CN102936625B - 一种用于副溶血性弧菌分子分型的分子马达生物传感器试剂盒 - Google Patents
一种用于副溶血性弧菌分子分型的分子马达生物传感器试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102936625B CN102936625B CN201210406083.5A CN201210406083A CN102936625B CN 102936625 B CN102936625 B CN 102936625B CN 201210406083 A CN201210406083 A CN 201210406083A CN 102936625 B CN102936625 B CN 102936625B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chro
- tdh
- molecular motor
- trh
- toxr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 title claims abstract description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 101150021331 toxR gene Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000001018 virulence Effects 0.000 claims abstract description 14
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 33
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 210000003764 chromatophore Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 10
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 10
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 9
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 7
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims description 6
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 claims description 6
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 6
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 claims description 6
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003643 water by type Substances 0.000 claims description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 4
- 241001411320 Eriogonum inflatum Species 0.000 claims description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 claims description 3
- 241000589017 Thermomicrobium roseum Species 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims 4
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 claims 1
- 102000015176 Proton-Translocating ATPases Human genes 0.000 abstract 3
- 108010039518 Proton-Translocating ATPases Proteins 0.000 abstract 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 abstract 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 4
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 3
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710179002 Hemolytic toxin Proteins 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 230000003534 oscillatory effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710097013 Thermolabile hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 244000078673 foodborn pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
本发明属于一种对副溶血性弧菌的致病性进行快速分子分型判断的试剂盒，具体地说是用试剂盒中的F0F1-ATPase分子马达生物传感器Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR对副溶血性弧菌的种特异性基因tlh、toxR和毒力基因tdh、trh进行检测，从而对副溶血性弧菌是否具有致病性做出判断。一方面，对种特异性基因tlh和toxR的检测可以对目标菌进行鉴定；另一方面，对tdh和trh的检测可以对目标菌的致病性做出判断。方法包括试剂盒中F0F1-ATPase分子马达生物传感器的构建、用F0F1-ATPase分子马达生物传感器进行分子分型，最后根据分型结果对副溶血性弧菌的致病性做出判断。其优点在于灵敏度高、快速、操作简单、成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于一种对副溶血性弧菌的致病性进行快速分子分型判断的试剂盒，具体地说是用试剂盒中的F0F1-ATPase分子马达生物传感器Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR对副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的种特异性基因tlh、toxR和毒力基因tdh、trh进行检测，从而对V.parahaemolyticus是否具有致病性做出判断。
背景技术
V.parahaemolyticus是沿海地区常见的一种食源性致病菌，可导致患者腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。近年来，其引发的食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势。因此，V.parahaemolyticus的危害性不容忽视。
尽管大多数的V.parahaemolyticus不会导致人类生病，但仍有一定特征的V.parahaemolyticus可以引起人类的疾病。已有研究表明，致病性的V.parahaemolyticus都能产生一种溶血素，即耐热性溶血毒素（Thermostable direethemolysin,TDH）或TDH相关溶血毒素（TDH related hemolysin,TRH）或两者都有，分别由tdh和trh基因编码。分子流行病学证据支持tdh、trh与肠胃炎的关系，证明tdh、trh都是V.parahaemolyticus的毒力基因。因此，对这两种基因的检测研究对于了解V.parahaemolyticus的流行趋势、预防与治疗食物中毒具有重要意义。另外，不耐热溶血素基因tlh及toxR普遍存在于临床和环境中的V.parahaemolyticus中，很多研究将其作为检测V.parahaemolyticus的种特异性基因。
为了便于进行临床诊断、流行病学调查、食品中微生物检测及医院感染监控，微生物的分型与检测研究是必不可少的内容。目前，随着分子生物学的发展以及与流行病学的密切结合，分子分型技术以其敏感性高、特异性强、分型率和分辨率高等优点，在流行病学调查、食物中毒的预警和溯源、食源性疾病的诊断以及微生物的检测等方面发挥了重要的作用，并逐步替代了传统的生化分型和血清学分型技术，如重复序列PCR（rep-PCR）、随机扩增多态性DNA分析技术（RAPD）、限制性片段长度多态性分析（RFLP）、多位点序列分析（MLST）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）等。然而，上述方法操作起来都比较繁琐，程序比较复杂。因此，在上述分子分型方法的优点基础上，开发一种操作简便、价格低廉的分子分型方法将具有重要意义。
发明内容
本发明以V.parahaemolyticus毒力基因tdh、trh和种特异性基因tlh、toxR为靶基因设计4个探针，通过“ε亚基抗体-链霉素-生物素-探针”系统将探针与F0F1-ATPase分子马达连接构建F0F1-ATPase分子马达生物传感器，进而与相应辅助试剂配套构建分子马达生物传感器分子分型试剂盒，对致病性V.parahaemolyticus进行分型及检测研究，从而建立致病性V.parahaemolyticus的分子马达分子分型方法，为V.parahaemolyticus的快速分型和溯源提供技术基础。
本发明所采用的技术方案为：以V.parahaemolyticus毒力基因tdh、trh和种特异性基因tlh、toxR为靶 基因设计4个探针，首先将生物素标记的ε亚基抗体结合在F0F1-ATPase的ε亚基上，然后用链霉亲和素（Streptavidin）与ε亚基抗体上的生物素结合，最后将生物素标记的探针与链霉亲和素结合，构建F0F1-ATPase分子马达生物传感器，对目标V.parahaemolyticus的DNA进行检测，从而对V.parahaemolyticus的致病性做出快速判断。一方面，对种特异性基因tlh和toxR的检测可以对目标菌进行鉴定；另一方面，对tdh和trh的检测可以对目标菌的致病性做出判断。利用F0F1-ATPase作为载体对目标物进行检测具有快速、灵敏度高、特异性强的特点。在F0F1-ATPase分子马达上连接特异的核酸探针，可以实现对目标基因快速、高特异性、高通量的检测。
本发明涉及的V.parahaemolyticus的分子马达生物传感器分子分型试剂盒，包括以下试剂：
副溶血性弧菌分子分型试剂盒组成
上述试剂盒中Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR等4个分子马生物传感器的构建，依次包括下列步骤：
（1）载色体（Chromatophore）的制备
将Thermomicrobium roseum菌种按比例1:100接种到液体培养基，60℃，150rpm振荡培养24h。然后4℃，4000g离心30min收集菌体。用提取Buffer（20mM Tris-Cl，100mM NaCl，2mM MgCl2，1mM DTT，pH8.0）重悬菌体。4℃，6000g离心10min去上清。加入提取Buffer重悬菌体（10mL Buffer/g），再加入PMSF至终浓度1mM，置于冰上超声破碎30min（超声5s，停8s）。将破碎菌体于4℃，25000g离心30min，取上清于一新的离心管中，4℃145000g超速离心1h，取沉淀即为Chromatophores。最后用提取Buffer重悬沉淀并加入终浓度50%的甘油，﹣80℃保存备用。
（2）F-DHPE标记Chromatophores
取200μL Chromatophores于一离心管中，加入10μL F-DHPE（200mg/mL,溶于乙醇），混匀，室温避光轻微振荡孵育15min。加入PBS（10mM，pH7.4）至总体积1.3mL后，于4℃，30000g离心15min，去上清，沉淀用PBS在4℃，10 000g离心15min条件下清洗3次，以除去游离的F-DHPE。最后沉淀用200μL PBS悬浮，备用。
（3）生物素标记ε亚基抗体
将2μL2μM的生物素（biotin-AC5-Sulfo-Os）加入到20μLε亚基抗体中，室温孵育30min，抗体N端即被标记。
（4）探针合成及标记
以V.parahaemolyticus种特异性基因tlh、tdh和毒力基因trh、toxR为模板设计探针，并用生物素（biotin-AC5-Sulfo-Os）标记探针5’端。探针序列如下表：
V.parahaemolyticus毒力基因及种特异性基因探针序列
（5）F0F1-ATPase分子马达生物传感器的构建
分别吸取200μL F-DHPE标记的Chromatophores于4个离心管中，各加入40μg生物素标记的ε亚基抗体，用PBS补加至1mL，37℃孵育1h；用PBS补加至1.4mL，4℃，30 000g超速离心10min；弃上清，沉淀用500μL PBS重悬；加入链霉亲和素（Streptavidin）（2mg/mL）2μL，用PBS补加至1mL，室温，50～100rpm振荡反应10min；用PBS补加至1.4mL，4℃，30000g超速离心10min，弃上清，沉淀用500μL PBS重悬；最后，每管各加入生物素标记的tlh、tdh、trh、toxR核酸探针（10μM）50μL，用PBS补加至1mL，室温，50～100rpm振荡反应10min；每管用PBS补加至1.4mL，4℃，30000g超速离心10min，弃上清，用150μL含30%甘油的PBS重悬Chromatophores，放入﹣20℃冰箱备用。各分子马达生物传感器分别命名为Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR。分子马达生物传感器模式图见图1。
使用上述试剂盒对V.parahaemolyticus的致病性进行分子分型，依次包括下列步骤（1）—（3）：
（1）细菌的培养及DNA的提取
将V.parahaemolyticus接种到含3%NaCL的APW中增菌，36℃±1℃培养24h。然后划线接种TCBS琼脂，36℃±1℃培养24h。最后挑取可疑菌落转接到3%NaCL的TSA琼脂上，36℃±1℃培养24h，用于DNA的提取。
将培养获得的V.parahaemolyticus用DNA提取试剂盒（商业）进行提取，详细操作步骤见试剂盒说明书。最后获得的离心管中的液体就是菌体的DNA提取液，用作分子马达传感器的目标检测物。
（2）用F0F1-ATPase分子马达生物传感器进行分子分型
①取4个1.5mL EP管，各加入待测样本10μL。将EP管放入沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却；
②分别取2μL Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR，用合成buffer稀释到一定的倍数。取稀释 后的分型装置分别加入上述EP管；
③阴性对照用10μL无菌水代替DNA提取液进行。另取1个EP管加入10μL无菌水，沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却，再加入10μL合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀；
④向上述EP管中分别加入30μL启动buffer（由ADP和上述合成buffer配置，体积比1：3），振荡使反应体系混匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠；
⑤将上述反应体系放入37℃恒温摇床中温育30min，然后将EP管从摇床中取出，分别加入450μLPBS缓冲液，振荡使体系混匀；
⑥取一块干净的96孔板，将各管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50μL，然后对每个加样孔分别加入30μL已配置好的荧光素酶溶液（将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡。使用前应将混合液在室温放置1h），用枪反复吹打几次使体系混匀；
⑦将96孔板上机检测，读取各孔荧光值，对各组数据取平均值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光值；
⑧将样本荧光值绝对值与H2O的阴性对照荧光值绝对值进行单因素方差分析，若差异显著（p＜0.05）表示检出该基因；
（3）分型判断
检出种特异性基因tlh和toxR，可判断该菌为副溶血性弧菌；检出tdh或trh，或者两者都检出，可判断该菌携带毒力基因，具有致病性。
附图说明
图1：F0F1-ATPase分子马达生物传感器模式图（其中a、b、c、α、β、δ、γ、ε均为ATP合酶亚基），1为ε亚基抗体，2为链霉亲和素（Strptavidin），3为N-biotin，4为分子探针（此处为tlh、tdh、trh、toxR探针），5为V.parahaemolyticus单链DNA；
图2：实施例中应用分子马达生物传感器检测10株V.parahaemolyticus分离株所得荧光值柱状图。A，Chro-tlh对10株V.parahaemolyticus的分型结果；B，Chro-toxR对10株V.parahaemolyticus的分型结果；C，Chro-tdh对10株V.parahaemolyticus的分型结果；D，Chro-trh对10株V.parahaemolyticus的分型结果。1-10：10株V.parahaemolyticus。，*表示样本荧光值与阴性对照相比差异显著（p＜0.05）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例
（1）细菌的培养及DNA的提取
10株V.parahaemolyticus为从食品中分离得到。将10株V.parahaemolyticus接种到含3%NaCL的APW中活化增菌，36℃±1℃培养24h。然后划线接种TCBS琼脂，36℃±1℃培养24h。最后挑取可疑菌落转接到3%NaCL的TSA琼脂上，36℃±1℃培养24h，用于DNA的提取。
将培养获得的V.parahaemolyticus用DNA提取试剂盒（离心柱型）DP320进行提取，详细操作步骤见试剂盒说明书。最后获得的离心管中的液体就是菌体的DNA提取液，用作PCR扩增时的模板以及分子马达传感器的目标检测物。该DNA提取液置于冰箱中﹣20℃保存，使用时置于室温自然解冻，然后用振荡器振荡混匀。
（2）用F0F1-ATPase分子马达生物传感器对10株V.parahaemolyticus进行分子分型
①取10个1.5mL EP管，各加入10株V.parahaemolyticus浓度为90ng/mL的DNA提取液10μL。将EP管放入沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却；
②取2μL Chro-tlh，用合成buffer（0.1mM Tricine，10%甘油，5mM NaH2PO4，5mM MgCl2，pH9.0）稀释60倍。取稀释后的生物传感器分别加入上述EP管；
③阴性对照用10μL无菌水代替DNA提取液进行。另取1个EP管加入10μL无菌水，沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却，再加入10μL合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀；
④向上述EP管中分别加入30μL启动buffer，振荡使反应体系混匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠；
⑤将上述反应体系放入37℃恒温摇床中温育30min，然后将EP管从摇床中取出，分别加入450μLPBS缓冲液，振荡使体系混匀；
⑥取一块干净的96孔板，将各管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50μL，然后对每个加样孔分别加入30μL已配置好的荧光素酶溶液（将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡。使用前应将混合液在室温放置1h），用枪反复吹打几次使体系混匀；
⑦将96孔板上机检测，读取各孔荧光值，对各组数据取平均值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光值；
⑧将样本荧光值绝对值与H2O的阴性对照荧光值绝对值进行单因素方差分析，若差异显著（p＜0.05）表示检出该基因；
Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR对10株V.parahaemolyticus的检测同上述步骤。Chro-tdh的最适稀释 倍数为100倍，对应最适DNA浓度为50ng/mL；Chro-trh的最适稀释倍数为60倍，对应最适DNA浓度为50ng/mL；Chro-toxR的最适稀释倍数为50倍，对应最适DNA浓度为60ng/mL。
（3）分型判断
检出种特异性基因tlh和toxR，可判断该菌为副溶血性弧菌；检出tdh或trh，或者两者都检出，可判断该菌携带毒力基因，具有致病性。分型结果见图2。10株V.parahaemolyticus均携带种特异性基因tlh和toxR，均携带tdh毒力基因，但均未携带trh毒力基因。结果与PCR验证结果一致，10株V.parahaemolyticus均具有致病性。
Claims (1)
1.一种基于分子马达生物传感器技术的副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus）分子分型试剂盒，其特征在于包括以下组分：
副溶血性弧菌分子分型试剂盒组成
其中，分子马达生物传感器的构建，包括：
（1）载色体（Chromatophore）的制备：
从玫瑰红嗜热菌（Thermomicrobium roseum）中提取载色体，F0F1-ATPase存在于载色体上；F0F1-ATPase由多个亚基组成，分别为α3β3γδεab2cn，是一种可旋转分子马达；
（2）F-DHPE标记载色体：
F-DHPE是一种脂染料探针，可以嵌入到磷脂分子层中，同时F-DHPE也是一种pH指示剂，将其嵌入磷脂双分子层可以用来测量磷脂层外面的pH变化，在pH7.0-9.0范围内，F-DHPE的荧光强度与pH值呈正相关；将F-DHPE标记到分子马达载色体磷脂分子层中用以指示F0F1-ATPase合成ATP的效率；
（3）生物素标记ε亚基抗体：
用生物素（biotin-AC5-Sulfo-Os）标记ε亚基抗体N端；
（4）探针合成及标记：
以V.parahaemolyticus种特异性基因tlh、tdh和毒力基因trh、toxR为模板设计探针，并用生物素（biotin-AC5-Sulfo-Os）标记探针5’端；一方面，对种特异性基因tlh和toxR的检测可以对目标菌进行鉴定；另一方面，对tdh和trh的检测可以对目标菌的致病性做出判断；探针序列如下表：
V.parahaemolyticus毒力基因及种特异性基因探针序列
（5）F0F1-ATPase分子马达生物传感器的构建：
首先将生物素标记的ε亚基抗体结合在F0F1-ATPase的ε亚基上，然后用链霉亲和素（Streptavidin）与ε亚基抗体上的生物素结合，最后将生物素标记的探针与链霉亲和素结合，高速离心去除未结合分子，即得到F0F1-ATPase分子马达生物传感器，4个分子马达生物传感器分别命名为Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR；
应用其进行分子分型，包括以下步骤：
（1）细菌的培养及DNA的提取
（2）用分子马达生物传感器进行分子分型
①取4个1.5mL EP管，各加入待测样本10μL，将EP管放入沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却；
②分别取2μL Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR，用合成buffer稀释到一定的倍数，取稀释后的生物传感器分别加入上述EP管；
③阴性对照用10μL无菌水代替DNA提取液进行，另取1个EP管加入10μL无菌水，沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却，再加入10μL合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀；
④向上述EP管中分别加入30μL启动buffer，振荡使反应体系混匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠；启动buffer由ADP和上述合成buffer配置，体积比1：3；
⑤将上述反应体系放入37℃恒温摇床中温育30min，然后将EP管从摇床中取出，分别加入450μLPBS缓冲液，振荡使体系混匀；
⑥取一块干净的96孔板，将各管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50μL，然后对每个加样孔分别加入30μL已配置好的荧光素酶溶液，用枪反复吹打几次使体系混匀；荧光素酶溶液配置方法为将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡；使用前将混合液在室温放置1h；
⑦将96孔板上机检测，读取各孔荧光值，对各组数据取平均值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光值；
⑧将样本荧光值绝对值与H2O的阴性对照荧光值绝对值进行单因素方差分析，若p＜0.05表示检出该基因；
（3）分型判断
检出种特异性基因tlh和toxR，可判断该菌为副溶血性弧菌；检出tdh或trh，或者两者都检出，可判 断该菌携带毒力基因，具有致病性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210406083.5A CN102936625B (zh) | 2012-10-23 | 2012-10-23 | 一种用于副溶血性弧菌分子分型的分子马达生物传感器试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210406083.5A CN102936625B (zh) | 2012-10-23 | 2012-10-23 | 一种用于副溶血性弧菌分子分型的分子马达生物传感器试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102936625A CN102936625A (zh) | 2013-02-20 |
| CN102936625B true CN102936625B (zh) | 2014-01-01 |
Family
ID=47695546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210406083.5A Expired - Fee Related CN102936625B (zh) | 2012-10-23 | 2012-10-23 | 一种用于副溶血性弧菌分子分型的分子马达生物传感器试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102936625B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103175816A (zh) * | 2013-03-15 | 2013-06-26 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 一种辅助鉴定辐照含脂食品的方法 |
| CN106591466B (zh) * | 2016-12-29 | 2020-03-31 | 嘉兴市疾病预防控制中心 | 基于实时荧光pcr对副溶血性弧菌的分型方法 |
| CN111724859A (zh) * | 2020-06-16 | 2020-09-29 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 一种基于核心基因组snp分析的副溶血性弧菌溯源方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1789425A (zh) * | 2004-12-16 | 2006-06-21 | 中国科学院生物物理研究所 | 可调控分子马达微动力生物传感器 |
-
2012
- 2012-10-23 CN CN201210406083.5A patent/CN102936625B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1789425A (zh) * | 2004-12-16 | 2006-06-21 | 中国科学院生物物理研究所 | 可调控分子马达微动力生物传感器 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《F0-F1-ATPase分子马达技术对单核细胞增生李斯特菌检测的研究》;张捷 等;《生物技术进展》;20120630;第2卷(第6期);436-440 * |
| 张捷 等.《F0-F1-ATPase分子马达技术对单核细胞增生李斯特菌检测的研究》.《生物技术进展》.2012,第2卷(第6期),436-440. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102936625A (zh) | 2013-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| López-Campos et al. | Detection, identification, and analysis of foodborne pathogens | |
| Gao et al. | Recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick for equipment-free detection of Salmonella in shellfish | |
| CN110195119A (zh) | 一种用于检测金黄色葡萄球菌的试剂盒、引物对、探针和方法 | |
| Arnold et al. | Impact of invA‐PCR and culture detection methods on occurrence and survival of Salmonella in the flesh, internal organs and lymphoid tissues of experimentally infected pigs | |
| CN101434999B (zh) | 水产品中副溶血弧菌的pcr-elisa检测方法 | |
| Yamazaki | Sensitive and rapid detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli using loop-mediated isothermal amplification | |
| CN104263838A (zh) | 单增李斯特菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN106282375A (zh) | 一种鼠伤寒沙门氏菌的lamp引物组及试剂盒与使用方法 | |
| Zeng et al. | A polymerase chain reaction based lateral flow test strip with propidium monoazide for detection of viable Vibrio parahaemolyticus in codfish | |
| CN102936625B (zh) | 一种用于副溶血性弧菌分子分型的分子马达生物传感器试剂盒 | |
| US20220098645A1 (en) | Fast and portable microfluidic detection system as an alternative to salmonella's classical culture method | |
| CN103421896B (zh) | 针对大肠杆菌o157的rna恒温扩增核酸检测试剂盒 | |
| CN104263839A (zh) | 布鲁氏杆菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法 | |
| Zhou et al. | Rapid visual detection of Aeromonas salmonicida by loop‐mediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye | |
| CN103421897B (zh) | 针对志贺氏菌(sh)的rna恒温扩增核酸检测试剂盒 | |
| Caner et al. | The detection of hip O gene by real-time PCR in thermophilic Campylobacter spp. with very weak and negative reaction of hippurate hydrolysis | |
| CN102080125B (zh) | 用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的引物、探针及芯片 | |
| CN111172301A (zh) | 一种艰难梭菌毒素b的pcr荧光检测试剂盒及其应用 | |
| CN102912021B (zh) | 一种用于分子马达生物传感器技术的沙门氏菌分子分型试剂盒 | |
| Huq et al. | Detection, isolation, and identification of Vibrio cholerae from the environment | |
| Yamazaki | Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae using loop-mediated isothermal amplification | |
| RU2542395C1 (ru) | Набор реагентов и способ для выявления днк возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии методом пцр с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов | |
| Le et al. | Validation of the Listeria Right NowTM Test for Detection of Listeria spp. from Selected Environmental Surfaces Without Enrichment | |
| Niu et al. | Development and evaluation of a dot blot assay for rapid determination of invasion-associated gene ibeA directly in fresh bacteria cultures of E. coli | |
| CN100436596C (zh) | 肠出血性大肠杆菌o157核酸检测方法及其检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 100026 Beijing city Chaoyang District tianshuiyuan Street No. 6 Applicant after: BEIJING ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU, P.R. CHINA Applicant after: WEIHAI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU Address before: 100026 Beijing city Chaoyang District tianshuiyuan Street No. 6 Applicant before: Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Applicant before: Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: BEIJING ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU TO: BEIJING OFFICE OF IMPORT AND EXPORT EXAMINATION AND QUARANTINE, PRC |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140101 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |