CN105219847B - 一种军团菌快速检测与分型试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物分子检测领域，尤其涉及一种军团菌快速检测与分型试剂盒及其检测方法。本发明提供的军团菌快速检测与分型试剂盒，包括细菌基因组DNA提取液、PCR反应液、PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液,所述PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液含有军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物。本发明提供的试剂盒具有特异性强和准确性高的优点，该试剂盒可以一步快速检测出是否含有军团菌，同时还可以鉴别出军团菌是嗜肺军团菌还是非嗜肺军团菌，无需进行多次凝胶电泳分析，节省成本，操作简便，而且检测结果准确，是一种理想的军团菌快速检测与分型的试剂盒。

Description

一种军团菌快速检测与分型试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于微生物分子检测领域，尤其涉及一种军团菌快速检测与分型试剂盒及其检测方法。

背景技术

军团菌是一种胞内寄生的革兰阴性杆菌，在土壤和水系统中广泛存在。目前军团菌属有52种包括70多个血清型，并不断有新的菌种从环境中分离。近年来发现，约有一半的军团菌种与人类疾病有关，其中80%以上的军团菌感染是由嗜肺军团菌引起。军团菌通过空气以气溶胶的形式感染人，引起军团菌性肺炎，严重威胁人类的健康。因此，建立一种能检测军团菌和快速鉴别嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的方法具有重要的临床意义。

目前对军团菌的检测鉴定方法主要有血清抗体检测、尿可溶性抗原检测、军团菌分离培养等。但是上述的检测方法存在检测时间长、阳性率低、培养基的配置复杂和价格昂贵的缺陷，不利于军团菌的快速检测。近年来，分子生物学的发展为微生物的分类鉴定工作提供了较简便和准确的方法。PCR 方法具有很高的特异性与敏感性，其主要是通过检测军团菌中的特异基因，以达到快速检测军团菌的目的。

中国专利CN102071247B公开了一种区分非嗜肺与嗜肺军团菌的检测方法及试剂盒，所述的试剂盒组分包括核酸提取液、PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶、内参照、阴性及阳性对照，其检测的原理是采用特异性靶序列并根据此设计引物探针并通过荧光PCR扩增，以不同荧光标志的探针实时检测同一靶序列而检测军团菌，并区分非嗜肺与嗜肺军团菌。该检测试剂盒操作简便，可以避免自身PCR产物核酸污染产生的假阳性，而且能解决因样本中PCR抑制剂引起的假阴性的问题。但是，该检测试剂盒对样品要求高，而且检测结果判断复杂，检测结果准确性较低，不利于该试剂盒的推广和应用。

中国专利CN101597647B公开了一种军团菌快速检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括细菌组DNA提取液、PCR反应液、PCR产物纯化液和酶切反应液。该试剂盒的是通过应用第一PCR反应液扩增后，以前一步PCR反应产物为模板，用第二PCR反应液扩增，将所得的最终PCR 产物作琼脂糖凝胶电泳；将第一PCR 纯化液与最终PCR产物混合后加入到PCR纯化柱内，离心后加入第二PCR纯化液，再次离心后，加入第三PCR纯化液后离心，得到PCR纯化产物；将PCR纯化产物加入到酶切反应液中消化，将酶切产物做琼脂糖凝胶电泳检测。该试剂盒具有灵敏度高和特异性高的优点。但是，该试剂盒检测步骤较多，操作繁琐，大大的限制了该试剂盒的应用。

因此，研究和开发出一种操作简单、检测结果便于判断、检测结果准确性高的军团菌试剂盒是当前亟需解决的难题。

发明内容

为解决现有技术中军团菌试剂盒存在操作繁琐、结果判断复杂和检测结果准确性低的缺陷，本发明提供一种军团菌快速检测与分型试剂盒及其检测方法，以解决上述问题。

本发明提供一种军团菌快速检测与分型试剂盒，包括细菌基因组DNA提取液、PCR反应液、PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液,所述PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液含有军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物，所述军团菌属特异引物为：

GL261F：5’-GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’(SEQ ID NO.1)，

GL261R：5’-CGATCTCTACGCATTTCACCG-3’(SEQ ID NO.2)；

所述嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物为：

LP-A⁶²⁸R ：5’-GTCAACCAGTATTATCTGACCGT-3’(SEQ ID NO.3)，

LP-C⁶²⁹F ：5’- CTGGGCTTAACCTGGGAC-3’(SEQ ID NO.4)。

进一步地，所述军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的靶基因均为16s rRNA基因。

进一步地，所述细菌基因组DNA提取液的配方为：Chelex 100 resin 5%；Tris-HCl10 mM，pH8.3；乙二胺四乙酸二钠 0.1 mM；叠氮钠 0.1 %；蛋白酶K 200μg/ml。

进一步地，所述PCR反应液为2×PCR反应液，所述2×PCR反应液的组分及其组分浓度为：0.1 U/µl EasyTaq DNA聚合酶；500 µM dNTP ；20 mM Tris-HCl，pH8.3；100 mM KCl；3 mM MgCl2。

进一步地，所述PCR引物混合液中军团菌属特异引物与嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的浓度比为1-3：1-3，所述军团菌属特异引物与嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的浓度比优选为2：1。

进一步地，所述阳性对照液还含有嗜肺军团菌基因组DNA，所述军团菌基因组DNA核苷酸序列在NCBI基因库上编号为NR_074231。

另外，本发明还提供了一种军团菌快速检测与分型的检测方法，包括如下步骤：

S1应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA；

S2以细菌基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物进行PCR扩增；

S3将阳性对照和阴性对照进行PCR扩增；

S4将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

优选地，所述步骤S2中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：94℃ 3min；阶段2：94℃20s；阶段3：59℃ 20s；阶段4：72℃ 25s；35个循环；阶段5：72℃ 5min；在4℃保温。

优选地，所述步骤S2中军团菌属特异引物扩增序列为261bp。其中，GL261F-GL261R引物对扩增序列为军团菌属16S rDNA基因一段保守序列，具体序列如下：

GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCG。

优选地，所述步骤S2中肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物分别与军团菌属特异引物配对扩增261bp内的一段序列； GL261F-（LPA628R）引物对扩增片段为203bp；（LP-C⁶²⁹F）-GL261R引物对扩增序列为97bp。其中，GL261F-（LP-A⁶²⁸R）引物对扩增片段亦为军团菌属16S rDNA基因一段保守序列为上述261bp片段内的一段203bp序列，具体序列如下：

GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGAC；

（LP-C⁶²⁹F）-GL261R引物对扩增序列亦为军团菌属16S rDNA基因一段保守序列为上述261BP片段内的一段97bp序列，具体序列如下：

CTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCG。

本发明提供的军团菌快速检测与分型试剂盒是利用等位基因特异性PCR原理，利用等位基因上一两个碱基的差异，特异扩增其中一个等位基因的技术。其主要原理是利用一对特异与其中一条等位基因完全互补的引物，而与另外一条等位基因在3’端不互补的引物进行基因扩增，从而达到鉴别的效果。发明人经过生物信息学方法的研究发现军团菌属16s rRNA基因里有一段保守序列中存在两个单核甘酸多态性位点（SNP），该位点在嗜肺军团菌中为A⁶²⁸C⁶²⁹，而在非嗜肺军团菌中的单核甘酸多态性位点（SNP）则不是A⁶²⁸C⁶²⁹，因此利用一对军团菌属特异引物和一对肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物做多重PCR可以快速检测军团菌属，同时还可以鉴别出军团菌是嗜肺军团菌还是非嗜肺军团菌。

本发明提供的军团菌快速检测与分型试剂盒结果判定方法是：对PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果进行分析，若出现261bp条带，则说明检测标本中含有军团菌属细菌，反之，则说明检测标本中不含军团菌属细菌；若除了出现261bp条带外还同时出现了203bp和97bp条带，则说明检出的军团菌为嗜肺军团菌，若除了261bp条带，没有同时出现203bp和97bp条带，则说明检测到的军团菌为非嗜肺军团菌。

本发明提供军团菌快速检测与分型试剂盒不仅能在临床中应用，还可以应用于环境水标本中，为环境水源风险性控制及军团菌感染流行病学调查提供依据和工具，有利于该检测试剂盒的推广和应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的军团菌快速检测与分型试剂盒具有特异性好和准确性高的优点，提高了检测效率。此外，本发明还提供军团菌快速检测与分型的检测方法，通过使用本发明提供的特异性的引物，可以快速、简便的检测出军团菌，同时还可以进一步分型为嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌，该检测方法无需进行多次凝胶电泳分析，操作简便，而且检测结果准确，是一种理想的军团菌快速检测与分型的试剂盒。

附图说明

图1为PCR扩增产物的凝胶电泳图；其中：Marker条带；从下到上分别为：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和 600bp，1-4分别为各个不同的菌种鉴定结果，PC为阳性对照，NC为阴性对照。

具体实施方式

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。其中，Chelex 100 resin购买自bio-rad公司（货号：1432832）。

实施例1、引物

本发明提供一种军团菌快速检测与分型的引物。

表1 本发明提供的引物

实施例2、引物的配对及其扩增片段大小

本发明提供的肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物分别与军团菌属特异引物配对扩增261bp内的一段序列； GL261F-（LPA⁶²⁸R）引物对扩增片段为203bp；（LP-C⁶²⁹F）-GL261R引物对扩增序列为97bp。

表2 引物的配对及其扩增片段大小

其中：

（1）GL261F 与GL261R 引物扩增的核苷酸序列为：

GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCG；

（2）GL261F与LP-A⁶²⁸R引物扩增的核苷酸序列为：

GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGAC；

（3）LP-C⁶²⁹F与GL261R引物扩增的核苷酸序列为：

CTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCG。

实施例3、军团菌快速检测与分型的方法

1）应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA：选取标本进行预处理，再使用细菌基因组DNA提取液提取细菌基因组DNA，其中，所述DNA提取液的成分如下：

2）以细菌基因组DNA为模板，采用实施例1所述的军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物进行PCR扩增；所述的PCR反应混合液由以下组分组成：2×PCR反应混合液（2×EasyTaq PCR SuperMix，含0.1 U Taq Polymerase/µl，500µM dNTP ，20 mM Tris-HCl (pH8.3)，100 mM KCl，3 mM MgCl₂）12.5μL，ddH₂O 5.5μL。

3）将阳性对照和阴性对照进行PCR扩增；

4）将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像结果，阳性对照应该有对照的三条条带分别为261bp，203bp和97bp，而阴性对照则无上述三条条带出现。若凝胶成像后，阴性对照出现261bp条带，或/和阳性对照未出现261bp，203bp和97bp电泳条带，则试验结果不可信，可能存在污染或操作有误。试验管的产物经过电泳若出现261bp条带，则说明标本中检出了军团菌,若无261bp条带出现，则标本中未检出军团菌，即标本中不存在军团菌;而试验管中除了261bp条带还同时出现另外两条条带即203bp和97bp条带，则说明检出的军团菌为嗜肺军团菌；若仅出现261bp条带或除了261bp条带仅有一条203bp或97bp条带出现，则检出的军团菌为非嗜肺军团菌。

实施例4、痰标本的军团菌检测

1、含有嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌的痰标本处理：

1）在1.5 ml离心管中加入0.5 ml军团菌专用的痰消化液；痰消化液为自制，其具体组成为：

二硫苏糖醇（DTT）0.2 g，乙二胺四乙酸0.894 g，氯化钾0.04 g，磷酸氢二钾0.36g和磷酸二氢钾0.04 g, 加双蒸水混匀后定容为10 ml。

2）用枪头或灭菌牙签从痰标本中吸取或挑取约0.5 ml痰标本，置于上述痰消化液中；

3）充分混匀后，37℃水浴10～15 min；

4）在13000 rpm 的离心机中离心5分钟后，弃上清，用0.5 ml无菌水洗涤2次后离心留沉淀。

2.标本中细菌基因组DNA的提取：在上述留取沉淀的离心管中加入细菌基因组DNA提取液100 μl，在56℃水浴30 min，接着在100℃水浴10 min，离心沉淀，在5000 rpm下离心5 min，上清液即为提取到的基因组DNA，供作DNA模版。

3.PCR反应

1）每个标本准备3个PCR管，每管中分别加入两种引物混合液3μl，标记好管的编号。阳性对照及阴性对照亦各为一管，编号为PC或NC，直接加入5μl双蒸水进行反应；阳性对照液与阴性对照液的组成参见表3。

表3 阳性对照液和阴性对照液的组成配方

PCR反应条件为：94℃ 3 min, 94℃ 20 s, 59℃ 20 s, 72℃ 25 s，35个循环，72℃ 5 min, 4℃ 保温。

4.琼脂糖凝胶电泳

反应完成后，将产物琼脂糖凝胶电泳，取5μl PCR产物和5μlDNA Marker ，加入1.5%琼脂糖凝胶中电泳40 min，DNA Marker的条带从小到大分别为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp和600bp。

5.试验结果：

试验结果如图1所示，其中：Marker条带；从下到上分别为：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和 600bp，1-4分别为各个不同的菌种鉴定结果，PC为阳性对照， NC为阴性对照。1道出现了261bp、203bp和97bp条带，说明检出的军团菌为嗜肺军团菌；2道仅出现261bp条带，3道出现261bp和203bp条带，4道出现261bp和97bp条带，说明2-4道检出的军团菌为非嗜肺军团菌。本发明的军团菌快速检测与分型的方法的检测结果与实际的结果一致，证明本发明提供的军团菌快速检测与分型的方法具有良好的实用性。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州金域医学检验中心有限公司

<120> 一种军团菌快速检测与分型的引物及方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggagggttga taggttaaga gc 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgatctctac gcatttcacc g 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcaaccagt attatctgac cgt 23

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgggcttaa cctgggac 18

Claims (5)

1.一种军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，包括细菌基因组DNA提取液、PCR反应液、PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液,所述PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液含有军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物，所述军团菌属特异引物为：

GL261F：5’-GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’，

GL261R：5’-CGATCTCTACGCATTTCACCG-3’；

所述嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物为：

LP-A⁶²⁸R：5’-GTCAACCAGTATTATCTGACCGT-3’，

LP-C⁶²⁹F：5’-CTGGGCTTAACCTGGGAC-3’。

2.如权利要求1所述的军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，所述细菌基因组DNA提取液的配方为：Chelex 100resin 5％；Tris-HCl 10mM，pH8.3；乙二胺四乙酸二钠0.1mM；叠氮钠0.1％；蛋白酶K 200μg/ml。

3.如权利要求1所述的军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为2×PCR反应液，所述2×PCR反应液的组分及其组分浓度为：

0.1U/μl EasyTaq DNA聚合酶；500μM dNTP；20mM Tris-HCl，pH8.3；100mM KCl；3mMMgCl₂。

4.如权利要求1所述的军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，所述PCR引物混合液中军团菌属特异引物与嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的浓度比为1-3：1-3。

5.如权利要求1所述的军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，所述阳性对照液还含有嗜肺军团菌基因组DNA，所述军团菌基因组DNA核苷酸序列在NCBI基因库上编号为NR_074231。