CN109234462A - 一种禽流感病毒的逆转录重组酶介导等温扩增检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测禽流感病毒的方法，以实现对禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。与普通的RT‑PCR法相比，RT‑RAA法是在恒温条件下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间，非常适用于现场应急快速检测。

Description

一种禽流感病毒的逆转录重组酶介导等温扩增检测方法

技术领域

本发明属于禽类病毒检测技术领域，具体一种禽流感病毒的逆转录重组酶介导等温扩增检测方法。

背景技术

禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)为单股负链RNA病毒，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，分为18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。

Perroncito于1878年在意大利首次报道了高致病性禽流感。禽流感现在分布很广，世界各地均有分离该病病原的报道。近5年来全球共向OIE报告5000余起高致病性禽流感疫情和1000余起低致病性禽流感疫情。禽流感的发生给养禽业造成严重危害。禽流感爆发对中国家禽养殖农户的生计造成了巨大的冲击，农户的家禽养殖收入和家庭收入均显著下降。在控制其他变量的条件下，一次禽流感发生会造成农户人均家禽养殖收入平均降低65％，会造成农民人均收入下降29％。

禽流感病毒致病性有高致病性和低致病性之分。同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，在所有HA亚型中，只有H5和H7亚型对禽是高致病性的，称为高致病性禽流感(Highpathogenic avian influenza，HPAI)，该类病毒可引起鸡群100％死亡，被国际兽疫局确定为A类传染病。可见，禽流感的危害已不仅是对养禽业的破坏，还对人类健康构成潜在的威胁。

目前检测禽流感病毒主要是通过实时荧光定量RT-PCR方法和RT-PCR方法，这两种方法均需要精密的实验仪器，且耗时较长，适用于在实验室进行检测，从样品采集、运送至实验室到获得检测结果至少需要一天时间，会延误疫病确认和防控工作。本发明中的检测方法是一种通过逆转录重组酶介导的等温扩增方法，操作简单、用时短，仪器小巧可移动，可在养殖场、活禽交易市场和检疫站等进行该病的现场快速检测，为疫病的早期防控争取宝贵的时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种禽流感病毒的逆转录重组酶介导等温扩增检测方法，以实现对禽流感病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。

本发明首先提供一种检测禽流感病毒引物对和探针组，分别是鉴定禽流感病毒M基因的引物对AIV-M forward、AIV-M reverse和探针组AIV-M probe，其引物对和探针序列信息如下：

正向引物AIV-M forward：

5′-CTCATGGARTGGMTAAAGACAAGACCAAT-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物AIV-M reverse：

5′-AYAAAVCGTCTACGCTGCAGTCCTCGCTCA-3′(SEQ ID NO:2)

探针AIV-M probe：

5′-CACCTCTGACTAAGGGRATTTTAGGRTTTG/i6FAMdT//THF//iBHQ1dT/TCACGCTCACC-3′；

其中探针自5′端起第31位碱基标记FAM发光基团，第31位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第32位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰。

本发明还提供一种用于检测禽流感病毒的制品，所述的制品使用了上述的引物对和探针；

所述的制品，还包含有逆转录重组酶介导等温扩增的试剂。

本发明再一个方面提供检测临床样品中禽流感病毒的通用RT-RAA检测方法，包括如下的步骤：

1)配制RT-RAA反应体系

总体系50μL，含有反应缓冲液25μL，10pmol/μL AIV-M forward和AIV-M reverse各2.1μL，10pmol/μL AIV-M probe 0.6μL，RNase Free dH₂O 15.7μL，醋酸镁2.5μL，RT荧光基础反应单元(包含重组酶、逆转录酶和聚合酶的冻干粉)，待检测的样品RNA模板2μL。

2)RT-RAA反应体系扩增

将检测反应条件设置为：在39℃下恒温扩增20min。

质控标准:阴性对照无扩增曲线，且阳性对照出现扩增曲线，则实验数据有效，否则实验结果视为无效。

结果描述及判定:无扩增曲线，样品判为阴性；出现扩增曲线，样品判为阳性。

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测禽流感病毒的方法，以实现对禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。与普通的RT-PCR法相比，RT-RAA法是在恒温条件下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，不需变温，大大缩短了反应时间，非常适用于现场应急快速检测。

附图说明

图1：禽流感病毒的通用RT-RAA优化的引物和探针设计示意图，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；

图2：本发明引物和探针的灵敏度检测结果图；

图3：本发明引物和探针的特异性检测结果图。

具体实施方式

逆转录重组酶介导等温扩增(Reverse transcription recombinase aidedamplification，RT-RAA)是一种在恒温核酸快速扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。该技术具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现现成快速检测等特点；但该检测方法还需要引物和探针来实现具体的检测目的。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：禽流感病毒通用RT-RAA检测引物及探针设计与筛选

根据禽流感病毒基质蛋白编码基因M基因进行引物设计，通过NCBI查找到1641条公开的禽流感病毒的M基因序列，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，以位于124-275的碱基(参考序列GenBank登录号：KU042441)为目的片段进行荧光定量检测引物和探针设计。同时，RAA方法对引物和探针长度有特定要求，引物长度为30-35bp，探针长度为46-52bp(一般5’端到THF位点至少30个碱基，THF位点到3’端至少15个碱基)，因为引物和探针长度相对较长，还要注意引物探针的GC含量，以及可能影响实验效果的二级结构和引物二聚体等情况，因此，为保证扩增效率，对引物探针的设计和筛选有较高的要求。

设计2条上游引物和2条下游引物分别组合筛选最佳引物，为提高引物灵敏度，将上游引物所在区域对应的参考序列第132位碱基设计成简并碱基R，第136位碱基设计成简并碱基M；将下游引物所在区域对应的参考序列第234位碱基设计成简并碱基V，第238位碱基设计成简并碱基Y。引物序列如下：

上游引物AIV-M-F1：

5′-AGGCTCTCATGGARTGGMTAAAGACAAGACCA-3′(32bp)

上游引物AIV-M-F2：

5′-CTCATGGARTGGMTAAAGACAAGACCAAT-3′(29bp)

下游引物AIV-M-R1：

5′-AYAAAVCGTCTACGCTGCAGTCCTCGCTCA-3′(30bp)

下游引物AIV-M-R2：

5′-TCCATGTTRTTYGGGTCYCCATTCCCATTTAG-3′(32bp)

设计1条探针，为提高探针灵敏度，探针序列所在区域对应的参考序列第174位碱基和第183位碱基均设计成简并碱基R。探针AIV-M-P自5′端起第31位碱基标记FAM发光基团，第31位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第32位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰；修饰后探针序列如下：

AIV-M-P：

5′-CACCTCTGACTAAGGGRATTTTAGGRTTTG/i6FAMdT//THF//iBHQ1dT/TCACGCTCACC[C3-spacer]-3′

2对引物和1条探针两两配对形成4个组合进行最佳引物和探针组合筛选。

组合1：AIV-M-F1、AIV-M-R1和AIV-M-P

组合2：AIV-M-F1、AIV-M-R2和AIV-M-P

组合3：AIV-M-F2、AIV-M-R1和AIV-M-P

组合4：AIV-M-F2、AIV-M-R2和AIV-M-P

引物对和探针的筛选包括如下步骤

1)配制RT-RAA反应体系

总体系50μL，含有反应缓冲液25μL，10pmol/μL AIV-M forward和AIV-M reverse各2.1μL，10pmol/μL AIV-M probe 0.6μL，RNase Free dH₂O 15.7μL，醋酸镁2.5μL，RT荧光基础反应单元(包含重组酶、逆转录酶和聚合酶的冻干粉)，待检测的样品RNA模板2μL。

2)RT-RAA反应体系扩增

将检测反应条件设置为：在39℃下恒温扩增20min。

3)结果判定

质控标准:阴性对照无扩增曲线，且阳性对照出现扩增曲线，则实验数据有效，否则实验结果视为无效。

结果描述及判定:无扩增曲线，样品判为阴性；出现扩增曲线，样品判为阳性。

实验结果表明，相同反应条件，AIV-M组合3的扩增效率优于其他3个组合，因此将AIV-M组合3的引物对和探针作为优选，最终确定的引物和探针的序列信息如下：

正向引物AIV-M forward：

5′-CTCATGGARTGGMTAAAGACAAGACCAAT-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物AIV-M reverse：

5′-AYAAAVCGTCTACGCTGCAGTCCTCGCTCA-3′(SEQ ID NO:2)

探针AIV-M probe：

5′-CACCTCTGACTAAGGGRATTTTAGGRTTTG/i6FAMdT//THF//iBHQ1dT/TCACGCTCACC-3′(SEQ ID NO:3)

实施例2：引物探针的检测灵敏度和特异性

检测灵敏度

设置6组不同浓度的禽流感病毒RNA模板，进行RT-RAA最适条件下的核酸扩增。

参照RNA提取试剂盒说明书提取流感病毒RNA，测定所提取的RNA模板原始浓度，按照比例稀释至1ng/μL，再以10倍梯度稀释成10^-1ng/μL，10^-2ng/μL，10^-3ng/μL，10^-4ng/μL，10^-5ng/μL，10^-6ng/μL，分别取2μL作为反应模板，按照前述加样方法进行RT-RAA核酸扩增。

结果显示本发明设计的引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，检测灵敏度为RNA终浓度10^-3ng/μL。

检测特异性

根据前述反应体系添加各组分，各亚型流感病毒(H1N2亚型禽流感病毒，H3N2亚型禽流感病毒，H4N2亚型禽流感病毒，H5N1亚型禽流感病毒，H5N2亚型禽流感病毒，H5N6亚型禽流感病毒，H6N2亚型禽流感病毒，H7N3亚型禽流感病毒，H9N2亚型禽流感病毒，H10N2亚型禽流感病毒，H11N2亚型禽流感病毒)RNA模板为2μL，非特异性病毒(新城疫病毒，传染性支气管炎病毒)RNA模板分别为2μL。检测反应条件为：39℃恒温扩增20min。结果显示，各亚型流感病毒RNA模板对应的试验组均出现了正常荧光检测曲线，其他非特异性病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明，此方法可以实现对禽流感病毒的特异性检测，不与其他相关病毒发生交叉反应。

实施例3：对实际样品的检测应用

1.样品采集：

采集某活禽批发市场的各类家禽的咽拭子样品共30份，其中鸡、鸭、鹅各10份。采用PBS液(pH7.0～7.4，0.01mol/L)作为保存液(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/mL、制霉菌素1000IU/mL，BSA 5mg/mL)。样品采集后置于加冰的保温箱中密封，24h内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。

2.样品制备

将棉拭子置于装有1mL样品保存液的离心管中，涡旋混匀后，4℃10000r/min离心5min，取上清进行核酸提取。

3.核酸提取

参照RNA提取试剂盒说明书提取待检的30份临床样品、阳性对照和阴性对照RNA。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，长时间保存，须置于-70℃条件下。

4.鉴定

4.1对比方法：参考国家标准《GB/T 19438.1-2004禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》中的荧光RT-PCR检测方法，作为对比方法。根据标准中所注购买了深圳匹基生物工程股份有限公司生产的禽流感病毒通用型荧光RT-PCR检测试剂盒。

4.2样品检测

采用国标方法和本专利方法，同时检测此临床样品。

4.3检测结果

结果显示，采用国标方法鉴定结果为1号、3号、10号、13号、16号和29号样品临床样品有FAM荧光信号，且Ct值均小于36，判定为AIV阳性，其余样品均没有荧光信号；采用本发明中的方法鉴定结果为1号、3号、10号、13号、16号和29号临床样品出现有效的FAM荧光信号，判定为AIV阳性，其余样品均没有荧光信号；阳性对照组两种方法均出现相应的荧光信号，结果准确可信。

综上所述，这30份临床样品中，1号、3号、10号、13号、16号和29号样品可以判定为AIV阳性，其余样品均为阴性。本发明中的方法可以快速、准确的鉴定禽流感病毒，对我国当前流行的多种亚型禽流感病毒都有较高的检测准确度，满足了当前对于禽流感病毒检测的需求。同时，本发明中的方法采用恒温检测技术，操作简单，快速反应，可以实现禽流感病毒的现场快速检测。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种禽流感病毒的逆转录重组酶介导等温扩增检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcatggart ggmtaaagac aagaccaat 29

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ayaaavcgtc tacgctgcag tcctcgctca 30

Claims (5)

1.一种检测禽流感病毒引物对和探针，其特征在于，所述的引物对和探针的序列信息如下：

正向引物AIV-M forward：

5′-CTCATGGARTGGMTAAAGACAAGACCAAT-3′、

反向引物AIV-M reverse：

5′-AYAAAVCGTCTACGCTGCAGTCCTCGCTCA-3′、

探针AIV-M probe：

5′-CACCTCTGACTAAGGGRATTTTAGGRTTTG/i6FAMdT//THF/

/iBHQ1dT/TCACGCTCACC-3′；

其中探针自5′端起第31位碱基标记FAM发光基团，第31位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃THF，第32位碱基标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰。

2.权利要求1所述的引物对和探针在制备检测禽流感病毒的制品中的应用。

3.一种检测禽流感病毒的逆转录重组酶介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1所述的引物对和探针。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含有逆转录重组酶介导等温扩增的试剂。

5.一种检测临床样品中禽流感病毒的通用RT-RAA检测方法，包括如下的步骤：

1)配制RT-RAA反应体系

总体系50μL，含有反应缓冲液25μL，10pmol/μL AIV-M forward和AIV-M reverse各2.1μL，10pmol/μL AIV-M probe 0.6μL，RNase Free dH2O 15.7μL，醋酸镁2.5μL，RT荧光基础反应单元，待检测的样品RNA模板2μL。

2)RT-RAA反应体系扩增

将检测反应条件设置为：在39℃下恒温扩增20min。

质控标准:阴性对照无扩增曲线，且阳性对照出现扩增曲线，则实验数据有效，否则实验结果视为无效。

结果描述及判定:无扩增曲线，样品判为阴性；出现扩增曲线，样品判为阳性。