CN109735658A - 一种新城疫病毒的荧光定量rt-pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种新城疫病毒荧光RT‑PCR检测方法，其中使用的检测新城疫病毒引物对和探针组，其特征在于，所述的引物对和探针组中，正向引物的序列为SEQ ID NO:1，反向引物的序列为SEQ ID NO:2；探针序列为SEQ ID NO:3。本发明提供一种基于分子生物学的快速检测新城疫病毒的方法，以实现对新城疫病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。

Description

一种新城疫病毒的荧光定量RT-PCR检测方法

技术领域

本发明属于荧光定量RT-PCR检测技术领域，具体涉及一种新城疫病毒荧光定量RT-PCR的检测方法，包括鉴定新城疫病毒的引物对和探针。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起禽类的一种急性、败血性和高度接触性传染病，主要表现为浆膜黏膜出血、呼吸困难、下痢及神经紊乱等。ND传播速度快、致死率高、接触传染性强、分布广泛，对禽类养殖业造成严重威胁，所以世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病。该病对我国的养禽业造成重大的经济损失。该病能引起鸡、火鸡、鹌鹑等多种禽类的感染和死亡，是危害禽类最主要的疾病之一。新城疫病毒还被认为是一种人畜共患病毒，其潜伏期约为48h，主要引起急性结膜炎。

新城疫病毒属禽副黏病毒1型，有囊膜，基因组为单股负链RNA，大小约15kb，编码6种蛋白质，包括RNA聚合酶(L)、血凝素一神经氨酸酶蛋白(HN)、融合蛋白(F)、基质蛋白(M)、磷蛋白(P)和核蛋白(N)。根据病毒基因组长度、F基因和L基因序列，NDV可分为两大分支为ClassI和ClassⅡ。ClassI一般为低毒力或无毒力的毒株，多从水禽中分离；ClassⅡ新城疫病毒到目前为止共发现有18个基因型，分别为基因I～XVIII型，基因I型为无毒株。至今我国已发现ClassⅡ新城疫病毒的11个基因型(Ⅰ～Ⅸ型和Ⅻ型、XV型)，基因Ⅶ型是我国目前流行的主要基因型，约占53.8％。随着新城疫病毒不断变异，需要研究适合我国流行毒株的高通量快速检测方法用于该病的监测与防控工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法，以实现对新城疫病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。

本发明首先提供一种检测新城疫病毒引物对和探针组，分别是鉴定新城疫病毒M基因的引物对NDV forward、NDV reverse和探针NDV probe，其引物对和探针序列信息如下：

正向引物NDV forward：5′-CTCAGTGATGTGCTYGGACC-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物NDV reverse：5′-CCTGRGGAGAGGCATTTGCTA-3′(SEQ ID NO:2)

探针NDV probe：5′-TTCTCWAGCAGYGGGACAGCCT-3′(SEQ ID NO:3)

其中探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。

本发明再一个方面提供检测临床样品中新城疫病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，包括如下的步骤：

1)配制荧光定量RT-PCR反应体系

反应液每管25μL，含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μL，5U/μL TaKaRaEx Taq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL，10pmol/μL NDV forward、NDVreverse和NDV probe各0.5μL，RNase Free dH2O 8.0μL，待检测的样品RNA模板2μL。

2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增

将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行。

3)结果判定

结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。

质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。

结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测新城疫病毒的方法，以实现对新城疫病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。

附图说明

图1：新城疫病毒的实时荧光定量RT-PCR优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；

图2：本发明引物和探针的灵敏度的检测结果图；

图3：本发明引物和探针的特异性检测结果图。

具体实施方式

实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：新城疫病毒检测引物及探针设计与筛选

根据新城疫病毒M基因进行引物设计，通过NCBI查找到899条公开的新城疫病毒的M基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于764-950的碱基(参考序列GenBank登录号：KU665481)为目的片段进行荧光定量检测引物和探针设计。

设计2条上游引物和3条下游引物分别组合筛选最佳引物，为提高引物灵敏度，将上游引物所在区域对应的参考序列第822位碱基设计成简并碱基Y，第825位碱基设计成简并碱基R；将下游引物所在区域对应的参考序列第927位碱基设计成简并碱基R，第933位碱基设计成简并碱基K。引物序列如下：

上游引物NDV-F1：5′-CTCAGTGATGTGCTYGGACC-3′(20bp)

上游引物NDV-F2：5′-CAGTGATGTGCTYGGRCCYTC-3′(23bp)

下游引物NDV-R1：5′-CCAGAGTATCTTGGCKACCTG-3′(21bp)

下游引物NDV-R2：5′-CAGAGTATCTTGGCKACCTG-3′(20bp)

下游引物NDV-R3：5′-CCTGRGGAGAGGCATTTGCTA-3′(21bp)

设计1条探针，为提高探针灵敏度，将探针序列所在区域对应的参考序列第885位碱基设计成简并碱基W，第891位碱基设计成简并碱基Y。探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。修饰后探针序列如下：

NDV-P：5′-FAM-TTCTCWAGCAGYGGGACAGCCT-BHQ1-3′(22bp)

引物和探针形成6个组合进行最佳引物和探针组合筛选。

组合1：NDV-F1、NDV-R1和NDV-P

组合2：NDV-F1、NDV-R2和NDV-P

组合3：NDV-F1、NDV-R3和NDV-P

组合4：NDV-F2、NDV-R1和NDV-P

组合5：NDV-F2、NDV-R2和NDV-P

组合6：NDV-F2、NDV-R3和NDV-P

引物对和探针的筛选包括如下步骤

1)配制荧光定量RT-PCR反应体系

反应液每管25μL，含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μL，5U/μL TaKaRaEx Taq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL，10pmol/μL NDV forward、NDVreverse和NDV probe各0.5μL，RNase Free dH2O 8μL，待检测的样品RNA模板2μL。

2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增

将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。保存文件，运行。

3)结果判定

结果分析条件设定：读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。

质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。

结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。

实验结果表明，相同反应条件，NDV组合3的扩增效率优于其他5个组合，因此将NDV组合3的引物对和探针作为优选，最终确定的引物和探针的序列信息如下：

正向引物NDV forward：5′-CTCAGTGATGTGCTYGGACC-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物NDV reverse：5′-CCTGRGGAGAGGCATTTGCTA-3′(SEQ ID NO:2)

探针NDV probe：5′-TTCTCWAGCAGYGGGACAGCCT-3′(SEQID NO:3)

其中探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。

实施例2：引物探针的检测灵敏度和特异性

检测灵敏度

设置6组不同浓度的新城疫病毒RNA模板，进行荧光定量RT-PCR最适条件下的核酸扩增。

参照RNA提取试剂盒说明书提取新城疫病毒RNA，测定所提取的RNA模板原始浓度，按照比例将模板RNA稀释至1ng/μL，再按照10倍梯度稀释成10^-1ng/μL，10^-2ng/μL，10^-3ng/μL，10^-4ng/μL，10^-5ng/μL，10^-6ng/μL，分别取2μL作为反应模板，按照前述加样方法进行荧光定量RT-PCR核酸扩增。

结果显示本发明设计的引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，检测灵敏度为RNA终浓度10^-4ng/μL。

检测特异性

根据前述反应体系添加各组分，新城疫病毒RNA模板为2μL，非特异性病毒(禽流感病毒，传染性支气管炎病毒)RNA模板分别为2μL。检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s(收集荧光)，40个循环。结果显示，除了新城疫病毒RNA模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线，其他病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明，此方法可以实现对新城疫病毒的特异性检测，不与其他相关病毒发生交叉反应。

实施例3：对实际样品的检测应用

1.样品采集：

采集某活禽批发市场的各类家禽的咽拭子样品共30份，其中鸡、鸭、鹅各10份。采用PBS液(pH7.0～7.4，0.01mol/L)作为保存液(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/mL、制霉菌素1000IU/mL，BSA 5mg/mL)。样品采集后置于加冰的保温箱中密封，24h内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。

2.样品制备

将棉拭子置于装有1mL样品保存液的离心管中，涡旋混匀后，4℃10000r/min离心5min，取上清进行核酸提取。

3.核酸提取

参照RNA提取试剂盒说明书提取待检的30份临床样品、阳性对照和阴性对照RNA。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，长时间保存，须置于-70℃条件下。

4.鉴定

4.1对比方法：参考国家标准《GB/T 16550-2008新城疫诊断技术》中的RT-PCR检测方法，作为对比方法。

4.2样品检测

采用国标方法和本专利方法，同时检测此临床样品。

4.3检测结果

结果显示，采用国标方法鉴定结果为12号样品临床样品扩增产物电泳结果出现目的片段，判定为NDV阳性，其余样品均没有阳性条带；采用本发明中的方法鉴定结果为12号样品临床样品有FAM荧光信号，且Ct小于36，判定为NDV阳性，其余样品均没有荧光信号；阳性对照组均成立，结果准确可信。

综上所述，这30份临床样品中，12号样品可以判定为NDV阳性，其余样品均为阴性。本发明中的方法可以快速、准确的鉴定新城疫病毒，对我国当前流行的新城疫病毒多个亚型均有较高的鉴别准确度，满足了当前对于新城疫病毒检测的需求。

序列表

<120> 一种新城疫病毒的荧光定量RT-PCR检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcagtgatg tgctyggacc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctgrggaga ggcatttgct a 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttctcwagca gygggacagc ct 22

Claims (6)

1.一种检测新城疫病毒引物对和探针组，其特征在于，所述的引物对和探针组对的序列信息如下：

正向引物的序列为SEQ ID NO:1；

反向引物的序列为SEQ ID NO:2；

探针序列为SEQ ID NO:3。

2.如权利要求1所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。

3.权利要求1或2所述的引物对和探针组在制备检测新城疫病毒的制品中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制品为荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

5.一种荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1或2所述的引物对和探针组。

6.一种检测临床样品中新城疫病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)配制荧光定量RT-PCR反应体系

反应液每管25μL，含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μL，5U/μL TaKaRa ExTaq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL，10pmol/μL NDV forward、NDVreverse和NDV probe各0.5μL，RNase Free dH2O 8.0μL，待检测的样品RNA模板2μL；

2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增

将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s收集荧光，40个循环，保存文件，运行；

3)结果判定

结果分析条件设定：读取检测结果；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果；

质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；

结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。