CN103088117B - 一种用于检测志贺氏菌的分子马达生物传感器试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种用于检测志贺氏菌的分子马达生物传感器试剂盒属于动物源性食品微生物快速检测领域，主要解决传统检测方法时间过长（5~6天）。本发明的核心技术是利用载色体Chromatophore上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器，F0F1-ATP合酶由于能快速地旋转，通过旋转它建立了催化位点与质子转运之间的偶联。首先在ATP合酶的ε亚基上连接IpaH探针，将待测样品和阴性对照分别与生物传感器结合后，比较其催化ATP合成10分钟后的ATP产生量，ATP合成的多寡可以通过环境中H+的量进行测量，而H+的多寡通过F-DHPE所体现的荧光强度大小来获得。本试剂盒可对待测样本中的志贺氏菌进行快速、灵敏、高通量的检测。
Description
技术领域
本发明是关于动物源性食品微生物快速检测技术的一种。
背景技术
传统的病原菌检测方法要求对每个检验项目进行非选择性增菌、选择性增菌、分离、筛选和鉴定等步骤，一般需要5天才能出具检测报告，严重影响货物的品质和货架寿命。一些新的技术如PCR技术、免疫学检测技术、生物芯片技术等检测方法仍依赖于传统的检测步骤，即需要进行增菌，耗时耗力，完成一次检测通常需要几天的时间。这样不仅增加了实验室的工作量，而且也不利于食品工业中生产流程的监测、终产品的质量控制以及政府部门对食品安全的管理和控制。由于进出口食品的大量增加，因此急需可靠有效的快速检测方法，缩短检测时间，促进我国食品的进出口贸易。
发明内容
以受控分子马达技术为核心，集成核酸探针识别、荧光探针标记与检测等技术，建立了一个全新概念的快速检测技术体系。利用ATP酶作为载体对目标物进行检测具有灵敏度高、特异性强、快速的特点。在F0F1-ATPase分子马达连接上特异的核酸探针，可以实现对特定食品微生物的快速、特异性、高通量的检测。本发明可将检测时间缩短至2天，且检测灵敏度能达到102CFU/ml，满足现有的食品微生物检测范围。
附图说明
附图1为分子马达生物传感器模式图（其中a、b、c、α、β、δ、γ、ε均为ATP合酶亚基），1为ε亚基抗体，2为链霉亲和素（Strptavidin），3为 N-biotin，4为IpaH探针，5为志贺氏菌单链DNA。
附图2为chro IpaH对不同种菌株的检测结果，纵坐标表示荧光值，横坐标表示检测的样本，其中1为水，2为志贺氏菌，3为副溶血性弧菌，4为大肠杆菌，5为沙门氏菌，6为霍乱弧菌，7为阪崎肠杆菌。
具体实施方式
根据志贺氏菌IpaH基因设计特异性核酸探针5’-attccgtgaacaggtcgctgcatggct，其中探针的5’用生物素进行标记。将该探针通过生物素抗体连接在分子马达上面，利用分子马达生物传感器即可对待测样本的DNA进行检测，当样品为志贺氏菌DNA时，检测体系的荧光值会发生明显的变化，通过这一变化即可判断样本为阳性。为此，我们设计了一个试剂盒，可以方便、快速对食品中的志贺氏菌进行检测。
试剂盒组成：
| 编号 | 组分名称 | 数量 | 保存条件 |
| 1 | Chro IpaH | 20μl | ﹣20℃ |
| 2 | 合成buffer | 10ml | 室温 |
| 3 | ADP（1.6mol/l） | 1ml | ﹣20℃ |
| 4 | 1×PBS | 25ml | 室温 |
| 5 | 荧光素酶/荧光素 | 100个单位 | ﹣20℃ |
| 6 | 荧光素酶/荧光素重组缓冲液 | 12ml | ﹣20℃ |
| 7 | 无菌水 | 5ml | 室温 |
操作步骤如下：
取1.5ml EP管，加入待测样本10μl。
将上述EP管置于95℃水浴5min，然后转移至50℃水浴1min。
取2μl chro IpaH，用合成buffer稀释到一定的倍数。取稀释后的chro 10μl加入上述EP管。
另取1个EP管加入10μl无菌水置于95 ℃水浴5 min，然后转移至50 ℃水浴1 min，再加入10μl合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀。
再向2个EP管中分别加入30μl启动buffer（启动buffer由ADP（1.6 mol/l）和合成buffer按体积比1:3配制，每次实验按需要取一定的量配制，现用现配），振荡使反应体系混匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠。
将上述反应体系放入37℃恒温摇床中温育10 min。
将EP管从摇床中取出，分别加入200μl PBS缓冲液，振荡使体系混匀。
取一块干净的96孔板，将2管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50μl，然后对每个加样孔分别加入30μl已配置好的荧光素酶溶液（将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡。使用前应将混合液在室温放置1h），用枪反复吹打几次使体系混匀。
将96孔板上机检测，处理数据，对各组数据取平均值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光值。
通过实验，分子马达生物传感器chro IpaH具有良好的特异性，用chro IpaH对水、志贺氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、阪崎肠杆菌进行检测，志贺氏菌的荧光值明显高于水和其他对照菌的荧光值，具体数据见下表，结果见附图2。
| 样品（50 ng/mL） | 荧光值 |
| 水 | 520552 |
| 志贺氏菌 | 682690 |
| 副溶血性弧菌 | 624801 |
| 大肠杆菌 | 643645 |
| 沙门氏菌 | 624338 |
| 霍乱弧菌 | 642460 |
| 阪崎肠杆菌 | 565623 |
实验结果表明，该试剂盒对志贺氏菌DNA的检测时间为40min，检出限为10 ng/ml。对志贺氏菌标准菌株的检出结果与PCR检测的结果一致。通过大量的实验验证该分子马达生物传感器具有良好的特异性和较高的灵敏度，并可通过96孔化学发光板高通量的对样本进行检测。
Claims (1)
1.一种用于检测动物源性食品中志贺氏菌的方法，其应用分子马达生物传感器试剂盒进行检测，所述试剂盒包含下述组分：
其中，所述分子马达生物传感器为Chro-IpaH，其构建方法为：
根据志贺氏菌IpaH 基因设计特异性核酸探针5’-attccgtgaacaggtcgctgcatggct，其中探针的5’用
生物素进行标记，将该探针通过生物素抗体连接在分子马达上面：将生物素标记的ε亚基抗体结合在F0F1-ATPase的ε亚基上，然后用链霉亲和素（Streptavidin）与ε亚基抗体上的生物素结合，最后将生物素标记的探针与链霉亲和素结合；
应用所述分子马达生物传感器试剂盒检测志贺氏菌的步骤包括：
1）取1.5ml EP管，加入待测样本10μl；
2）将上述EP管置于95℃水浴5min，然后转移至50℃水浴1min；
3）取2μl chro IpaH，用合成buffer稀释到一定的倍数，取稀释后的chro 10μl加入上述EP管；
4）另取1个EP管加入10μl无菌水置于95℃水浴5min，然后转移至50℃水浴1min，再加入10μl合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀；
5）再向2个EP管中分别加入30μl启动buffer，启动buffer由1.6mol/l的ADP与合成buffer按体积比1∶3配制，每次实验按需要取一定的量配制，现用现配，振荡使反应体系混匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠；
6）将上述反应体系放入37℃恒温摇床中温育10min；
7）将EP管从摇床中取出，分别加入200μl PBS缓冲液，振荡使体系混匀；
8）取一块干净的96孔板，将2管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50μl，然后对每个加样孔分别加入30μl已配置好的荧光素酶溶液，所述荧光素酶溶液配制方法为：将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡，使用前应将混合液在室温放置1h；用枪反复吹打几次使体系混匀；
9）将96孔板上机检测，处理数据，对各组数据取平均值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光值。
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| "分子马达传感器对沙门氏菌快速检测方法的初步研究";张捷等;《食品工业科技》;20111230;第33卷(第12期);第93-96页 * |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhang Jie Inventor after: Zhang Xin Inventor after: Wang Peirong Inventor after: Yue Jiachang Inventor after: Chen Guangquan Inventor after: Zou Mingqiang Inventor after: Wan Xiaonan Inventor after: Liu Feng Inventor after: Zhang Huiyuan Inventor after: Lu Xiaoyu Inventor after: Liu Yan Inventor after: Gu Dezhou Inventor after: Wang Qi Inventor before: Zhang Jie Inventor before: Wang Peirong Inventor before: Yue Jiachang Inventor before: Chen Guangquan Inventor before: Zou Mingqiang Inventor before: Liu Feng Inventor before: Zhang Huiyuan Inventor before: Lu Xiaoyu Inventor before: Liu Yan Inventor before: Gu Dezhou Inventor before: Wang Qi Inventor before: Zhang Xin |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: ZHANG JIE ZOU MINGQIANG LIU FENG ZHANG HUIYUAN LU XIAOYU LIU YAN GU DEZHOU WANG QI ZHANG XIN WANG PEIRONG LE JIACHANG CHEN GUANGQUAN TO: ZHANG JIE ZOU MINGQIANG WAN XIAONAN LIU FENG ZHANG HUIYUAN LU XIAOYU LIU YAN GU DEZHOU WANG QI ZHANG XIN WANG PEIRONG LE JIACHANG CHEN GUANGQUAN |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140528 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |