CN109680101A - 一种区分h7n9亚型禽流感病毒强弱毒的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种区分H7N9亚型禽流感病毒强弱毒的快速检测方法，通过比对了近年来分离到的H7N9亚型禽流感病毒HA和NA基因核苷酸序列，分别在其保守区设计了引物和探针，建立了可以区分H7N9亚型禽流感病毒强弱毒的实时荧光定量RT‑PCR核酸快速检测方法。本发明所提供的区分H7N9亚型禽流感病毒强弱毒的实时荧光RT‑PCR方法能够在同一反应管中检测区分出H7亚型禽流感病毒的强毒、弱毒，还能检测出N9亚型禽流感病毒。具有灵敏度高、检测时间短，不需要电泳等开放环节，只需一台荧光PCR仪即可在密闭反应管中完成，且在检测过程中可实时查看反应曲线，对结果作出快速判断。

Description

一种区分H7N9亚型禽流感病毒强弱毒的快速检测方法

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种区分H7N9亚型禽流感病毒强弱毒的快速检测方法。

背景技术

2013年我国从人群病例和家禽中检测到H7N9病毒，动物试验证明从家禽中分离到的H7N9病毒对家禽是无致病力或低致病力的。但随着H7N9病毒的演变，在经历了三年多时间之后，2016年底以来，H7N9禽流感病毒从弱毒株突变为强毒株，并在某些地区暴发了H7N9高致病性禽流感疫情。

H7N9病毒突变为高致病性毒株之后，对家禽业造成巨大的经济损失。H7N9弱毒虽然对家禽低致病力，但病毒可以传播到人群，可以突变为高致病性毒株，存在潜在的威胁。因此，区分H7N9强毒株与弱毒株对于疾病的诊断与防治具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种区分H7N9亚型禽流感病毒强弱毒的快速检测方法，通过比对了近年来分离到的H7N9亚型禽流感病毒HA和NA基因核苷酸序列，分别在其保守区设计了引物和探针，建立了可以区分H7N9亚型禽流感病毒强弱毒的实时荧光定量RT-PCR核酸快速检测方法。

本发明首先提供一种用于区分H7亚型禽流感病毒强弱毒检测的引物组和探针，其序列信息如下：

其中上游引物的序列为AGTCTKCTGCTKGCWACAGGRATG(SEQ ID NO：1)，

下游引物序列为CTTCCCATCCATTTTCAATGAAAC(SEQ ID NO：2)；

强毒株检测探针，其序列为CGGAMTRMDACCAAAGRGAAAACGGAMTRMDAGAGGCCT(SEQ IDNO：3)，

其中探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；

弱毒株检测探针的序列为CAAAGGGRGAGGCCTATTTGGTGCT(SEQ ID NO：4)，

其中探针的5'端标记Cy5，3'端标记BHQ2；

本发明其次提供一种用于N9亚型禽流感病毒检测的引物组和探针，其序列信息如下：

其中上游引物的序列为GGCTCTGTACYATAAATTC(SEQ ID NO.5)，

下游引物序列为GCATGAMACATAGGGTTCTCT(SEQ ID NO.6)；

检测探针序列为TGGCACATATATGGGAAAGAC(SEQ ID NO.7)，

其中探针的5'端标记Hex，3'端标记BHQ1；

本发明的引物组和探针用于制备使用实时荧光定量RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒的试剂盒；

本发明再一个方面提供一种区分H7N9亚型禽流感病毒强弱毒的方法，包括如下的步骤：

1)配置反应体系：

在聚合酶链式反应管中依次加入含dNTPs、Mg²⁺的2×qRT-PCR反应缓冲液25μl、浓度为10μmol/L上游引物各2.0μl、浓度为10μmol/L的下游引物各2.0μl、浓度为10μmol/L的探针各1.5μl、酶混合物2.5μl、需要检测的病毒核酸样品10.0μl；

2)反应步骤：

将步骤1)配置好的反应体系密闭后，置于荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光；

3)结果检测：

如果出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为阳性，否则判断为阴性。

本发明所提供的区分H7N9亚型禽流感病毒强弱毒的实时荧光RT-PCR方法能够在同一反应管中检测区分出H7亚型禽流感病毒的强毒、弱毒，还能检测出N9亚型禽流感病毒。具有灵敏度高、检测时间短，不需要电泳等开放环节(易造成环境污染)，只需一台荧光PCR仪即可在密闭反应管中完成，且在检测过程中可实时查看反应曲线，对结果作出快速判断。而作为禽流感诊断金标准的病毒分离方法，则需要更多的设备、更长的时间、更高的硬件要求(高致病性禽流感病毒需要在生物安全三级实验室完成)。

附图说明

图1：HA序列比对图，

图2：NA序列比对图，

图3：本发明建立的实时荧光定量RT-PCR方法敏感性试验图。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明进行详细的描述。

实施例1：保守序列区域的确定及引物探针的筛选

申请人通过分子生物学方法研究了H7N9亚型禽流感病毒强毒和弱毒的HA和NA核苷酸序列(表1)，与申请人所在实验室分离保存的H7N9毒株HA序列进行比对，确定其保守区域(图1、图2)。序列比对发现，H7N9亚型禽流感病毒强弱毒的HA序列在

nt907–nt956区域，该区域的序列如下：

TTTCAGAACATWGAYAGCAGRRCARTTGGAAAATGYCCRAGATAKGTTAA；

nt964–nt995区域，序列为

AGTCTKCTGCTKGCWACAGGRATGAAGAATGT；

nt1028–nt1076区域，序列为

GAGGCCTRTTTGGTGCTATAGCDGGTTTCATTGAAAATGGATGGGAAGG的保守度较高；其中，R＝A或G，Y＝C或T，M＝A或C，W＝A或T，K＝G或T。

比对H7N9亚型禽流感病毒高致病性毒株与低致病性毒株的HA序列，显示高致病性毒株主要是在nt1016–nt1027区域插入了12个碱基，序列为AACGGAMTRMDA；其中，R＝A或G，M＝A或C，D＝G，A或T。

序列比对发现，H7N9亚型禽流感病毒的NA序列在nt272–nt410区域，该区域的序列如下：

GGCTCTGTACYATAAATTCRTGGCACATATATGGGAAAGACAATGCARTAAGAATTGGAGARARCTCGGATGTTTTAGTYACRAGAGAACCCTATGTKTCATGCDACCCRGATGARTGCARGTTCTATGCTCTCAGCCA；

nt453–nt506区域，序列为

CGATAGRTCCCAGTATCGMGCYCTGATAAGCTGGCCAYTATCATCACCGCCCAC；

nt578–nt698区域，序列为

CAATATGTATATCRGGACCRAACAACAATGCATCTGCWRTARTATGGTACAACAGAAGGCCTRTKRCAGAAATTAACACRTGGGCCCGAAAYATACTAAGAACRCARGARTCTGAATGTGT；

nt1306–nt1385区域，序列为

GAGGATAAAGTGTGGTGGACCAGCAAYAGTATAGTATCRATGTGTTCCAGTACAGARTTCCTGGGACAATGGAACTGGCCTGAYGGGGCTARAATAGAGTACTTCCTCTA的保守度较高；其中，R＝A或G，Y＝C或T，M＝A或C，W＝A或T，K＝G或T。

表1：本发明中引物和探针设计使用到的病毒株信息表

按照荧光定量RT-PCR引物探针设计原则，在不同保守区域设计多对引物和探针，进行筛选，根据检出的灵敏度最终确定了用于区分H7N9亚型禽流感病毒强弱毒检测的最优引物组和探针，其序列信息如下：

其中用于检测H7病毒HA基因的上游引物序列为AGTCTKCTGCTKGCWACAGGRATG(SEQID NO.1)，

H7下游引物序列为CTTCCCATCCATTTTCAATGAAAC(SEQ ID NO.2)；

H7强毒株探针序列为CGGAMTRMDACCAAAGRGAAAACGGAMTRMDAGAGGCCT(SEQ IDNO.3)，其中探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；

H7弱毒株探针序列为CAAAGGGRGAGGCCTATTTGGTGCT(SEQ ID NO.4)，其中探针的5'端标记Cy5，3'端标记BHQ2；

同时，筛选出能检测H7N9病毒NA亚型的最优引物组和探针，其序列信息如下：

N9上游引物的序列为GGCTCTGTACYATAAATTC(SEQ ID NO.5)，

N9下游引物序列为GCATGAMACATAGGGTTCTCT(SEQ ID NO.6)；

N9检测探针序列为TGGCACATATATGGGAAAGAC(SEQ ID NO.7)，

其中探针的5'端标记Hex，3'端标记BHQ1；

实施例2：建立检测方法

确立了检测反应体系和反应条件，在聚合酶链式反应管中依次加入2×RT-PCR反应缓冲液25μl(含dNTPs、Mg²⁺)、第一步所合成的上游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的下游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的探针1.5μl(浓度为10μmol/L)、酶混合物(反转录酶、RNA酶抑制剂、具有具有5'→3'外切活性的Taq酶)2.5μl、需要检测的病毒核酸10.0μl(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)；然后将反应体系密闭，置于荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。如果出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为阳性，否则判断为阴性。

用实时荧光定量RT-PCR技术，对H7N9亚型禽流感病毒进行核酸快速检测，包括如下步骤：

第一步(合成引物)：按照本发明指定的核酸序列(即序列表中SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7)，人工合成扩增反应所需要的上下游引物和探针；

第二步(配置反应体系)：在聚合酶链式反应管中依次加入2×qRT-PCR反应缓冲液25μl(含dNTPs、Mg²⁺)、第一步所合成的上游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的下游引物2.0μl(浓度为10μmol/L)、第一步所合成的探针1.5μl(浓度为10μmol/L)、酶混合物(反转录酶、RNA酶抑制剂、具有具有5'→3'外切活性的Taq酶)2.5μl、需要检测的病毒核酸10.0μl(从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的)；

第三步(反应)：将第二步配置好的反应体系密闭后，置于荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。

第四步(结果检测)：如果FAM通道和Hex通道出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断H7N9强毒为阳性；如果Cy5通道和Hex通道出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断H7N9弱毒为阳性；如果FAM通道、Cy5通道和Hex通道均未出现S型荧光曲线或Ct值>38，则判断H7N9病毒为阴性。

实施例3：引物和探针的效果检测

1、采用上述筛选建立的引物探针和方法对H7N9亚型禽流感病毒进行了敏感性测试，包括如下步骤：

第一步：分别提取H7N9强毒株和弱毒株RNA，用微量核酸分析仪测定病毒RNA含量。将RNA作10倍比稀释，取10.0μl稀释后的RNA模板，加入到40.0μl qRT-PCR预混液中；

第二步：采用建立的实时荧光定量RT-PCR方法进行检测，确定其灵敏度；

结果表明，本发明建立的实时荧光定量RT-PCR方法，对H7N9强毒HA基因的检测下限是0.004fg RNA模板，对H7N9弱毒HA基因的检测下限是0.1fg RNA模板，对H7N9强毒NA基因的检测下限都是0.04fg RNA模板，对H7N9弱毒NA基因的检测下限都是0.01fg RNA模板(图3)。

2、对H7N9亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法进行了特异性测试，包括如下步骤：

第一步：选取本室保存的H1-H16亚型的禽流感病毒，包括H1N1亚型、H2N2亚型、H3N2亚型、H4N4亚型、H5N1亚型、H5N2亚型、H5N3亚型、H5N6亚型、H5N8亚型、H6N8亚型、H7N9亚型、H8N6亚型、H9N2亚型、H10N8亚型、H11N2亚型、H12N2亚型、H13N1亚型、H14N4亚型、H15N1亚型、H16N1亚型。其中H7N9亚型禽流感病毒，包括强毒株和弱毒株。同时选取其他禽类病毒，包括新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒。提取RNA作为模板；

第二步：采用建立的实时荧光定量RT-PCR方法进行检测，确定其特异性；

结果表明本发明建立的实时荧光定量RT-PCR方法，可以检测出H7N9亚型禽流感病毒的强毒株或弱毒株，对其他亚型的禽流感病毒及其他禽类病毒均无检出(表2)。结果显示该技术的灵敏度为100.0％，特异性为100.0％。

表2：本发明建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性试验结果表

实施例4：临床样品的应用检测。

对2013～2017年收集临床疑似H7N9亚型高致病性禽流感发病家禽样品50份，主要包括肺脏、肝脏、脾脏、气管、直肠等组织。取少量组织样品，剪碎后加入5～10倍体积的PBS缓冲液，进行匀浆或震荡破碎。冻融3次后，10000rpm离心5分钟，取上清备用。一部分上清直接提取RNA，用上述H7N9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR核酸快速检测方法进行检测；另一部分上清接种10日龄鸡胚，进行病毒分离、测序，比较两种方法的符合率。

结果显示：对50份临床发病组织样品进行检测，用上述H7N9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR核酸快速检测方法进行检测，有3份H7N9弱毒阳性、15份H7N9强毒阳性。病毒分离和测序结果也显示为3份H7N9弱毒阳性、15份H7N9强毒阳性，二者结果一致且为对应关系，符合率100％。结果显示该技术的灵敏度为100.0％，特异性为100.0％。

实施例5：

对近年来实验室分离鉴定的40株H7N9亚型禽流感病毒(强毒株和弱毒株各20株)进行实时荧光定量RT-PCR检测，同时用深圳市匹基生物工程股份有限公司(《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法(GB/T 19438.3-2004)》国家标准起草单位)生产的禽流感(AIV-H5)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒进行检测，以及《动物流感检测H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法(GB/T35806-2018)》中的引物对进行检测，对比三者的检出率。

结果显示：上述H7N9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR核酸快速检测方法可以将20份H7N9强毒和20份H7N9弱毒全部检出，检出率100％。而深圳市某生物工程股份有限公司生产的禽流感(AIV-H5)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒有4份检测为阴性，检出率为90％，且只能检出H7亚型基因(HA)，不能检出H9亚型基因(NA)，更不能区分强毒株和弱毒株；《动物流感检测H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法(GB/T 35806-2018)》中的引物可以将20份H7N9强毒和20份H7N9弱毒全部检出(HA和NA)，但不能区分强毒株和弱毒株；表明本发明所筛选的引物和探针能有效地对目前的H7N9亚型禽流感病毒强弱毒进行区分和检测。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种区分H7N9亚型禽流感病毒强弱毒的快速检测方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtctkctgc tkgcwacagg ratg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttcccatcc attttcaatg aaac 24

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggamtrmda ccaaagrgaa aacggamtrm dagaggcct 39

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caaagggrga ggcctatttg gtgct 25

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggctctgtac yataaattc 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcatgamaca tagggttctc t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggcacatat atgggaaaga c 21

Claims (10)

1.一种用于区分H7亚型禽流感病毒强弱毒检测的引物组和探针，其特征在于，所述的引物组和探针的序列信息如下：

上游引物的序列为SEQ ID NO：1，

下游引物的序列为SEQ ID NO：2；

检测H7亚型禽流感病毒强毒株的探针，其序列为SEQ ID NO：3，

检测H7亚型禽流感病毒弱毒株的探针，其序列为SEQ ID NO：4。

2.如权利要求1所述的引物组和探针，其特征在于，所述的检测H7亚型禽流感病毒强毒株的探针和检测H7亚型禽流感病毒弱毒株的探针，其5'端和3'端分别标记不同的荧光标记。

3.如权利要求2所述的引物组和探针，其特征在于，所述的检测H7亚型禽流感病毒强毒株的探针，其中探针的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1。

4.如权利要求2所述的引物组和探针，其特征在于，所述的检测H7亚型禽流感病毒弱毒株的探针，其中探针的5'端标记Cy5，3'端标记BHQ2。

5.权利要求1-4任一项所述的引物组和探针在制备检测H7亚型禽流感病毒强弱毒株的制品中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的制品为荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

7.一种用于N9亚型禽流感病毒检测的引物组和探针，其特征在于，所述的引物组和探针的序列信息如下：

其中上游引物的序列为SEQ ID NO：5，

下游引物的序列为SEQ ID NO：6；

检测探针的序列为SEQ ID NO：7。

8.如权利要求7所述的引物组和探针，其特征在于，所述的探针的5'端标记Hex，3'端标记BHQ1。

9.一种实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1和权利要求6所述的引物组和探针。

10.一种区分H7N9亚型禽流感病毒强弱毒的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)配置反应体系：

在聚合酶链式反应管中依次加入含dNTPs、Mg²⁺的2×qRT-PCR反应缓冲液25μl、浓度为10μmol/L上游引物各2.0μl、浓度为10μmol/L的下游引物各2.0μl、浓度为10μmol/L的探针各1.5μl、酶混合物2.5μl、需要检测的病毒核酸样品10.0μl；

所述的上游引物、下游引物和探针，为权利要求1和权利要求6所述的引物组和探针；

2)反应步骤：

将步骤1)配置好的反应体系密闭后，置于荧光定量PCR仪上进行反应；反应条件：第一阶段，反转录50℃/10min；第二阶段，预变性95℃/2min；第三阶段，95℃/10s，60℃/30s，40个循环；在第三阶段每次循环的退火延伸时收集荧光；

3)结果检测：

如果出现S型荧光曲线且Ct值≤38，则判断为阳性，否则判断为阴性。