CN101434999B - 水产品中副溶血弧菌的pcr-elisa检测方法 - Google Patents

Abstract

一种水产品中副溶血弧菌的PCR-ELISA检测方法，是由提取标本DNA、PCR反应、ELISA反应和结果检测四个步骤实现的。本发明通过提供副溶血弧菌tlh、tdh两组特异性的地高辛标记引物、区分两个基因的生物素标记的探针以及用于定量的含有tlh基因特定序列的质粒，进而对水产品中副溶血弧菌进行检测。本发明可在96孔酶标板中进行，所提供的方法成本低廉、特异性好、灵敏度高，适用于对副溶血弧菌进行大规模、高通量的检测。

Description

水产品中副溶血弧菌的PCR-ELISA检测方法

技术领域：

本发明涉及水产品中微生物的安全检测技术，是一种PCR-ELISA检测并定量水产品中副溶血弧菌的方法。

背景技术：

副溶血弧菌是一种重要的食源性致病菌，主要存在于近海岸的海水、海水沉积物和鱼类、贝类等海产品中，能引起急性肠胃炎和原发性败血症。1992年至2001年食源性疾病监测网(包括13个省份)的数据显示，副溶血弧菌引起的疾病暴发率位居微生物性食源性疾病之首。另外副溶血弧菌，也是威胁海水养殖业的主要病原菌之一。

副溶血弧菌可产生多种溶血毒素，有热稳定直接溶血素(Thermostabledirect hemolysin，TDH)、热不稳定溶血素(Thermolabile hemolysin，TLH)和相对热稳定直接溶血素(TDH-relatedhemolysin，TRH)。大量的流行病学研究表明，几乎所有的临床分离株都可产生神奈川现象(KP⁺)，即在特殊的血琼脂培养基上菌落周围有一条溶血环。这种现象是由分离株产生的TDH引起的，因而TDH被认为是该菌的一种主要的毒力因子，tdh基因可用于检测致病性副溶血弧菌。日本科学家Hatsumi等于1985年研究发现无论是临床分离株还是环境分离株都含有tlh基因，而且tlh基因具有种的特异性，可用于副溶血弧菌的定性检测。

目前对副溶血弧菌的检测主要有病原体分离法、普通PCR方法和荧光定量PCR方法。我国副溶血弧菌的检测方法的国家标准GB/T4789.7-2008《食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验》和行业标准SN0173-1992《出口食品副溶血弧菌检验方法》均为病原体分离法，该类标准主要是传统的培养及生化鉴定方法，检测周期约5-7d。此方法检测周期长、工作量大；1999年英国科学家Asim等人建立了一种普通PCR可检测副溶血弧菌的方法，能同时检测副溶血弧菌中的tlh、tdh、trh基因，但这一方法只能的定性检测副溶血弧菌而不能进行定量分析；2003年美国科学家Geroge等人建立了一种荧光定量PCR检测副溶血弧菌tdh基因的方法，该方法检测灵敏度高，检测速度快，可对副溶血弧菌进行定量分析，但该方法需购买昂贵的荧光定量PCR仪，而且检测样品费用高，不能满足实际中大规模检测的要求。随着人们对海洋资源利用的日益关注，以及对食品安全的高度重视，建立一种快速、准确、特异、灵敏的副溶血弧菌检测方法十分必要。

发明内容：

本发明目的是提供一个PCR-ELISA方法检测副溶血弧菌，并鉴定其是否含有致病基因，提高检测副溶血弧菌的速度和灵敏度，克服了定量检测费用较高的缺点，适合水产品中副溶血弧菌高通量检测。

本发明PCR-ELISA检测并定量副溶血弧菌的方法是按以下实施步骤完成的：包括：1、DNA模板的制备；2、PCR反应；3、特异探针进行ELISA反应；4、结果的检测。

1、DNA模板的制备：

a、待测标本无菌操作。贝类取含内脏的全部贝肉、鱼类取鱼体不同部位、甲壳类取包括鳃及肠的部分或整体。称取待测标本25g，加入3.5％无菌NaCl溶液225mL，均质后，取10mL加入90mL改进碱性蛋白胨水(MAPW，将APW中NaCl浓度调至3.5％)中。置于37℃恒温培养箱，120r/min增菌培养7h。

b、取1.0mL增菌后的细菌培养物，置于1.5mL离心管中，12000r/min离心5min，弃去上清液；加入100μL无菌水，漩涡混匀，100℃水浴10min，立即冰浴2min；12000r/min离心5min，取上清。

2、PCR反应：

a、配制30μL反应体系：包括PCR Buffer(含有200mM pH 8.4 Tris-HCl；200mM KCl；100mM硫酸铵；15mM MgCl₂)3μL、2.5mM dNTP 2.5μL、地高辛标记的正向引物TLH-F(10μM)1.5μL、地高辛标记的正向引物TDH-F(10μM)1.5μL、反向引物TLH-R(10μM)1.5μL、反向引物(10μM)TDH-R1.5μL、Taq酶0.5μL、DNA模板1μL(其中标准品加1μL作为DNA模板，阴性对照加超纯水1μL，样品取上述制备的DNA作为模板)、加超纯水补足30μL。其中两对引物的靶基因分别为副溶血弧菌的tlh基因(GenBank登陆号：AY289609.1)和副溶血弧菌的tdh基因(GenBank登陆号：AY044113.1)，其中上游引物的5′端均用地高辛标记，引物序列分别为：

TLH-F：5′-AAAGCAGATTATGCAGAAGCACTG-3′，

TLH-R：5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′，

TDH-F：5′-CTTCCATCTGTCCCTTTTCCT-3′，

TDH-R：5′-ATAGAACCTTCATCTTCACCA-3′。

b、混匀反应体系，PCR反应程序如下：94℃预变性10min；进入循环，94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸40s，共25个循环；循环结束后72℃延伸10min，冷却至4℃备用。

3、特异探针进行ELISA反应：

a、在96孔酶标板中每孔加200μL终浓度为1mg/L的链亲和素溶液，4℃过夜。取出后弃去孔中的液体，每孔加200μL PBS缓冲液(pH 7.4)，洗涤4次，每次都甩干。

b、取PCR反应产物5μL于2个新的离心管中，一管加入5μL生物素标记的探针TLH-probe(10μM)，另一管加入5μL生物素标记的探针TDH-probe(10μM)，混合均匀。放入PCR仪中，94℃变性10min，56℃退火7min，各管中迅速加入200μL PBS缓冲液(pH 7.4)。其中两条探针5′端均用生物素标记，能与PCR产物的特定区域互补结合，序列分别为：

TLH-probe：5′-TAGCGGTGAGTTGCTGTTGTTGGATGCGT-3′，

TDH-probe：5′-GAATGTTGAAGTTGTACTTGACCT-3′。

c、取200μL上述反应液加入到包被好的96孔酶标板中，37℃温浴30min，用PBST溶液(含有0.1％Tween-20的PBS缓冲液)洗涤4次，每次都甩干。

d、每孔加入200μL Anti-Dignxigenin-AP，Fab fragments(用PBS缓冲液1∶5000稀释)，37℃温浴1h，用PBST溶液洗涤4次，每次都甩干。

e、每孔中加入200μL显色底物溶液(0.1M二乙醇胺缓冲液中含有1mMMgCl₂和10mM pNPP)，37℃温浴30min。

4结果检测：

a、定性检测：可用肉眼观察，与阴性对照孔进行比较，tlh基因或tdh基因阳性的孔中显黄色，而阴性应与阴性对照一致；或用酶标仪检测，用显色底物溶液调零，在405nm处测定各孔的吸光值。OD₄₀₅大于等于0.1为阳性，小于0.1为阴性。

b、定量检测：用酶标仪测得标准品和检测样品的OD值，根据已知标准品的不同浓度和这些标准品经过PCR-ELISA方法后测得的OD值绘制标准曲线。将阳性样品检测的OD值，代入标准曲线公式计算。所述的载体标准品，载体大小3142bp，载体中包括GeneBank登陆号为AY289609.1 tlh基因位点781到位点1230之间的450bp的一段序列，其中该标准品含有tlh的基因序列为：

5′-AAAGCAGATTATGCAGAAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATGTTGATGACACTGCCAGACGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTACTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTGAGATGAACGAGTTCATCAAGGCTCAAGCGATGTACTACAAAGCGCAAGGTTACGACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGAGACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCGAGCGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGACTACATGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCGGCGTCTGGTGCTGAGAAGTTTGTGTTCTGGGATGTCACGCACCCAACAACAGCAACTCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGC-3′。

本发明所建立的检测方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、不需要荧光定量PCR设备、使用范围广的优点。与常规PCR相比，解决了其无法定量的缺点，加入了ELISA过程，利于消减常规PCR的假阳性现象，而且不需要对产物进行电泳、避免使用溴化乙啶等毒性物质；与荧光定量PCR相比，避免了使用荧光定量PCR仪这种高端仪器，只需用普通酶标分析仪即可，检测中所用的耗材成本也较荧光定量PCR便宜，而且保证了较高的特异性和灵敏度等优点。本发明可在96孔酶标板中进行，成本低廉，适用于对副溶血弧菌进行大规模、高通量的检测。

附图说明：

图1：为PCR-ELISA方法鉴定副溶血弧菌的目测结果。第1列为污染了菌株BJ 1.1997的样品；第2列为污染了菌株ATCC1615的样品；第3列为污染了菌株ATCC1616的样品；第4列至第7列依次为污染了大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、溶藻弧菌的样品；第8列为阴性对照。可明显看出副溶血弧菌菌株BJ 1.1997含有tlh基因，副溶血弧菌菌株ATCC1615和ATCC1616含有tlh和tdh两基因，而其他非副溶血弧菌菌株均无显色反应。

图2：为PCR-ELISA方法以10⁷-10³copies/μL浓度的标准品和在405nm测得的OD值绘制的标准曲线。

具体实施方式：

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述。

实施例1：

人工污染了副溶血弧菌标准菌(BJ1997、ATCC1615、ATCC1616)和对照菌(溶藻弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌)牡蛎样品的检测。

1、DNA模板的制备：

a、待测标本无菌操作。牡蛎样品取含内脏的全部贝肉、称取待测标本25g，加入3.5％无菌NaCl溶液225mL，均质后，取10mL加入90mL改进碱性蛋白胨水(MAPW，将APW中NaCl浓度调至3.5％)中。置于37℃恒温培养箱，120r/min增菌培养7h。

b、取1.0mL增菌后的细菌培养物，置于1.5mL离心管中，12000r/min离心5min，弃去上清液；加入100μL无菌水，漩涡混匀，100℃水浴10min，立即冰浴2min；12000r/min离心5min，取上清。

2、PCR反应：

a、配制30μL反应体系：包括PCR Buffer(含有200mM pH 8.4 Tris-HCl；200mM KCl；100mM硫酸铵；15mM MgCl₂)3μL、2.5mM dNTP 2.5μL、地高辛标记的正向引物TLH-F(10μM)1.5μL、地高辛标记的正向引物TDH-F(10μM)1.5μL、反向引物TLH-R(10μM)1.5μL、反向引物(10μM)TDH-R1.5μL、Taq酶0.5μL、DNA模板1μL(其中标准品加1μL作为DNA模板，阴性对照加超纯水1μL，样品取上述制备的DNA作为模板)、加超纯水补足30μL。其中上游引物的5′端均用地高辛标记，引物序列分别为：

TLH-F：5′-AAAGCAGATTATGCAGAAGCACTG-3′，

TLH-R：5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′，

TDH-F：5′-CTTCCATCTGTCCCTTTTCCT-3′，

TDH-R：5′-ATAGAACCTTCATCTTCACCA-3′。

b、混匀反应体系，PCR反应程序如下：94℃预变性10min；进入循环，94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸40s，共25个循环；循环结束后72℃延伸10min，冷却至4℃备用。

3、探针进行ELISA反应：

a、在96孔酶标板中每孔加200μL终浓度为1mg/L的链亲和素溶液，4℃过夜。取出后弃去孔中的液体，每孔加200μL PBS缓冲液(pH 7.4)，洗涤4次，甩干。

b、取PCR反应产物5μL于两个新的离心管中，一管加入5μL生物素标记的探针，TLH-probe(10μM)，另一管加入5μL生物素标记的探针TDH-probe(10μM)，混合均匀。放入PCR仪中，94℃变性10min，56℃退火7min，各管中迅速加入200μL PBS缓冲液(pH 7.4)。其中两条探针5′端均用生物素标记，能与PCR产物的特定区域互补结合，序列分别为：

TLH-probe：5′-TAGCGGTGAGTTGCTGTTGTTGGATGCGT-3′，

TDH-probe：5′-GAATGTTGAAGTTGTACTTGACCT-3′。

c、取200μL上述反应液加入到包被好的96孔酶标板中，37℃温浴30min，用PBST，溶液(含有0.1％Tween-20的PBS缓冲液)洗涤4次，甩干。

d、每孔加入200μL Anti-Dignxigenin-AP，Fab fragments(用PBS缓冲液1∶5000稀释)，37℃温浴1h，用PBST溶液洗涤4次，甩干。

e、每孔中加入200μL显色底物溶液(0.1M二乙醇胺缓冲液中含有1mMMgCl₂和10mM pNPP)，37℃温浴30min。

4、结果的检测：

a、定性检测，用肉眼将样品与阴性对照孔比较(参见图1)。从图中可看出1-3号样品的tlh基因检测孔与阴性对照相比呈明显的黄色，检测结果为阳性，显示1-3号污染了副溶血弧菌；2-3号样品tdh基因检测孔与阴性对照相比呈明显的黄色，检测结果为阳性，显示2-3号样品的副溶血弧菌含有致病基因；1号样品tdh基因检测孔与阴性对照相比无明显差异，检测结果为阴性，显示1号样品的副溶血弧菌不含有致病基因；4-7号样品的tlh基因和tdh基因检测孔与阴性对照相比无明显差异，检测结果为阴性，显示4-7号样品没有污染副溶血弧菌。使用酶标仪检测进一步检测，用显色底物溶液调零，在405nm处测定各孔的吸光值，OD₄₀₅大于等于0.1为阳性，小于0.1为阴性。检测结果同目测结果相一致。具体检测结果如下表一：

表一(表中序号于图1中编号一致)

b、定量检测：用酶标仪测得标准品和检测样品的OD值，根据已知标准品的不同浓度和这些标准品经过PCR-ELISA方法后测得的OD值绘制标准曲线(参见图2)。将阳性样品(1-3号样品)检测的OD值，代入标准曲线公式计算，可得出污染样品中副溶血弧菌的含量。所述的载体标准品，载体大小3142bp，载体中包括GeneBank登陆号为AY289609.1 tlh基因位点781到位点1230之间的450bp的一段序列，其中该标准品含有tlh的基因序列为：

5′-AAAGCAGATTATGCAGAAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATGTTGATGACACTGCCAGACGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTACTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTGAGATGAACGAGTTCATCAAGGCTCAAGCGATGTACTACAAAGCGCAAGGTTACGACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGAGACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCGAGCGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGACTACATGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCGGCGTCTGGTGCTGAGAAGTTTGTGTTCTGGGATGTCACGCACCCAACAACAGCAACTCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGC-3′。

实施例2：

水产样品中副溶血弧菌的定量检测：

1、DNA模板的制备：

a、待测标本无菌操作。贝类取含内脏的全部贝肉、鱼类取鱼体不同部位、甲壳类取包括鳃及肠的部分或整体。称取待测标本25g，加入3.5％无菌NaCl溶液225mL，均质后，取10mL加入90mL改进碱性蛋白胨水(MAPW，将APW中NaCl浓度调至3.5％)中。置于37℃恒温培养箱，120r/min增菌培养7h。

b、取1.0mL增菌后的细菌培养物，置于1.5mL离心管中，12000r/min离心5min，弃去上清液；加入100μL无菌水，漩涡混匀，100℃水浴10min，立即冰浴2min；12000r/min离心5min，取上清。

2、PCR反应：

a、配制30μL反应体系：包括PCR Buffer(含有200mM pH 8.4T ris-HCl；200mM KCl；100mM硫酸铵；15mM MgCl₂)3μL、2.5mM dNTP 2.5μL、地高辛标记的正向引物TLH-F(10μM)1.5μL、反向引物TLH-R(10μM)1.5μL、Taq酶0.5μL、DNA模板1μL(其中标准品加1μL作为DNA模板，阴性对照加超纯水1μL，样品取上述制备的DNA作为模板)、加超纯水补足30μL。其中上游引物的5′端均用地高辛标记，引物序列分别为：

TLH-F：5′-AAAGCAGATTATGCAGAAGCACTG-3′，

TLH-R：5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′，

TDH-F：5′-CTTCCATCTGTCCCTTTTCCT-3′，

TDH-R：5′-ATAGAACCTTCATCTTCACCA-3′。

b、混匀反应体系，PCR反应程序如下：94℃预变性10min；进入循环，94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸40s，共25个循环；循环结束后72℃延伸10min，冷却至4℃备用。

3、探针进行ELISA反应：

a、在96孔酶标板中每孔加200μL终浓度为1mg/L的链亲和素溶液，4℃过夜。取出后弃去孔中的液体，每孔加200μL PBS缓冲液(pH 7.4)，洗涤4次，每次都甩干。

b、取PCR反应产物5μL于1个新的离心管中，加入5μL生物素标记的探针TLH-probe(10μM)，混合均匀。放入PCR仪中，94℃变性10min，56℃退火7min，各管中迅速加入200μL PBS缓冲液(pH 7.4)。其中两条探针5′端均用生物素标记，能与PCR产物的特定区域互补结合，序列分别为：

TLH-probe：5′-TAGCGGTGAGTTGCTGTTGTTGGATGCGT-3′，

TDH-probe：5′-GAATGTTGAAGTTGTACTTGACCT-3′。

c、取200μL上述反应液加入到包被好的96孔酶标板中，37℃温浴30min，用PBST溶液(含有0.1％Tween-20的PBS缓冲液)洗涤4次，每次都甩干。

d、每孔加入200μL Anti-Dignxigenin-AP，Fab fragments(用PBS缓冲液1∶5000稀释)，37℃温浴1h，用PBST溶液洗涤4次，每次都甩干。

e、每孔中加入200μL显色底物溶液(0.1M二乙醇胺缓冲液中含有1mMMgCl₂和10mM pNPP)，37℃温浴30min。

4、结果的检测：

a、定性检测：可用肉眼观察，与阴性对照孔进行比较，tlh基因或tdh基因阳性的孔中显黄色；或用酶标仪检测，用显色底物溶液调零，在405nm处测定各孔的吸光值。OD₄₀₅大于等于0.1为阳性，小于0.1为阴性。

b、定量检测：

用酶标仪测得标准品和检测样品的OD值，根据已知标准品的不同浓度和这些标准品经过PCR-ELISA方法后测得的OD值绘制标准曲线。将阳性样品检测的OD值，代入标准曲线公式计算。所述的载体标准品，载体大小3142bp，载体中包括GeneBank登陆号为AY289609.1 tlh基因位点781到位点1230之间的450bp的一段序列，其中该标准品含有tlh的基因序列为：

5′-AAAGCAGATTATGCAGAAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATGTTGATGACACTGCCAGACGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTACTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTGAGATGAACGAGTTCATCAAGGCTCAAGCGATGTACTACAAAGCGCAAGGTTACGACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGAGACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCGAGCGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGACTACATGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCGGCGTCTGGTGCTGAGAAGTTTGTGTTCTGGGATGTCACGCACCCAACAACAGCAACTCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGC-3′。

Claims (1)

1.一种水产品中副溶血弧菌的PCR-ELISA检测方法，包括DNA模板的制备、PCR反应、特异探针进行ELISA反应和结果的检测，其特征在于：

(1)、DNA模板的制备：

a、待测标本无菌操作：贝类取含内脏的全部贝肉、鱼类取鱼体不同部位、甲壳类取包括鳃及肠的部分或整体；称取待测标本25g，加入3.5％无菌NaCl溶液225mL，均质后，取10mL加入90mLNaCl浓度3.5％的改进碱性蛋白胨水中，置于37℃恒温培养箱，120r/min增菌培养7h；

b、取1.0mL增菌后的细菌培养物，置于1.5mL离心管中，12000r/min离心5min，弃去上清液，加入100μL无菌水，漩涡混匀，100℃水浴10min，立即冰浴2min，12000r/min离心5min，取上清；

(2)、PCR反应：

a、配制30μL反应体系：包括PCR Buffer3μL其中含有200mM pH 8.4Tris-HCl、200mM KCl、100mM硫酸铵和15mM MgCl₂，2.5mM dNTP 2.5μL，5’端用地高辛标记了的tlh基因正向引物TLH-F浓度10μM 1.5μL，5’端用地高辛标记了的tdh基因正向引物TDH-F浓度10μM 1.5μL，tlh基因反向引物TLH-R浓度10μM 1.5μL，tdh基因反向引物TDH-R浓度10μM 1.5μL，Taq酶0.5μL，DNA模板1μL，加超纯水补足30μL，其中TLH-F和TLH-R的靶基因为副溶血弧菌的tlh基因，TDH-F和TDH-R的靶基因为副溶血弧菌的tdh基因，四条引物的序列如下：

TLH-F：5′-AAAGCAGATTATGCAGAAGCACTG-3′；

TLH-R：5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′；

TDH-F：5′-CTTCCATCTGTCCCTTTTCCT-3′；

TDH-R：5′-ATAGAACCTTCATCTTCACCA-3′；

b、混匀反应体系，PCR反应程序如下：94℃预变性10min；进入循环，94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸40s，共25个循环；循环结束后72℃延伸10min，冷却至4℃备用；

(3)、特异探针进行ELISA反应；

a、在96孔酶标板中每孔加200μL终浓度为1mg/L的链亲和素溶液，4℃过夜，取出后弃去孔中的液体，每孔加200μL pH 7.4的PBS缓冲液，洗涤4次，每次都甩干；

b、取PCR反应产物5μL于2个新的离心管中，一管加入5μL浓度10μM5’端用生物素标记了的tlh基因探针TLH-probe，另一管加入5μL浓度10μM5’端用生物素标记了的tdh基因探针TDH-probe，混合均匀，放入PCR仪中，94℃变性10min，56℃退火7min，各管中迅速加入200μL pH 7.4的PBS缓冲液；其中TLH-probe的靶基因为副溶血弧菌的tlh基因，TDH-probe的靶基因为副溶血弧菌tdh基因，两条探针的序列如下：

TLH-probe：5′-TAGCGGTGAGTTGCTGTTGTTGGATGCGT-3′；

TDH-probe：5′-GAATGTTGAAGTTGTACTTGACCT-3′：

c、取200μL上述反应液加入到包被好的96孔酶标板中，37℃温浴30min，用PBST溶液洗涤4次，每次都甩干，其中PBST溶液为含有0.1％Tween-20的PBS缓冲液；

d、每孔加入已用PBS缓冲液1∶5000稀释的200μLAnti-Dignxigenin-AP，Fab fragments，37℃温浴1h，用PBST溶液洗涤4次，每次都甩干；

e、每孔中加入200μL显色底物溶液，37℃温浴30min，其中显色底物溶液为0.1M二乙醇胺缓冲液、1mM MgCl₂和10mM pNPP；

(4)、结果的检测：

a、定性检测：可用肉眼观察，与阴性对照孔进行比较，tlh基因或tdh基因阳性的孔中显黄色，而阴性应与阴性对照一致；或用酶标仪检测，用显色底物溶液调零，在405nm处测定各孔的吸光值，OD₄₀₅大于等于0.1为阳性，小于0.1为阴性；

b、定量检测：用酶标仪测得标准品和检测样品的OD值，根据已知标准品的不同浓度和这些标准品经过PCR-ELISA方法后测得的OD值绘制标准曲线，将阳性样品检测的OD值，代入标准曲线公式计算；

所述的标准品为载体，载体大小3142bp，载体中包括GeneBank登陆号为AY289609.1的tlh基因位点781到位点1230之间的450bp的一段序列，其中该标准品含有tlh的基因序列为：

5′-AAAGCAGATTATGCAGAAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATGTTGATGACACTGCCAGACGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTACTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTGAGATGAACGAGTTCATCAAGGCTCAAGCGATGTACTACAAAGCGCAAGGTTACGACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGAGACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCGAGCGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGACTACATGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCGGCGTCTGGTGCTGAGAAGTTTGTGTTCTGGGATGTCACGCACCCAACAACAGCAACTCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGC-3′。

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