CN101429545A

CN101429545A - 一种应用悬浮芯片技术检测志贺氏菌方法

Info

Publication number: CN101429545A
Application number: CNA2008101672674A
Authority: CN
Inventors: 王景林; 赵金银; 高姗; 刘艳华; 康琳
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2008-10-17
Filing date: 2008-10-17
Publication date: 2009-05-13

Abstract

本发明涉及一种用于志贺氏菌检测的悬浮芯片及其检测方法，该悬浮芯片包括微球载体和固定在载体上的寡聚核苷酸探针，其中该寡聚核苷酸探针是从志贺氏菌筛选的特异性的基因侵袭性质粒抗原H中的一段DNA序列。利用设计的引物将待检样品基因组DNA扩增并标记后，利用上述悬浮芯片进行杂交，根据杂交荧光强度，可判断待检样品中是否含有志贺氏菌。悬浮芯片检测灵敏度高，可达到1.18fg基因组DNA(1fg相当于2个细菌数)水平，完全可满足临床样本和环境样本检测需要，并具特异性高、操作简单、成本低等特点，易于推广。并采用UNG－Taq酶PCR反应体系，大大降低了PCR假阳性结果。

Description

一种应用悬浮芯片技术检测志贺氏菌方法

技术领域

本发明属分子生物学检测领域，具体的是一种应用悬浮芯片技术对志贺氏菌进行检测。

背景技术

人类对志贺氏菌高度敏感，只需少于十个菌即可引起人的感染，因此其传染性强，危害性大。志贺氏菌可通过水、食物传播，引起人类腹泻及痢疾等。据国内相关资料显示，志贺氏菌在我国感染性腹泻病原菌中居首位；美国国家申报疾病监控系统及公共卫生试验信息系统数据显示，每年因志贺氏菌引起的病例高达448，240例，死亡70例；WHO年度报告指出，在亚非拉各国细菌性腹泻病例多达1.5-2.5亿人，死亡65万。国家质量监督检验检疫总局2002年第25号、26号令中明确规定志贺氏菌为食品中必检项目。

对志贺氏菌的检测主要包括传统的平板培养、免疫方法及分子生物学技术。

国标及行标多采用传统的平板培养或酶联反应(ELISA)的方法。平板培养方法步骤繁琐，费时费力，且对志贺氏菌缺乏合适的选择性培养基，其它微生物(如：沙门氏菌)竞争性生长，抑制了志贺氏菌，对此菌的检测准确性大大降低；免疫方法已进行多年的研究，但此方法也面临纯化、富集培养等问题，还有严重的交叉反应。同时这两种方法每次只能确定或排除一种病原体，不适合环境监测和流行病学调查。

病原菌检测的分子生物学技术，主要分为三类：普通PCR技术、荧光PCR技术和基因芯片技术。基因芯片方法检测效率高，但技术还不成熟，假阳性和假阴性率都很难控制，而且成本较高，目前还处于研究阶段。普通PCR技术成熟，已有大量的学者报道将此技术应用于病原菌检测，但易产生假阴性及交叉污染等现象，因此至今仍未能在临床中得到推广应用。

悬浮芯片技术是将基因芯片技术与流式细胞仪技术结合产生的一种新技术，是一种多重数据获取和分析平台，全名为“多功能多指标同步分析体系”(Flexible Multiple Analyte Profiling，xMap)，也称为Multi-Analyte SuspensionArray，有机整合了荧光编码微球、激光技术、微流体技术、快速信号处理和数据分析系统，即保证了信号质量，又提供高通量的新一代分子检测技术平台。悬浮芯片与传统的基因芯片最大不同之处在于，传统的基因芯片点样在玻片或尼龙膜上，依靠坐标定位进行寻址，而悬浮芯片将检测探针共价交联到不同的色标微球上，根据色标微球上所带的荧光素进行区分。

悬浮芯片系统主要由三部分组成：1、微球直径5.6μm左右，由聚苯乙烯构成的，表面带有约108个羧基位点，可与寡核苷酸探针和蛋白以肽键耦联；2、荧光素微球中标记了红色和橙色荧光素，每种分成10个浓度梯度，将微球分成可被识别的100种微球，当微球被635nm激光激发后，能发射658nm和712nm的荧光；3、检测仪因微球直径5.6μm，并被荧光标记，采用流式细胞仪技术原理进行检测。

原理：每一种色标微球可通过羧基，与特定的分析物质(寡核苷酸探针、抗原、抗体等)共价结合。将标记生物探针的微球与待测物进行特异性的结合，再和带有第三种荧光素的报告分子反应，在一个反应孔内可同时对一个样本中的100种不同目的分子进行检测。反应后，采用96孔板进行进样。检测仪自动将反应液吸起加入蠕动泵，泵入一个微细管中，在鞘液的作用下，单排分布的微球单个通过检测通道。检测通道中设有两个激光探头，一个探头可发射635nm波长的激光，可激发标记微球的两种荧光素，从而识别不同的色标微球，进行定性检测；另一激光探头可激发报告分子的荧光素，通过测定微球所带报告分子荧光信号的强度，可进行定量检测。因此，悬浮芯片可进行定性定量检测目标分子。当样本中含有目的分子，目的分子与特定的微球所带的探针吸附在一起时，两道激光所激发的荧光均可被检测到；若样本中不含目的分子，则仅能检测到微球所带的荧光。通过数字信号处理器与计算机自动统计软件，分析两道激光所激发荧光的波长和信号强度，从而判断待检样本中几种至数十种检测目标物，并通过检测荧光信号强度，对检测物进行定量分析。自动加样器依次将不同样本加入蠕动泵中，样本之间用一小段气柱分隔开，这样在连续分析过程中不但可以区分不同样本，可还以防止样本间的污染。

与其它蛋白质和核酸检测方法相比较，悬浮芯片具独特优点：

1)应用范围广微球表面的羧基可与核酸探针和蛋白分子耦联，能对目的核酸和蛋白分子进行定性定量研究；

2)敏感性高以微球作为反应载体，增加了反应物接触面积；每个微球表面带有约108个羧基位点，以共价键方式耦联寡核苷酸探针、抗体或抗原，探针密度高，产生的信号强；使用荧光检测，放大了反应信号，敏感性大大提高。

3)重复性好所进行的生物反应是在液相环境中进行的，利于保持核酸、蛋白等生物分子天然构象，克服了传统芯片空间效应的影响，也更利于探针和被检物质的反应，提高了检测的准确性；

4)信噪比低在微细管中对单个微球进行检测，不存在本底影响检测的问题，无需洗脱去除本底；

5)高通量可以同时对同一样本中的多重不同目的分子进行定性定量分析，即提高了检测信息通量，又节约了样本用量；

6)快速高效大大提高了反应速度和检测速度。由于所进行的生物反应是在液相环境中进行的，杂交仅需15分钟即可完成，提高了反应速度；在35—60分钟内，可对96个不同样本分别同时进行多达100种指标的检测；利用96孔板和自动进样系统，可连续进行n×96个样品的检测。

7)成本低制备过程无需特殊设备，只进行羧基与氨基间的脱水成肽反应即可，简单易行；由于是液体储存方式，一次制备可多次使用，平均每个指标检测成本仅需2.5—5.0元；

8)易于标准化基于上述特点，使得该技术能够做到标准化，易于试剂盒的研制和推广。目前，悬浮芯片是美国FDA唯一批准用于临床诊断(自身免疫病检测和人类白细胞抗原分型)的生物芯片。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种高特异性、高灵敏度、快速、低成本易于推广的检测志贺氏菌的悬浮芯片技术。

本发明所提供的检测志贺氏菌的悬浮芯片，包括诊断微球和与此微球耦联的特异性寡聚核苷酸探针，以及一对特异性的引物。该对引物可扩增志贺氏菌特异性的侵袭性质粒抗原H基因(invasive plasmid antigen H，IpaH)的一段序列，探针为此序列上的一段序列，引物和探针均具高度特异性。其上下游引物为：B-IpaH-F：5′-Biotin-CTTGACCGCCTTTCCGATAC-3′；IpaH-R：5′-ACTCCCGACACGCCATAGA-3′，并对上游引物Biotin标记。探针序列：Ipah-Probe：5′-NH₂-(CH₂)₁₂-CGGAGATTGTTCCATGTGAGC-3′，并在5′进行NH₂-(CH₂)₁₂修饰。

本发明的另一目的是应用悬浮芯片检测检测志贺氏菌的方法。

检测志贺菌所构建的PCR反应体系如下：

表格 1PCR反应体系

PCR反应程序为：37℃温育5min；94℃变性3min；运行35个循环：94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 40sec；最后，72℃延伸3min。

检测所构建的杂交条件为：33.3μl 1.5×TMAC(tetramethylammoniumchloride，氯化四甲铵)，5μl上述PCR产物，加入5000个与探针耦联的微球，1×TE将体积补充到50μl。将杂交液在95℃变性4min，52℃杂交15min以上。

本发明的另一目的在于提出一种制备上述悬浮芯片的方法。本发明所提供的制备悬浮芯片的方法，具体包括以下步骤：

1)用纯水稀释氨基修饰的探针到1mM(lnanomole/μl)；

2)将储备的微球振荡20sec；

3)取200μl微球转移到棕色EP管中；

4)收集微球，8000g，离心1-2min；

5)弃上清，加入50μl 0.1M MES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid，2-(N-吗啉代)乙磺酸)液pH4.5，振荡20sec；

6)向悬浮微球中加入2μl 1mM的探针，振荡20sec；

7)准备新鲜的10mg/ml EDC(1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride，1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺)，用dH₂O；

8)向微球溶液中加入2.5μl新配置的10mg/ml EDC，振荡；

9)在室温黑暗条件下温育30min；

10)再次准备新鲜的10mg/ml EDC，用dH₂O；

11)向微球溶液中加入2.5μl新配置的10mg/ml EDC，振荡；

12)在室温黑暗条件下温育30min；

13)向微球溶液中加1.0mL 0.02％ Tween-20；

14)8000×g离心1—2min，收集微球；

15)弃上清，用1.0mL 0.1％ SDS重悬微球；

16)8000×g离心1—2min，收集微球；

17)用100μl TE，pH＝8.0，悬浮微球，

18)用血球计数板计算微球的个数

19)将微球2—8℃，避光保存备用。

本发明的另一目的提供一种克服PCR假阳性的方法。本发明采用独特的UNG—Taq酶体系，有效的控制了PCR假阴性产生。具体方法是PCR反应体系中，将dTTP量减半，由dUTP替代，并加入0.05U的UNG(尿嘧啶DNA糖苷酶)。PCR产物中被掺入一定量的dUTP，UNG通过打断核酸链上dUTP上的糖苷键，使含dUTP的核酸不能作为模板被识别。在运行PCR程序之前先37℃温育5min，使UNG充分消化PCR产物，94℃模板变性时，UNG失活，进行正常PCR反应。

附图说明

图1特异性试验结果；

图2灵敏度试验结果；

图3UNG—Taq酶体系消化PCR产物试验结果。

具体实施方式：

为进一步说明本发明在志贺氏菌检测中的应用，特举以下较佳实施例进行说明，但本发明的应用并不限于实施例。

实施例一：引物的设计和合成

1)序列获得：通过对志贺氏菌进行全基因组分析，选取其特异性基因IpaH作为靶序列，并从GenBank公共数据库中获得此基因序列，编号为SHFIPAHX；

2)设计引物：采用Primer Premier 5.0软件设计引物，相关参数为：Tm值55.0℃—59.0℃，GC值40.0％—60.0％，PCR产物大小为100bp—500bp，引物大小22±3bp；

3)引物选择：将软件输出的引物进行适当的手动调节，增加或减少几个碱基，然后在GenBank进行在线Blast比对，选取特异性高的引物，并将其中的一条进行5′末端Biotin标记。上游引物序列为B-IpaH-F：5′-Biotin-CTTGACCGCCTTTCCGATAC-3′，下游引物为IpaH-R：5′-ACTCCCGACACGCCATAGA-3′，扩增片段大小为421bp；

4)引物合成：上海生工合成下游引物IpaH-R，大连TakaRa合成Biotin标记的上游引物B-IpaH-F。

实施例二：探针的设计和合成

1)序列获得：在上述扩增片段非引物区设计探针；

2)设计探针：采用Primer Premier 5.0软件设计探针，选定HybridizationProbes命令，在Anti-sense链上设计探针，参数同实施例一；

3)探针选择：将软件输出的探针进行适当的手动调节，增加或减少几个碱基，然后在GenBank进行在线Blast比对，选取特异性高的探针，在5′末端进行NH₂-(CH₂)₁₂修饰，选定的探针序列为Ipah-Probe：5′-NH₂-(CH₂)₁₂-CGGAGATTGTTCCATGTGAGC-3′；

4)探针合成：大连TakaRa合成上述探针。

实施例三：悬浮芯片快速检测志贺氏菌方法

1)TIANamp Bacteria DNA kit试剂盒提取待检样本基因组DNA。

2)PCR扩增目的片段，反应条件如下：

表格 2PCR反应体系

PCR反应程序为：94℃变性3min；运行35个循环：94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 40sec；最后，72℃延伸3min。

3)杂交：杂交液组成：33.3μl 1.5×TMAC(tetramethylammonium chloride，氯化四甲铵)，5μl上述PCR产物，加入5000个与探针耦联的微球，1×TE将体积补充到50μl。将杂交液在95℃变性4min，52℃杂交15min以上。

4)检测：将上述杂交后的溶液全部转移到96孔滤板中，真空过滤收集微球，用2μg/ml S-R-PE(Streptavidin-R-phycoerythrin，链霉亲和素化藻红蛋白)重悬微球，置52℃ 10min，Luminex检测。

实施例四：悬浮芯片的特异性鉴定和灵敏度检测

特异性试验：

用本发明的悬浮芯片对不同菌株进行检测，其检测范围包括以下三类菌株：

a)属于前述的5株志贺氏菌；

b)与志贺氏菌亲缘关系较近的大肠杆菌、沙门氏菌；

c)其它菌株。

菌株具体信息如下：

表格2

针对上述菌株，按实施例三中的方法进行检测，检测结果显示5株志贺氏菌均呈阳性结果，非志贺氏菌均呈阴性结果，特异性达100％。

灵敏度试验：

按实施例三中的方法进行灵敏度试验，以痢疾志贺CMCC51197研究对象，将提取的模板进行定量，所提模板的量为11.8ng/ml，依次进行10倍稀释，灵敏度试验中加入的模板量分别为1.18fg、11.8fg、118fg、1.18pg、11.8pg、118pg，以纯水做阴性对照。结果显示，灵敏度达1.18fg(相当于2—3个细菌数)，可满足临床样本及环境样本检测需要。

实施例五：UNG-Taq酶体系消除PCR产物污染是试验

按实施例三中的方法进行此试验。对PCR产物进行定量，分别取107、108、109、1010、1011、1012个PCR产物拷贝数作为模板，采用UNG—Taq酶体系进行反应，以纯水为阴性对照，以所提全基因组为阳性对照，分别设无UNG、0.05U UNG作为对比。结果显示UNG—Taq酶体系可消化1011个PCR产物拷贝数，有效的克服了PCR假阳性产生。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所

<120>一种应用悬浮芯片技术检测志贺氏菌方法

<140>

<141>

<160>3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

Claims

1.一种用于志贺氏菌检测的悬浮芯片，包括诊断微球和固定在该诊断微球上的寡聚核苷酸探针，其特征是该寡聚核苷酸探针是志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因上的一段DNA序列。

2.根据权利要求1所述用于志贺氏菌检测的悬浮芯片，其特征是该芯片可对痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、宋内氏志贺菌等志贺氏菌的四个血清型进行鉴定和检测。

3.根据权利要求1所述用于志贺氏菌检测的悬浮芯片，其特征是该寡聚核苷酸探针是志贺氏菌特异性基因IpaH上的一段DNA序列，其序列为：5′-CGGAGATTGTTCCATGTGAGC。

4.一种检测志贺氏菌的方法，其特征包括以下步骤：

a)根据志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因设计并合成用于PCR扩增的特异性引物，并对其中一条引物进行Biotin修饰；

b)按常规方法制备的待检样本基因组DNA，并使用步骤a)中的引物对待检样本基因组DNA进行PCR扩增，同时使PCR产物带上Biotin修饰；

c)将步骤b)中的PCR产物与权利要求1中所述悬浮芯片杂交；

d)对步骤c)中杂交悬浮芯片进行链霉亲和素化藻红蛋白标记，并对其检测荧光信号。

5.根据权利要求4所述的一种检测志贺氏菌的方法，其特征是上述步骤a)根据志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因设计的上游引物序列为：5′-CTTGACCGCCTTTCCGATAC；下游引物序列为：5′-ACTCCCGACACGCCATAGA；并对上游引物进行5′Biotin修饰。

6.根据权利要求4所述的一种检测志贺氏菌的方法，其特征是上述步骤b)所建立的PCR反应体系如下：

表格1 PCR反应体系

PCR反应程序为：37℃温育5min；94℃变性3min；运行35个循环：94℃30sec，53℃ 30sec，72℃ 40sec最后，72℃延伸3min。

7.根据权利要求4所述的一种检测志贺氏菌的方法，其特征是上述步骤c)所建立的杂交体系，杂交温度为52℃，杂交时间为大于15min。

8.一种抑制产生PCR假阳性的方法，其特征是采用UNG-Taq酶体系消除PCR产物污染。

9.根据权利要求8所述一种抑制产生PCR假阳性的方法，其特征是PCR反应体系中，将dTTP量减半，由dUTP替代，并加入0.05U的UNG(尿嘧啶DNA糖苷酶)。PCR产物中被掺入一定量的dUTP，UNG通过打断核酸链上dUTP上的糖苷键，使含dUTP的核酸不能作为模板被识别。在运行PCR程序之前先37℃温育5min，使UNG充分消化PCR产物，94℃模板变性时，UNG失活，进行正常PCR反应。