CN1814788A - 水体中常见食源性致病菌多重pcr快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，包括10×PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、引物、Hot star Taq酶。其检测方法包括：提取待测样品模板；在PCR薄壁管中加入10×PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、引物、Hot star Taq酶、待测样品模板和DEPC水，混匀后置PCR仪上扩增；在电泳设备中电泳扩增产物，最后进行结果分析判断。本发明克服了现有传统检测技术中的不足之处，对水体中存在的常见致病菌可以进行全面、系统、准确的检测与鉴定，而且具有检测周期短、速度快、可操作性强、灵敏度高达10～100cfu/sample的特点。
Description
[所属技术领域]
本发明涉及常见食源性致病菌的检测方法及水体中多种致病菌基因的同步检测多重PCR技术，特别涉及一种可用于同时检测沙门氏菌(Salmonellasp.)、志贺氏菌(Shigella sp.)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、肠出血型大肠杆菌0157(Eterohaemorrhagic 0157)和副溶血弧菌(Vibriorahaemolyticus)等五种致病菌的PCR检测试剂盒及利用该试剂盒检测这五种常见食源性致病菌的技术方法，属于生物技术领域。
[背景技术]
食源性致病菌是指以食物为载体，导致人类发生疾病的一大类细菌。近年来，全球食品安全事件频频发生，如美国的“李斯特氏杆菌事件”、日本的“大肠杆菌0157流行事件”等，对人类健康带来很大危害，引起各国政府的全力关注。传统的检测方法(如分离培养、生化鉴定等)无法对难培养或不可培养的致病菌进行检测，而且特异性不高、灵敏度低、操作烦琐耗时，不能实现有效的监测、预防作用。因此，发展新的快速检测与鉴定食源性致病菌的方法是及时有效地控制和预防致病菌传播的前提。已经有许多新方法用于检测水体中的致病菌，如免疫学方法、基因诊断(基因探针、PCR)等，其中以PCR(聚合酶链式反应)法的灵敏度最高，如果能严格控制实验环境与条件，克服假阳性，PCR将被广泛使用。PCR是一种由引物介导的特异性体外酶促DNA扩增技术，其基本原理是：将待扩增的模板DNA加热变性、解链，由人工合成的2条特异序列的寡聚核酸引物与2条DNA链特异结合并复性，在适宜的温度条件下，Taq DNA聚合酶催化dNTP沿着5’-3’方向合成互补的两条新链，不断重复上述过程，使得每循环一次DNA片断扩增一倍，经过30-40个循环，扩增达百万倍，产物就可在电泳凝胶中清晰观察到。然而，现有的PCR方法每次扩增只针对一种致病菌，如果有一份水样，要检测是否含有上述致病菌中的一种或多种，则需要分别进行多次PCR反应，因而费时费力，耗费药品试剂多，检测成本高。
针对以上不足，多重PCR方法可在同一反应体系中加入一对以上的特异的引物对，如果存在与各引物对特异互补的模板，则可同时在同一反应管中扩增出一条以上的目的DNA片断。作为各种生命遗传物质的核酸序列是完全不同和高度保守的，其特异性决定了各物种的特殊性，在各生物体基因组中存在20-30个连续的互补或相同碱基的概率的可能性几乎不存在，同时DNA聚合酶具有极高的复制活性，所以多重PCR反应体系中各引物交叉结合而非特异性扩增的可能十分小，这样就能保证多重PCR的特异性和敏感性。多重PCR不但可同时扩增几条目的基因，而且也节省了试剂，减少了污染的机会。自从1988年Chamberlain首先报道采用多重PCR诊断DMD(异基因脐带血干细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症)以来，已被广泛地应用于基因组结构与功能基因、数量性状基因座的定位和致病菌的检测中。
[发明内容]
本发明的目的针对传统检测方法的不足，建立了一套能够同时检测水体中沙门氏菌(Salmonella sp.)、志贺氏菌(Shigella sp.)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、肠出血型大肠杆菌0157(Eterohaemorrhagic0157)和副溶血弧菌(Vibrio rahaemolyticus)等五种常见水体致病菌的多重PCR检测技术，并构建了相应的多重PCR检测试剂盒，为快速检测与鉴定水体中常见致病菌提供了有效的手段。
该PCR试剂盒配置方法简便，易于产业化生产，检测灵敏度高、周期短、速度快、可操作性强、其检测灵敏度达10～100cfu/sample，对水体中存在的常见致病菌可以进行全面、系统、准确的检测与鉴定。而且检测成本相对较低，可以推广应用于环境监测、食品卫生监督、商品检验检疫等领域，并能为其它不同食源性致病菌检测组合提供技术模式。
本发明根据水体中沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血型大肠杆菌0157和副溶血弧菌等五种常见水体致病菌特异性及毒力靶基因设计五对引物，分别为：副溶血弧菌特异性区段(16s-23s rDNA)基因、侵袭性质粒抗原H(ipaH)、侵袭性质粒抗原B(ipaB)、细菌毒力溶血素基因(hlyA)和表达于所有绿脓杆菌中的一种脂蛋白基因oprL。根据Oligo4.0和Primer3.0软件程序对各对引物进行设计和理论分析，各引物针对相应致病菌高度保守基因或者毒力相关基因设计。引物的退火温度为57℃～63℃，引物两两之间无三对碱基以上之互补，PCR产物两两长度之差大于30-50bp，大小相近又能够通过电泳分开(见表1)。
表1五对引物及PCR扩增产物大小
| Bacteria | Targetgene | Sequence of primers | Product(bp) |
| Shigella sp. | IpaH | IpaH-F-CCTTGACCGCCTTTCCGATACIpaH-R-CAGCCACCCTCTGAGAGTACTC | 611 |
| P.aeruginosa | OprL | OprL-F-GATGGAAATGCTGAAATTCGGCOprL-R-CTTCTTCAGCTCGACGCCACG | 504 |
| EHEC 0157 | HlyA | HlyA-F-CAGTAGGGAAGCGAACAGAGHlyA-R-AAGCTCCGTGTGCCTGAAGC | 366 |
| Salmonella sp. | IpaB | IpaB-F-GGACTTTTTAAAAGCGGCGGIpaB-R-GCCTCTCCCAGAGCCGTCTGG | 315 |
| V.rahaemolyticus | Vpara | Vpara-F-GCTGACAAAACAACAATTTATTGTTVpara-R-GGAGTTTCGAGTTGATGAAC | 175 |
本发明的目的可经如下方案来实现：
本发明水体中常见致病菌的多重PCR快速检测试剂盒包括如下试剂：10×PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、引物、DNA聚合酶。
扩增反应体系：总体积50μl，包括1×PCR反应缓冲液，MgCL23.5mmol/L，dNTP各0.2mmol/L，引物IpaH 0.2μmol/L、OprL 0.2μmol/L、IpaB 0.3μmol/L、HlyA 0.3μmol/L、Vpara 0.4μmol/L，Hot star Taq酶2.5U，5μl模板，加水至50μl。
扩增反应条件：变性94℃5min，三温循环94℃1min，63℃1min，72℃100s，4个循环后，退火温度每降低1℃进行4个循环，到退火温度为58℃进行15个循环，共35个循环后，72℃延伸10min。
本发明还进行优化条件的验证。由于在同一份水体中同时出现五种致病菌的几率非常小，需要验证所建立的五重PCR条件是否能检测每种致病菌单独或同时存在，因此，在优化条件下分别进行2-4重PCR扩增，并采用凝胶电泳分离检测，在紫外凝胶成像系统分析结果。结果见图一。
本发明还提供了几种具体的试剂盒组成及使用方法：
试剂盒(一)：可快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血性大肠杆菌0157和副溶血弧菌多重PCR检测试剂盒。
组成：1)MgCL2(25mmol/L) 70μl
2)dNTP(2mmol/L) 50μl
3)10×PCR反应缓冲液 50μl
4)Hot star Taq酶(2.5U/μl) 10μl
5)引物IpaH-F和IpaH-R(10mmol/L) 20μl
引物OprL-F和OprL-R(10mmol/L) 20μl
引物IpaB-F和IpaB-R(10mmol/L) 30μl
引物HlyA-F和HlyA-R(10mmol/L) 30μl
引物Vpara-F和Vpara-R(10mmol/L) 40μl
该试剂盒可用于检测10个样品。
试剂盒(二)：志贺氏菌PCR检测试剂盒。
组成：1)MgCL2(25mmol/L) 50μl
2)dNTP(2mmol/L) 50μl
3)10×PCR反应缓冲液 50μl
4)Hot star Taq酶(2.5U/μl) 10μl
5)引物IpaH-F和IpaH-R(10mmol/L) 20μl
该试剂盒可用于检测10个样品。
试剂盒(三)：出血性大肠杆菌0157的PCR检测试剂盒。
组成：1)MgCL2(25mmol/L) 50μl
2)dNTP(2mmol/L) 50μl
3)10×PCR反应缓冲液 50μl
4)Hot star Taq酶(2.5U/μl) 10μl
5)引物HlyA-F和HlyA-R(10mmol/L) 20μl
该试剂盒可用于检测10个样品。
试剂盒(四)：绿脓杆菌的PCR检测试剂盒。
组成：1)MgCL2(25mmol/L) 50μl
2)dNTP(2mmol/L) 50μl
3)10×PCR反应缓冲液 50μl
4)Hot star Taq酶(2.5U/μl) 10μl
5)引物OprL-F和OprL-R(10mmol/L) 20μl
该试剂盒可用于检测10个样品。
本发明还提供了上述检测试剂盒的使用方法：
1.DNA提取
(1)取100ml细菌过夜培养液或500mL水样，5000r/min离心10分钟，去上清液；
(2)加9.5ml TE悬浮沉淀，并加入0.5ml 10％SDS，50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时；
(3)加1.5ml 5mol/L NaCl溶液，混匀；
(4)加1.5ml CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟；
(5)用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，5000r/min离心10分钟，将上清液移至干净离心管；
(6)用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，取上清液移至干净管中；
(7)加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，沉淀DNA；
(8)用玻棒捞出DNA沉淀，70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于1ml TE，-20℃保存。如DNA沉淀无法捞出，可5000r/min离心，使DNA沉淀。
注：1.CTAB/NaCl溶液的配制：4.1g NaCl溶解于80ml H2O，缓慢加入10g CTAB，加水至100ml。2.其它试剂：氯仿∶异戊醇(24∶1)，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，异丙醇，70％乙醇，TE，10％SDS，蛋白酶K(20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。
2.PCR扩增
(1)扩增反应体系：总体积50μl，每次实验取上述试剂盒试剂1/10量(试剂盒一取32μl，试剂盒二、三、四取18μl)于PCR eppendorf管中，加提取的DNA模板2～5μl，加ddH2O补至50μl，置PCR仪进行扩增。
(2)扩增反应条件：
试剂盒(一)的扩增条件：变性94℃5min，三温循环94℃1min，63℃1min，72℃100s，4个循环后，退火温度每降低1℃进行4个循环，直到退火温度为58℃进行15个循环，共35个循环后，72℃延伸10min。
试剂盒(二)的扩增条件：变性94℃5min，三温循环94℃40s，58℃40s，72℃50s，30个循环后，72℃延伸10min。
试剂盒(三)的扩增条件：变性94℃5min，三温循环94℃40s，60℃40s，72℃50s，30个循环后，72℃延伸10min。
试剂盒(四)的扩增条件：变性94℃5min，三温循环94℃40s，58℃40s，72℃50s，30个循环后，72℃延伸10min。
3.扩增产物电泳检测
扩增产物于15g/L琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统分析结果。结果见图2和3。
[附图说明]
图1为多重PCR优化条件实验及验证结果。采用优化的扩增反应体系及条件进行五重PCR实验，其中1、2、3、4为五重PCR产物条带；5、6、7、8、9为优化条件验证图。5为P.aeruginosa、EHEC 0157和V rahaemolyticus三重扩增；6.两重扩增：P.aeruginosa和Salmonella sp.；7.四重扩增：Shigella sp.、EHEC 0157、Salmonella sp.和V rahaemolyticus；8.三重扩增：Shigella sp.、P.aeruginosa和Salmonella sp.；9.四重扩增：Shigellasp.、P.aeruginosa、Salmonella sp.和V.rahaemolyticus；10.阴性对照；M：DL2000。
图2为多重PCR试剂盒电泳检测结果。
图3为单PCR试剂盒电泳检测结果。
[具体实施方式]
实施例：水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒
1.水样采集及前处理
无菌采样瓶采集水样500ml，7000r/min离心20min，沉淀用无菌蒸馏水洗三次，然后制备DNA。
2.DNA提取
(1)加9.5mL TE悬浮沉淀，并加0.5ml 10％SDS，50μL 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时；
(2)加1.5ml 5mol/L NaCL，混匀；
(3)加1.5ml CTAB/NaCL溶液，混匀，65℃保温20分钟；(4)用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，5000r/min离心10分钟，将上清液移至干净离心管。；
(5)用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，取上清液移至干净管中；
(6)加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，沉淀DNA；
(7)用玻棒捞出DNA沉淀，70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于1ml TE，-20℃保存。如DNA沉淀无法捞出，可5000r/min离心，使DNA沉淀。
注：1.CTAB/NaCL溶液：4.1g NaCL溶解于80ml H2O，缓慢加入10gCTAB，加水至100ml。2.其它试剂：氯仿∶异戊醇(24∶1)，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，异丙醇，70％乙醇，TE，10％SDS，蛋白酶K(20mg/mL或粉剂)，5mol/L NaCL。
3.多重PCR检测试剂盒组成：25mmol/L MgCL270μl、2mmol/LdNTP50μl、10×PCR反应缓冲液50μl、2.5U/μl Hot star Taq酶10μl、引物IpaH-F和IpaH-R(10mmol/L)20μl、引物OprL-F和OprL-R(10mmol/L)20μl、引物IpaB-F和IpaB-R(10mmol/L)30μl、引物HlyA-F和HlyA-R(10mmol/L)30μl、引物Vpara-F和Vpara-R(10mmol/L)40μl。
4.PCR扩增：
用微量进样器吸取上述多重PCR检测试剂盒32μl，即：MgCL27μl；dNTP5μl；10×PCR反应缓冲液5μl；Hot star Taq酶1μl；引物IpaH-F和IpaH-R 2μl；引物OprL-F和OprL-R 2μl；引物IpaB-F和IpaB-R 3μl；引物HlyA-F和Hl yA-R 3μl；引物Vpara-F和Vpara-R4μl，加DNA提取液2～5μl，最后用ddH2O补足体积至50ul，充分混匀。将混合物高速离心数秒后，在PCR仪依下列条件进行扩增：变性94℃5min，三温循环94℃1min，63℃1min，72℃100s，4个循环后，退火温度每降低1℃进行4个循环，直到退火温度为58℃进行15个循环，共35个循环后，72℃延伸10min。
5扩增产物电泳结果：
(1)取5ul扩增产物，制备15g/L的琼脂糖凝胶，在电泳设备中电泳。
(2)在凝胶成像仪上观察并记录实验结果。
(3)依据如下结果进行结果判断：沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血性大肠杆菌0157和副溶血弧菌阳性结果分别在315bp、611bp、504bp、366bp、175bp处有一条带。
(4)电泳结果如图2、3所示。
Claims (18)
1、水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，包括10×PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTP、引物、Hot star Taq酶。
2、权利要求1所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，各种试剂的浓度为：MgCL2溶液2.0～3.5mmol/L、dNTP 0.2mmol/L、10×PCR反应缓冲液、Hot star Taq酶2.5U/50μl、引物浓度0.2～0.4μmol/L。
3、权利要求1或2所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，所用引物为：志贺氏菌引物IpaH-FIpaH-F-CCTTGACCGCCTTTCCGATAC和IpaH-R-CAGCCACCCTCTGAGAGTACTC，611bp；绿脓杆菌引物OprL-F-GATGGAAATGCTGAAATTCGGC和OprL-R-CTTCTTCAGCTCGACGCCACG，504bp；肠出血型大肠杆菌O157引物HlyA-F-CAGTAGGGAAGCGAACAGAG和HlyA-R-AAGCTCCGTGTGCCTGAAGC，366bp；沙门氏菌引物IpaB-F-GGACTTTTTAAAAGCGGCGG和IpaB-R-GCCTCTCCCAGAGCCGTCTGG，315bp；副溶血弧菌引物Vpara-F-GCTGACAAAACAACAATTTATTGTT和Vpara-R-GGAGTTTCGAGTTGATGAAC，175bp。
4.权利要求1或2所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，包括MgCL2(25mmol/L)70μl、dNTP(2mmol/L)50μl、10×PCR反应缓冲液50μl、Hot star Taq酶(2.5U/μl)10μl、引物IpaH-F和IpaH-R(10mmol/L)20μl，引物OprL-F和OprL-R(10mmol/L)20μl、引物IpaB-F和IpaB-R(10mmol/L)30μl、引物HlyA-F和HlyA-R(10mmol/L)30μl、引物Vpara-F和Vpara-R(10mmol/L)40μl。
5、权利要求4所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒用于快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血性大肠杆菌O157和副溶血弧菌。
6、权利要求1或2所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，包括MgCL2(25mmol/L)50μl、dNTP(2mmol/L)50μl、10×PCR反应缓冲液50μl、Hot star Taq酶(2.5U/μl)10μl、引物IpaH-F和IpaH-R(10mmol/L)20μl。
7、权利要求6所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，用于快速检测志贺氏菌。
8、权利要求1或2所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，包括MgCL2(25mmol/L)50μl、dNTP(2mmol/L)50μl、10×PCR反应缓冲液50μl、Hot star Taq酶(2.5U/μl)10μl、引物HlyA-F和HlyA-R(10mmol/L)20μl。
9、权利要求8所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，用于快速检测出血性大肠杆菌O157。
10、权利要求1或2所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，包括MgCL2(25mmol/L)50μl、dNTP(2mmol/L)50μl、10×PCR反应缓冲液50μl、Hot star Taq酶(2.5U/μl)10μl、引物OprL-F和OprL-R(10mmol/L)20μl。
11、权利要求10所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，用于快速检测绿脓杆菌。
12、权利要求1所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，其使用方法为：(1)DNA模板的提取；(2)建立PCR扩增反应体系；(3)PCR扩增；(4)扩增产物进行电泳；(5)将电泳结果进行分析。
13、权利要求12所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，DNA模板的提取方法为：(1)加9.5mL TE悬浮沉淀，并加0.5ml 10％ SDS，50μL20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时；(2)加1.5ml 5mol/LNaCL，混匀；(3)加1.5ml CTAB/NaCL溶液，混匀，65℃保温20分钟；(4)用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，5000r/min离心10分钟，将上清液移至干净离心管。(5)用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，取上清液移至干净管中；(6)加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟或5000r/min离心，沉淀DNA；(7)用玻棒捞出DNA沉淀，70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于1ml TE，-20℃保存。
13、权利要求4所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，构建PCR扩增反应体系时各种试剂的使用量为：25mmol/L MgCL27μl；dNTP5μl；10×PCR反应缓冲液5μl；Hot star Taq酶(2.5U/μl)1μl；引物IpaH-F和IpaH-R(10mmol/L)2μl；引物OprL-F和OprL-R(10mmol/L)2μl；引物IpaB-F和IpaB-R(10mmol/L)3μl；引物HlyA-F和HlyA-R(10mmol/L)3μl；引物Vpara-F和Vpara-R(10mmol/L)4μl，加DNA模板2μl，最后用ddH2O补足体积至50ul，充分混匀。在下述扩增条件下进行扩增：变性94℃ 5min，三温循环94℃ 1min，63℃ 1min，72℃ 100s，4个循环后，退火温度每降低1℃进行4个循环，直到退火温度为58℃进行15个循环，共35个循环后，72℃延伸10min。
14、权利要求6所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，其PCR扩增体系为：25mmol/L MgCL25μl；dNTP5μl；10×PCR反应缓冲液5μl；Hotstar Taq酶(2.5U/μl)1μl；引物IpaH-F和IpaH-R(10mmol/L)2μl；加DNA模板2～5μl，最后用ddH2O补足体积至50ul，充分混匀。在下述扩增条件下进行扩增：变性94℃ 5min，三温循环94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 50s，30个循环后，72℃延伸10min。
15、权利要求8所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，其PCR扩增体系为：25mmol/L MgCL25μl；dNTP5μl；10×PCR反应缓冲液5μl；Hotstar Taq酶(2.5U/μl)1μl；引物HlyA-F和HlyA-R(10mmol/L)2μl；加DNA模板2～5μl，最后用ddH2O补足体积至50ul，充分混匀。在下述扩增条件下进行扩增：变性94℃ 5min，三温循环94℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 50s，30个循环后，72℃延伸10min。
16、权利要求10所述的水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，其PCR扩增体系为：25mmol/L MgCL25μl；dNTP5μl；10×PCR反应缓冲液5μl；Hotstar Taq酶(2.5U/μl)1μl；引物OprL-F和OprL-R(10mmol/L)2μl；加DNA模板2～5μl，最后用ddH2O补足体积至50ul，充分混匀。在下述扩增条件下进行扩增：变性94℃ 5min，三温循环94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 50s，30个循环后，72℃延伸10min。
17、权利要求12所述水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒，取扩增产物5-10μl，在15g/L琼脂糖凝胶电泳后，于凝胶成像仪上观察并记录实验结果。如果在315bp、611bp、504bp、366bp、175bp处分别有一条带则可以判断沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血性大肠杆菌O157和副溶血弧菌结果阳性。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN 200510033157 CN1814788A (zh) | 2005-02-06 | 2005-02-06 | 水体中常见食源性致病菌多重pcr快速检测试剂盒及检测方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510033157 CN1814788A (zh) | 2005-02-06 | 2005-02-06 | 水体中常见食源性致病菌多重pcr快速检测试剂盒及检测方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| CN1814788A true CN1814788A (zh) | 2006-08-09 |
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ID=36907144
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| CN 200510033157 Pending CN1814788A (zh) | 2005-02-06 | 2005-02-06 | 水体中常见食源性致病菌多重pcr快速检测试剂盒及检测方法 |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101235410B (zh) * | 2008-01-25 | 2011-01-19 | 广东省微生物研究所 | 水产品中致病菌多重pcr快速检测试剂盒及检测方法 |
| CN101575637B (zh) * | 2009-05-27 | 2012-09-05 | 中国科学院南京土壤研究所 | 土壤中病原细菌的多重pcr检测方法 |
| CN101748192B (zh) * | 2008-12-05 | 2012-09-26 | 南开大学 | 饮用水中主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒 |
| CN111020041A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-17 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 16种不同血清型沙门氏菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 |
-
2005
- 2005-02-06 CN CN 200510033157 patent/CN1814788A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN101748192B (zh) * | 2008-12-05 | 2012-09-26 | 南开大学 | 饮用水中主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒 |
| CN101575637B (zh) * | 2009-05-27 | 2012-09-05 | 中国科学院南京土壤研究所 | 土壤中病原细菌的多重pcr检测方法 |
| CN111020041A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-17 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 16种不同血清型沙门氏菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 |
| CN111020041B (zh) * | 2019-12-30 | 2022-10-11 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 16种不同血清型沙门氏菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 |
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