CN1526825A - 一种快速检测副溶血弧菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速检测病原菌副溶血弧菌的方法。由弧菌属细菌引起的弧菌病(Vibriosis)对海水经济养殖动物的危害最大，是海水经济养殖动物最主要的细菌性疾病。副溶血弧菌是养殖石斑鱼、尖吻鲈、真鲷、高体鰤等鱼类的主要病原菌，传统的病原菌鉴定费时费力，近年国外已开始研究用核酸探针和PCR手段检测病原弧菌。本发明利用副溶血弧菌pR72H序列的特异性，通过DNA取样、双重PCR扩增、电泳观察等现代分子生物学手段，研制特异性高、重复性好且易于操作的病原菌副溶血弧菌快速检测方法。

Description

一种快速检测副溶血弧菌的方法
技术领域
本发明涉及一种快速检测病原菌副溶血弧菌的方法。
背景技术
由弧菌属细菌引起的弧菌病(Vibriosis)对海水经济养殖动物的危害最大，是海水经济养殖动物最主要的细菌性疾病。副溶血弧菌是养殖石斑鱼、尖吻鲈、真鲷、高体鰤等鱼类的主要病原菌，其暴发性流行已造成灾难性损失，使海水鱼类的存活率只有正常的40％，有的甚至全部死亡。为预防和控制疾病的暴发性流行，疫情的预报和疾病的诊断是关键，而其中对病原菌的快速而又准确的鉴定尤为关键。传统的病原菌鉴定费时费力，给病害的准确预报和有效控制带来很大困难，所以弧菌病原的诊断迫切需要研制出特异性高、快速准确、操作简易且经济节约的诊断工具。近年国外已开始研究用核酸探针和PCR手段检测病原弧菌。Rehnstam等首先利用16SrRNA的部分序列和寡核苷酸探针检测鳗弧菌；Javier Martinez-Picado等根据鳗弧菌的16SrRNA可变区V3的序列，设计了一个与鳗弧菌特异杂交的24个碱基的DNA寡核苷酸片段，此片段经同位素标记作为特异检测鳗弧菌的核酸探针，它与其它病原弧菌及水环境中的其它弧菌无交叉反应。但尚未见利用pR72H序列及双重PCR技术快速检测病原菌副溶血弧菌的方法。本发明的目的在于提供一种快速检测病原菌副溶血弧菌的方法。
发明内容
本发明所述的快速检测病原菌副溶血弧菌的方法，是利用副溶血弧菌pR72H序列的特异性，通过DNA取样、双重PCR扩增、电泳观察等现代分子生物学手段，研制特异性高、重复性好且易于操作的病原菌副溶血弧菌检测方法。基于副溶血弧菌pR72H序列的特异性而设计引物，目的片段大小为387bp，序列如下：
HdB1：5’-TGCGAATTCGATAGGGTGTTAACC；
HdB2：5’-CGAATCCTTGAACATACGCAGC
阳性对照大小为211bp，序列如下：
HdX1：5’-GCAACGAGCGCAACCCTTATC
HdX2：5’-CCAATGGACTACGACGCACTTTTT
采用双重PCR技术，具体步骤如下：
预变性：  92℃    1min
变性：    92℃    30s
复性：    55℃    30s
延伸：    72℃    30s
重复30个循环，72℃延伸10min。
该方法的具体步骤包括：
1、细菌DNA抽提
1)取1.5ml菌液于1.5ml微离心管中，10000rpm，1min，去上清。
2)加入567μl TE缓冲液，反复吹打使之重悬；加入30μl 10％(w/v)SDS溶液，混匀；加入3μl 20mg/ml蛋白酶K，玻棒温和地混匀，置于培养箱，37℃，1h裂解。
3)加入100μl 5mol/L NaCl，充分混匀，加入80μl CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃10min。
4)加入等体积氯仿/异戊醇，12000rpm，5min，移上清。
5)加入等量酚∶氯仿∶戊醇(25∶24∶1)，充分混匀混合液，呈乳浊液。
6)室温12000rpm离心5min，若有机相与水相不能充分分开，延长时间重新离心。
7)吸取上层水相于另一离心管中。
8)加入0.6体积醇，轻轻混合直到DNA沉淀，沉淀移至1ml 70％乙醇中洗涤，12000rpm，2min，弃上清。
9)室温下晾干，尽量除去乙醇，但不可使DNA过于干燥；DNA沉淀悬浮于100μl TE(pH 8.0)缓冲液中；-20℃贮存。
2，PCR扩增，电泳观察
1)，引物
目的片段：387bp
HdB1：5’-TGCGAATTCGATAGGGTGTTAACC
HdB2：5’-CGAATCCTTGAACATACGCAGC
阳性对照：211bp
HdX1：5’-GCAACGAGCGCAACCCTTATC
HdX2：5’-CCAATGGACTACGACGCACTTTTT
2)，反应体系(25μ1)
10×buffer                        2.5μl
4m mol/L dNTP混合液(PH 8.0)       1.25μl
25m mol/L MgCl2                 1.5μl
primer1 15pm/ul                   0.7μl
primer2 15pm/ul                   0.7μl
5U/μl Taq DNA聚合酶              0.2μl
H2O(双蒸)                       13.15μl
模板DNA                           5μl
3)，PCR
预变性    92℃    1min
变性：    92℃    30s
复性      55℃    30s
延伸      72℃    30s
重复30个循环；72℃延伸10min
4)，电泳

Claims (2)

1、一种快速检测病原菌副溶血弧菌的方法，其特征在于是利用副溶血弧菌pR72H序列的特异性，、双重PCR扩增、分子生物学手段，副溶血弧菌pR72H序列的特异性而设计引物，目的片段大小为387bp，序列如下：
HdB1：5’-TGCGAATTCGATAGGGTGTTAACC；
HdB2：5’-CGAATCCTTGAACATACGCAGC
阳性对照大小为211bp，序列如下：
HdX1：5’-GCAACGAGCGCAACCCTTATC
HdX2：5’-CCAATGGACTACGACGCACTTTTT
采用双重PCR技术，具体步骤如下：
预变性：  92℃    1min
变性：    92℃    30s
复性：    55℃    30s
延伸：    72℃    30s
重复30个循环，72℃延伸10min。
2、根据权利要求1中所述的快速检测病原菌副溶血弧菌的方法，其特征在于该方法的步骤包括如下：
A，细菌DNA抽提
1)取1.5ml菌液于1.5ml微离心管中，10000rpm，1min，去上清。
2)加入567μl TE缓冲液，反复吹打使之重悬；加入30μl 10％(w/v)SDS溶液，混匀；加入3μl 20mg/ml蛋白酶K，玻棒温和地混匀，置于培养箱，37℃，1h裂解；
3)加入100μ1 5mol/L NaCl，充分混匀，加入80μl CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃10min；
4)加入等体积氯仿/异戊醇，12000rpm，5min，移上清；
5)加入等量酚∶氯仿∶戊醇(25∶24∶1)，充分混匀混合液，呈乳浊液；
6)室温12000rpm离心5min，若有机相与水相不能充分分开，延长时间重新离心；
7)吸取上层水相于另一离心管中；
8)加入0.6体积醇，轻轻混合直到DNA沉淀，沉淀移至1ml 70％乙醇中洗涤，12000rpm，2min，弃上清；
9)室温下晾干，尽量除去乙醇，但不可使DNA过于干燥；DNA沉淀悬浮于100μl TE(pH8.0)缓冲液中；-20℃贮存；
B，PCR扩增，电泳观察
1)，引物
目的片段：387bp
HdB1：5’-TGCGAATTCGATAGGGTGTTAACC
HdB2：5’-CGAATCCTTGAACATACGCAGC
阳性对照：211bp
HdX1：5’-GCAACGAGCGCAACCCTTATC
HdX2：5’-CCAATGGACTACGACGCACTTTTT
2)，反应体系(25μl)
10×buffer                     2.5μl
4m mol/L dNTP混合液(PH8.0)     1.25μl
25m mol/L MgCl2              1.5μl
primerl 15pm/ul                0.7μl
primer2 15pm/ul                0.7μl
5U/μl Taq DNA聚合酶           0.2μl
H2O(双蒸)                    13.15μl
模板DNA                        5μl
3)，PCR
预变性    92℃    1min
变性：    92℃    30s
复性      55℃    30s
延伸      72℃    30s
重复30个循环；72℃延伸10min
4)，电泳。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101140243B (zh) * 2007-09-29 2010-04-14 上海水产大学 一种用于检测副溶血弧菌的方法
CN101434999B (zh) * 2008-12-10 2011-08-10 中国水产科学研究院黄海水产研究所 水产品中副溶血弧菌的pcr-elisa检测方法
CN107475428A (zh) * 2017-09-27 2017-12-15 河南科技大学第附属医院 一种临床标本中病原菌基因鉴定前处理方法
CN112646901A (zh) * 2020-12-24 2021-04-13 山西医科大学 一种食品病原菌副溶血弧菌快速检测的试剂盒及方法

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CN107475428B (zh) * 2017-09-27 2021-05-28 河南科技大学第一附属医院 一种临床标本中病原菌基因鉴定前处理方法
CN112646901A (zh) * 2020-12-24 2021-04-13 山西医科大学 一种食品病原菌副溶血弧菌快速检测的试剂盒及方法

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