子虫与蓝氏贾第虫。

本发明还公开了上述芯片的制备方法，适用工业化生产。

本发明的悬浮芯片：

包括诊断引物和与微球耦联的特异性寡聚核苷酸探针，其中寡聚核苷酸探针序列为隐孢子虫种或属特异或贾第虫种特异性的基因中的一段序列。

隐孢子虫种特异诊断序列：一段指状U1核内小分子核糖核蛋白基因，NCBI中比对仅为人源和微小隐孢子虫所共有，同源性均为100％，符合种特异检测研究标准。

隐孢子虫属特异诊断序列：18SrRNA基因(此基因为隐孢子虫的各个种所共有且是种间基因变异最小的一段基因)序列中保守的部分，在NCBI中比对为多个隐孢子虫种共有，且同源性大于98％，符合属特异检测标准。

贾第虫种特异诊断序列：beta-giardin，该序列经国外重多学者验证具有良好的种特异性，是常用的贾第虫基因分型和鉴别诊断基因。根据以上属特异和种特异诊断序列设计特异性诊断引物及探针如下：

隐孢子虫种特异引物H及探针ProH：

HF：5’-Biotin-TAAGAAGCCACCAAGAAGGCG-3’

HR：5’-TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3

ProH探针序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-CTTTCGGACCTCTTCCTCATC-3’

隐孢子虫属特异引物C及探针ProC：

CF：5’-ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3’

CR：5’-Biotin-AGCCGCCCATAGAATCAAGAA-3’

ProC探针序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-ACTCACCAGGTCCAGACATAG-3’

蓝贾第虫种特异引物G及探针ProG：

GF：5’-TACGCTCACCCAGACGATG-3’

GR：5’-Biotin-TCGGCGGACTTCTTGACCT-3’

ProG探针序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-CAGCAACATGAACCAGCG-3’

以上三段寡聚核苷酸探针序列均在5’进行NH₂-(CH₂)₁₂修饰。H上游引物、C与G的下游引物均用Biotin标记，上述引物可扩增包含上述探针序列的三段特异的诊断序列。

本发明悬浮芯片的制备方法，包括以下步骤：

1、制备寡聚核苷酸探针；

2、用纯水稀释氨基修饰的探针；

3、将储备的微球振荡，然后转移到棕色EP管中；

4、离心收集微球，加入MES液进行振荡；

5、向悬浮微球中加入上述探针，并振荡；

6、在微球溶液中加入新配制的10mg/ml EDC，振荡；然后进行温育；

7、再次向微球溶液中加入新配置的10mg/ml EDC，振荡，然后进行温育；

8、向微球溶液中加0.02％ Tween-20，离心收集微球；

9、用0.1％ SDS重悬微球，离心收集微球；用TE悬浮微球；

10、用血球计数板计算微球的个数，2—8℃，避光保存。

原理：每一种色标微球可通过羧基，与特定的分析物质(寡核苷酸探针、抗原、抗体等)共价结合。将标记生物探针的微球与待测物进行特异性的结合，再和带有第三种荧光素的报告分子反应，在一个反应孔内可同时对一个样本中的100种不同目的分子进行检测。反应后，采用96孔板进行进样。检测仪自动将反应液吸起加入蠕动泵，泵入一个微细管中，在鞘液的作用下，单排分布的微球单个通过检测通道。检测通道中设有两个激光探头，一个探头可发射635nm波长的激光，可激发标记微球的两种荧光素，从而识别不同的色标微球，进行定性检测；另一激光探头可激发报告分子的荧光素，通过测定微球所带报告分子荧光信号的强度，可进行定量检测。因此，悬浮芯片可进行定性定量检测目标分子。当样本中含有目的分子，目的分子与特定的微球所带的探针吸附在一起时，两道激光所激发的荧光均可被检测到；若样本中不含目的分子，则仅能检测到微球所带的荧光。通过数字信号处理器与计算机自动统计软件，分析两道激光所激发荧光的波长和信号强度，从而判断待检样本中几种至数十种检测目标物，并通过检测荧光信号强度，对检测物进行定量分析。自动加样器依次将不同样本加入蠕动泵中，样本之间用一小段气柱分隔开，这样在连续分析过程中不但可以区分不同样本，可还以防止样本间的污染。

本发明悬浮芯片检测隐孢子虫是通过以下方法进行的：

根据隐孢子虫及蓝氏贾第虫种属特异性基因设计并合成用于PCR扩增的特异性引物，并对其中一条引物进行Biotin修饰；按常规方法制备待检样本基因组DNA作为模板，使用上述特异性引物进行PCR扩增，同时使PCR产物带上Biotin修饰；将PCR产物与制备的悬浮芯片杂交，也就是与耦联在微球上的探针进行杂交，对杂交悬浮芯片进行链霉亲和素化藻红蛋白标记，然后通过流式细胞仪检测荧光信号。

为了克服PCR假阳性，本发明采用了独特的UNG—Taq酶体系。具体方法是PCR反应体系中，将dTTP量减半，由dUTP替代，并加入0.05U的UNG(尿嘧啶DNA糖苷酶)。PCR产物中被掺入一定量的dUTP，UNG通过打断核酸链上dUTP上的糖苷键，使含dUTP的核酸不能作为模板被识别。在运行PCR程序之前先37℃温育5min，使UNG充分消化PCR产物，94℃模板变性时，UNG失活，进行正常PCR反应。

本发明与其它蛋白质和核酸检测方法相比较，具有的积极效果在于：结合了多重PCR技术与液相杂交技术，能有效的消除假阳性，在保证精准特异性的同时，其敏感性比普通的PCR技术提高10-1000倍。可以同时对隐孢子虫属、微小隐孢子虫及蓝氏贾第虫等水源性的两种原虫进行鉴定和检测，具有高特异性、高灵敏度、快速、低成本易于推广等特点。

本悬浮芯片

1、应用范围广：微球表面的羧基可与核酸探针和蛋白分子耦联，能对目的核酸和蛋白分子进行定性定量研究；

2、敏感性高：以微球作为反应载体，增加了反应物接触面积；每个微球表面带有约108个羧基位点，以共价键方式耦联寡核苷酸探针、抗体或抗原，探针密度高，产生的信号强；使用荧光检测，放大了反应信号，敏感性大大提高。

3、重复性好：所进行的生物反应是在液相环境中进行的，利于保持核酸、蛋白等生物分子天然构象，克服了传统芯片空间效应的影响，也更利于探针和被检物质的反应，提高了检测的准确性；

4、信噪比低：在微细管中对单个微球进行检测，不存在本底影响检测的问题，无需洗脱去除本底；

5、高通量：可以同时对同一样本中的多重不同目的分子进行定性定量分析，即提高了检测信息通量，又节约了样本用量；

6、快速高效：大大提高了反应速度和检测速度。由于所进行的生物反应是在液相环境中进行的，杂交仅需15分钟即可完成，提高了反应速度；在35—60分钟内，可对96个不同样本分别同时进行多达100种指标的检测；利用96孔板和自动进样系统，可连续进行n×96个样品的检测。

7、成本低：制备过程无需特殊设备，只进行羧基与氨基间的脱水成肽反应即可，简单易行；由于是液体储存方式，一次制备可多次使用，平均每个指标检测成本仅需2.5—5.0元；

8、易于标准化：基于上述特点，使得该技术能够做到标准化，易于试剂盒的研制和推广。目前，悬浮芯片是美国FDA唯一批准用于临床诊断(自身免疫病检测和人类白细胞抗原分型)的生物芯片。

附图说明

图1为三重PCR引物(H、C和G)浓度配比摸索图；

Lane1-6：三引物各浓度配比梯度为：0.5/0.5/0.5μM、0.6/0.5/0.4μM、0.7/0.4/0.4μM、0.6/0.4/0.5μM、0.8/0.3/0.4μM、0.8/0.4/0.3μM。由上图可见，两引物浓度配比为0.7/0.6/0.7μM时就能发挥最佳扩增效果。

图2为单个特异引物对单个模板扩增图；

Lane1-11：DL2000 Marker、牛微小隐孢子虫、羊微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、猪隐孢子虫、人源贾第虫、犬源贾第虫、鸡艾美尔球虫、弓形虫、毛滴虫、阴性对照。

G引物：

Lane1-11：DL2000Marker、人源贾第虫、犬源贾第虫、牛微小隐孢子虫、羊微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、猪隐孢子虫、鸡艾美尔球虫、弓形虫、毛滴虫、阴性对照。

图3为三重引物对单个模板进行扩增图；

Lane1，2-14：DL2000Marker、牛微小隐孢子虫、羊微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、猪隐孢子虫、人源贾第虫、犬源贾第虫、鸡艾美尔球虫、鼠艾美尔球虫、弓形虫、毛滴虫、阴性对照。

图4为三重悬浮芯片体系特异性检测结果制图；

Lane1-13：TE buffer对照、阴性对照、牛微小隐孢子虫、羊微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、猪隐孢子虫、人源贾第虫、犬源贾第虫、鸡艾美尔球虫、鼠艾美尔球虫、弓形虫、毛滴虫。

图5为单个引物敏感性试验图；

图6为三重PCR敏感性试验图；

模板浓度梯度设为：100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0001ng。由上图可见H、C、G引物最低检测阈值分别为：H(10pg)、C(1pg)和G(1pg)，完全符合敏感性检测标准。

图7为三重悬浮芯片体系敏感性试验制图；

模板浓度梯度设为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg。由上图可见悬浮探针ProH、ProC、ProG引物最低检测阈值分别为：H(1fg)、C(1fg)和G(1fg)，比普通的三重PCR敏感性提升了1000倍，完全符合敏感性检测标准。

具体实施方式

为进一步说明本发明在隐孢子虫和蓝氏贾第虫检测中的应用，特举以下较佳实施例进行说明，但本发明的应用并不限于实施例。

实施例1

引物的设计和合成

一、材料：分子生物学软件Primer Premier 5.0、DNAMAN、oligo 6.0及NCBI网络资源。

二、方法结果：

1、序列获得：通过对隐孢子虫及蓝氏贾第虫进行全基因组分析，选取其相应的种属特异性检测基因作为靶序列，并从GenBank公共数据库中获得此基因序列，登录号分别为：XM_626719、X64340、X85958。

2、设计引物：在NCBI数据库中查找隐孢子虫所有有效种的序列，将序列用DNAMAN软件进行分析比对，找出基因保守区部分，采用Primer Premier 5.0软件设计属特异引物，并用oligo 6.0进行分析验证。隐孢子虫种特异及贾第虫种特异引物直接从特异的诊断序列中设计，设计方法同属特异引物设计相同，相关参数为：Tm值55.0℃—65.0℃，GC值40.0％—60.0％，PCR产物大小为100bp—500bp，引物大小22±3bp；

3、引物选择：将软件输出的引物进行适当的手动调节，增加或减少几个碱基，保证上下游引物Tm差异在有效的范围之内或接近。然后在GenBank进行在线Blast比对，选取特异性高的引物，并根据引物与探针之间Dimer形成机率的高低将其中的一条进行5’末端Biotin标记，扩增片段大小分别为为424bp、223bp和267bp。

4、引物合成：上海生工合成引物HR、CF、GF，大连TakaRa合成Biotin标记的引物HF、CR、GR。

实施例2

探针的设计和合成

一、材料：分子生物学软件Primer Premier 5.0、oligo 6.0及NCBI网络资源。

二、方法结果：

1)序列获得：在上述扩增片段非引物区设计探针；

2)设计探针：采用Primer Premier 5.0软件设计探针，探针长度根据Luminex公司推介的长度18bp-22bp选定Hybridization Probes命令，根据引物与探针之间Dimer形成情况在Anti-sense或sense链上设计探针，参数同实施例一；

3)探针选择：将软件输出的探针进行适当的手动调节，增加或减少几个碱基，然后在GenBank进行在线Blast比对，选取特异性高的探针，在5’末端进行NH₂-(CH₂)₁₂修饰，选定的探针序列为ProH、ProC、ProG；

4)探针合成：大连TakaRa合成上述探针。

实施例3

悬浮芯片的制备方法

一、材料：合成好的探针、带光谱地址的微球、棕色避光EP管、2-(N-吗啉代)乙磺酸、1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺、高速离心机。

二、方法结果：

1、用纯水稀释氨基修饰的探针到1mM(1nanomole/μl)；

2、将储备的微球振荡20sec；

3、取200μl微球转移到棕色EP管中；

4、收集微球，8000g，离心1-2min；

5、弃上清，加入50μl 0.1M MES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid，2-(N-吗啉代)乙磺酸)液pH 4.5，振荡20sec；

6、向悬浮微球中加入2μl 1mM的探针，振荡20sec；

7、准备新鲜的10mg/ml EDC(1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride，1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺)，用dH2O；

8、向微球溶液中加入2.5μl新配置的10mg/ml EDC，振荡；

9、在室温黑暗条件下温育30min；

10、再次准备新鲜的10mg/ml EDC，用dH2O；

11、向微球溶液中加入2.5μl新配置的10mg/ml EDC，振荡；

12、在室温黑暗条件下温育30min；

13、向微球溶液中加1.0mL 0.02％ Tween-20；

14、8000×g离心1—2min，收集微球；

15、弃上清，用1.0mL 0.1％ SDS重悬微球；

16、8000×g离心1—2min，收集微球；

17、用100μl TE，pH＝8.0，悬浮微球，

18、用血球计数板计算微球的个数

19、将微球2—8℃，避光保存备用。

实施例4

三重悬浮芯片快速检测隐孢子虫及蓝氏贾第虫方法

一、材料：

裂解液、蛋白酶K、酚-氯仿-异戊醇、NaAc(pH5.2)、75％乙醇、TaKaRa ExTaq酶、TaKaRa dNTPs、合成好的引物与探针、Biometra PCR仪、已经耦联好的带光谱地址的微球、TMAC杂交液、96孔滤板、链霉亲和素化藻红蛋白、Luminex液相芯片检测系统。

二、方法结果：

1、用自配裂解液(NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5)20mM、EDTA 25mM、SDS 2％(w/v)和蛋白酶K 0.1μg/μl)裂解后用酚-氯仿-异戊醇抽提冷乙醇沉淀法提取总核酸。

2、PCR扩增目的片段，反应条件如下：

表格2 三重PCR反应体系

PCR反应程序为：

3、三对引物各自及三重PCR体系条件的摸索：

1)三对引物各自浓度的优化：设置引物在体系的终浓度梯度为：0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM。，用此区间的引物尝试都得到相应的扩增，其中当引物量为10pmol(引物的贮存浓度为20pmol/μl，取0.5μl)终浓度为0.5pmol/μl时效果最佳。

2)三对引物各自退火温度的优化：设置引物的退火温度分别为：47℃、49℃、52℃、54℃、56℃、59℃、61℃、63℃，在梯度PCR仪上进行扩增，结果在59℃时三对引物都有最优化的扩增。

3)三对引物各自dNTPs浓度的优化：设置每种dNTPs(each)浓度梯度为：50μM、100μM、250μM、350μM、400μM。，在这个浓度段里都得到不错的扩增，其中在浓度为250μM(each)时三对引物均有最佳扩增。

4)三对引物各自Mg²⁺浓度的优化：设置Mg²⁺终浓度梯度为：1nM、1.5nM、2nM、3nM、4nM、5nM，其中浓度在1.5mM时三对引物均有最佳扩增。

5)三对引物最佳酶浓度的摸索：设置酶浓度梯度为：0.5U、1U、2U、3U、4U，两引物在此浓度段时均有不错的扩增，但在2U时三对引物均得到最优化的扩增。

6)三重PCR体系条件的摸索：三重PCR体系的Mg²⁺终浓度为3mM，dNTPs(each)的终浓度为500μM，酶浓度为2U，退火温度为59℃，引物H、C、G的浓度梯度设为0.5/0.5/0.5μM、0.6/0.5/0.4μM、0.7/0.4/0.4μM、0.6/0.4/0.5μM、0.8/0.3/0.4μM、0.8/0.4/0.3μM。三对引物浓度配比为0.7/0.6/0.7μM时就能发挥最佳扩增效果(见附图1)。

杂交：杂交液组成：33.3μl 1.5×TMAC(tetramethylammonium chloride，氯化四甲铵)，5μl上述PCR产物，加入实施例三制备的5000个与探针耦联的微球，1×TE将体积补充到50μl。将杂交液在95℃变性4min，52℃杂交15min以上。

检测：将上述杂交后的溶液全部转移到96孔滤板中，真空过滤收集微球，用2μg/mlS-R-PE(Streptavidin-R-phycoerythrin，链霉亲和素化藻红蛋白)重悬微球，置52℃10min，Luminex检测。

实施例5

悬浮芯片的特异性鉴定和灵敏度检测

一、材料：

牛微小隐孢子虫、羊微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、猪隐孢子虫、人源贾第虫、犬源贾第虫、柔嫩艾美尔球虫、尼氏艾美尔球虫、刚地弓形虫、阴道毛滴虫总基因组。

二、方法结果：

1、三重悬浮芯片特异性试验：

1)用本发明的特异性引物分别对所有基因组单个进行检测，取牛微小隐孢子虫、羊微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、猪隐孢子虫、人源贾第虫、犬源贾第虫、柔嫩艾美尔球虫、刚地弓形虫、阴道毛滴虫等10个样本的DNA为模板，用建立的扩增体系分别对其进行扩增。同时设立阴性对照，检测结果如下(见附图2)：

a)隐孢子虫种特异引物H只能对能感染人的两种进行扩增；

b)隐孢子虫属特异引物C对所有的隐孢子虫种基因组都能有效扩增；

c)蓝氏贾第虫种特异引物G能对能感染人的两种进行扩增。

2)用本发明的三对特异引物H、C和G一起对所有基因组单个进行检测，取牛微小隐孢子虫、羊微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、猪隐孢子虫、人源贾第虫、犬源贾第虫、柔嫩艾美尔球虫、尼氏艾美尔球虫、刚地弓形虫、阴道毛滴虫等11个样本的DNA为模板，用建立的扩增体系分别对其进行扩增，同时设立阴性对照。检测结果如下(见附图3)：

a)能感染人的牛与羊微小隐孢子虫在属特异和种特异处都得到有效扩增；

b)安氏、贝氏和猪隐孢子虫只在属特异处得到有效扩增；

c)人源和犬源贾第虫在贾第虫种特异处得到有效扩增；

d)其它的对照均没有扩增。

3)用本发明的特异探针ProH、ProC和ProG与以上三重PCR单个检测核酸的产物进行杂交通过Luminex检测仪进行检测，检测结果如下(见附图4)：

Luminex公司推介的阳性判定标准为：样品值荧光值大于2倍的阴性对照值。在我们的三重悬浮芯片检测中，ProH、ProC和ProG分部在其特异检测样品中读取的荧光值均远远大于2倍阴性和空白对照值值，同时通过控制引物探针的量，不断摸索体系反应条件使得阴性和空白对照值均控制在50以下，这就更加严谨地证实了检测的特异性。

2、三重悬浮芯片灵敏度试验：

1)用本发明的特异性引物分别对所有基因组单个进行检测，模板定量后倍比稀释，核酸含量依次为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg。检测结果如下(见附图5)：

a)隐孢子虫种特异性引物H检测阈值为10ng；

b)隐孢子虫属特异性引物C检测阈值为1ng；

c)蓝氏贾第虫种特异引物G检测阈值为1ng；

2)用本发明的三对特异性引物同时对两种模板进行检测，模板定量后倍比稀释，核酸含量依次为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg。检测结果如下(见附图6)：

如单个检测一样，三重体系中隐孢子虫种特异性引物H检测阈值为10ng，隐孢子虫属特异性引物C检测阈值为1ng，蓝氏贾第虫种特异引物G检测阈值为1ng。

3)用本发明的三重悬浮芯片同时对两种模板进行检测，模板定量后倍比稀释，核酸含量依次为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg。检测结果如下(见附图7)：

Luminex公司推介的阳性判定标准为：检测样品的荧光值大于2倍的阴性对照值。在三重悬浮芯片的敏感性的试验中，ProH、ProC和ProG在含1fg核酸的模板中的荧光值均大于2倍的阴性对照值，且阴性对照值均控制在50以下。比单纯的三重PCR检测体系敏感性提高了1000倍。

综上所述，三重悬浮芯片体系实现了良好的特异性检测，同时又将敏感性提升了1000倍。因此，将三重悬浮芯片体系用于隐孢子虫和蓝氏贾第虫的检测有不可比拟的优点。

Claims

1、一种用于隐孢子虫种属与蓝氏贾第虫检测的多重悬浮芯片，包括诊断微球和与此微球耦联的特异性寡聚核苷酸探针，其中，寡聚核苷酸探针序列为隐孢子虫种或属特异或贾第虫种特异性的基因中的序列；

隐孢子虫种特异诊断序列：指状U1核内小分子核糖核蛋白基因，NCBI中比对仅为人源和微小隐孢子虫所共有，同源性均为100％，符合种特异检测研究标准；

隐孢子虫属特异诊断序列：18SrRNA基因序列中保守的部分，在NCBI中比对为多个隐孢子虫种共有，且同源性大于98％，符合属特异检测标准；

贾第虫种特异诊断序列：beta-giardin。

2、权利要求1所述的悬浮芯片，其特征在于：以上属特异和种特异诊断序列设计特异性诊断引物及探针如下：

隐孢子虫种特异引物H及探针ProH：

HF：5’-Biotin-TAAGAAGCCACCAAGAAGGCG-3’

HR：5’-TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3

ProH探针序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-CTTTCGGACCTCTTCCTCATC-3’

隐孢子虫属特异引物C及探针ProC：

CF：5’-ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3’

CR：5’-Biotin-AGCCGCCCATAGAATCAAGAA-3’

ProC探针序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-ACTCACCAGGTCCAGACATAG-3’

蓝贾第虫种特异引物G及探针ProG：

GF：5’-TACGCTCACCCAGACGATG-3’

GR：5’-Biotin-TCGGCGGACTTCTTGACCT-3’

ProG探针序列：5’-NH₂-(CH₂)₁₂-CAGCAACATGAACCAGCG-3’

以上三段寡聚核苷酸探针序列均在5’进行NH₂-(CH₂)₁₂修饰；H上游引物、C与G的下游引物均用Biotin标记，上述引物可扩增包含上述探针序列的三段特异的诊断序列。

3、权利要求1所述悬浮芯片的制备方法，包括以下步骤：

1)制备寡聚核苷酸探针；

2)用纯水稀释氨基修饰的探针；

3)将储备的微球振荡，然后转移到棕色EP管中；

4)离心收集微球，加入MES液进行振荡；

5)向悬浮微球中加入上述探针，并振荡；

6)在微球溶液中加入新配制的10mg/ml EDC，振荡；然后进行温育；

7)再次向微球溶液中加入新配置的10mg/ml EDC，振荡，然后进行温育；

8)向微球溶液中加0.02％ Tween-20，离心收集微球；

9)用0.1％SDS重悬微球，离心收集微球；用TE悬浮微球；

10)用血球计数板计算微球的个数，2—8℃，避光保存。