CN102277454A

CN102277454A - 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒

Info

Publication number: CN102277454A
Application number: CN2011102405422A
Authority: CN
Inventors: 袁秀芳; 王一成; 徐丽华; 李军星; 刘邓
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-08-22
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2011-12-14

Abstract

本发明公开了猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒。所述检测用引物和探针为序列表SEQIDNO：1至SEQIDNO：6，其中序列SEQIDNO：1和SEQIDNO：2分别为检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物和反义引物，序列SEQIDNO：3为检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光探针，序列SEQIDNO：4和SEQIDNO：5分别为检测猪流行性腹泻病毒的正义引物和反义引物，序列SEQIDNO：6为检测猪流行性腹泻病毒的荧光探针。本发明还提供了猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒。本发明所选引物和探针特异性非常强，在猪腹泻物中所提取的病毒总RNA不需要先转录成cDNA，cDNA第一链的合成与双重PCR一步完成，且一次能检测两种病毒，提高效率。

Description

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)是引起仔猪腹泻的主要肠道病毒，二者均属冠状病毒科、冠状病毒属的病毒，单链正股RNA病毒，都能造成肠绒毛的萎缩或变短，均有类似的传染途径和临床症状，感染猪均表现为水样腹泻、呕吐、脱水及新生仔猪的高死亡率。在全世界范围内广泛发生。由于传染性胃肠炎和流行性腹泻的临床表现、病理变化、流行病学等方面都非常相似，但两病原没有共同的抗原性，不能交互免疫，而又有混合感染，因此给这两种病的诊治和预防带来了一定困难。诊断这两种疾病的传统方法有病毒分离、电镜检测、荧光抗体检测、免疫组织化学法等。虽说上述方法能够鉴别诊断这两种病，但由于实验方法的限制，导致检测耗时过长，无法在病毒感染初期进行诊断。近年来，随着分子生物学的发展，反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)在PEDV和TGEV检测方面的应用越来越广泛，与传统的方法相比较，RT-PCR方法更加敏感、快速、方便，但步骤繁杂、假阳性较多、缺乏准确定量、灵敏度不够高等妨碍了RT-PCR在实际临床中的应用。1995年美Perkin Elmer公司研制出新的实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术，从而一举解决了常规PCR的诸多不足之外，使PCR技术得到更新和发展，从而广泛地应用于临床以及其它相关核酸的研究。

本发明首次将荧光RT-PCR技术应用于同时检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测领域，提供了针对猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的特异性引物、探针序列、试剂盒和检测方法。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的核苷酸序列，包括引物和探针。

本发明要解决的第二个技术问题是提供快速、准确、使用方便的检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的引物和探针，具体如下：

通过序列比较，根据猪传染性胃肠炎病毒TGEV Miller M6株N基因的序列（GenBank：DQ811785），在其保守区27832-27938位置设计一对引物及一条探针：

1）TGEV正义引物（TGEV-F） 5'ACAATTCCTTCAGCAGATTAATGC3' （SEQ ID NO：1）；

2）TGEV反义引物（TGEV-R）5'CCTCTTGCTCTGACCTTTCTG3' （SEQ ID NO：2）；

3）TGEV探针（TGEV-probe）5'(JOE) ATGCTCGYCCATCAGAAGTGGCAAA (TAMARA) 3'（SEQ ID NO：3），该探针的5’端标记报告荧光基团JOE，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；

其中，Y代表兼并碱基T或C；扩增目的片段为107bp。

通过序列比较，根据猪流行性腹泻病毒PEDV CV777株N基因的序列(GenBank：AF353511)，在其保守区27163-27348位置设计一对引物及一条探针：

4）PEDV正义引物（PEDV-F）5’AACAAATCCAGGGCCACTT3’ （SEQ ID NO：4）；

5）PEDV反义引物（PEDV-R）5’TAAACTGGCGATCTGAGCA3’ （SEQ ID NO：5）；

6）PEDV 探针（PEDV-probe）

5’ (FAM) TCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAAT (TAMARA) 3’ （SEQ ID NO：6），该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA ；

扩增目的基因大小为186bp。

本发明还提供了一种猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，由以下组分组成：

1）RNA提取试剂；通常可以使用商业购买的RNA提取试剂盒或按照常规方法来提取RNA，所述的试剂盒例如Qiagen公司的RNA提取试剂盒（QIAamp Viral RNA Mini kit，cat.no 52906）；

2）RNA标准品：为猪传染性胃肠炎病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No：9；和猪流行性腹泻病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No：12；

3）实时定量RT-PCR反应液，其包括：含有dNTP的RT-PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶，反转录酶，荧光定量PCR参比染料；检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物、反义引物和荧光探针，检测猪流行性腹泻病毒的正义引物、反义引物和荧光探针，

优选为：1×含有dNTP的RT-PCR缓冲液，检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物0.2µM、反义引物0.2µM和荧光探针0.4µM，检测猪流行性腹泻病毒的正义引物0.2µM、反义引物0.2µM和荧光探针0.4µM，Taq DNA聚合酶2U，反转录酶5U，1×荧光定量PCR参比染料；

进一步地，所述含有dNTP的RT-PCR缓冲液为One Step RT-PCR Buffer，购自Takra，货号DRR064，其组成为dNTP，5mM；MgCL₂，5mM；KCl，80mM；Tris-HCl，20mM；0.2% Triton X-100。所述反转录酶为PrimeScriptTMRT Enzyme MixⅡ购于大连宝生物公司(Takra)，货号DRR064，所述Taq DNA聚合酶可以是TaKaRa Ex TaqTM HS，购自大连宝生物公司(Takra)，货号DRR064。所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye购自大连宝生物公司，货号DR0X01，所述引物和探针均委托大连宝生物公司合成；

4）阴性对照：DEPC水；

5）DEPC水；1mL x2管，自来水两次蒸馏，经过Millipore 纯水仪纯化，电阻率大于18.0MΩ.CM。

其中，检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物为序列表SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No：3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团JOE，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；检测猪流行性腹泻病毒的正义引物为序列表SEQ ID No：4所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：5所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No：6所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。

本发明还提供了一种猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒的使用方法：

1. 样品采集、运送及制备

具有腹泻症状的猪场，用50mL离心管收集腹泻物，置于4℃保鲜盒中，运送回实验室。腹泻粪便用0.01M PBS液稀释成10％的悬液，4000rpm离心20 min，取上清140μL。-70℃冻存备用。

2. RNA提取

按照QIAGEN® Viral RNA Mini试剂盒提供的方法提取病毒RNA，具体方法如下：

（1）取560μl 缓冲液AVL 移入到1.5ml 离心管中；

（2）加入140μl细胞毒，在漩涡振荡器上混匀（15s），室温（15℃-20℃）放置10分钟后瞬离；

（3）加入560μl无水乙醇，在漩涡振荡器上混匀（15s），开盖前瞬离；

（4）小心取出630μl上述混合物，转移至柱子（事先放进2ml收集管中），8000rpm离心1min，弃去收集管，把柱子放进新的2ml收集管；

（5）重复步骤4）；

（6）小心打开柱子，加入500μl 缓冲液AW1，8000rpm离心1min，弃去收集管，把柱子放进新的2ml收集管；

（7）小心打开柱子，加入500μl 缓冲液AW2，14000rpm离心3min，弃去收集管，把柱子放进新的2ml收集管，继续14000rpm离心1min；

（8）把柱子放进1.5ml 离心管（无RNA酶）中，弃去收集管，小心打开盖子，加入60μl缓冲液AVE，盖上盖子，室温放置1min，8000rpm离心1min，弃去柱子，1.5ml 离心管中即为病毒RNA。

3. 实时定量RT-PCR反应：

96孔PCR板，第一排12孔作为标准曲线和阴性对照孔，其余为样品检测孔。

反应体系为20μL，见表1：

表1

其中，含有dNTP的RT-PCR缓冲液为One Step RT-PCR Buffer，Taq DNA聚合酶为TaKaRa Ex Taq^TM HS，反转录酶为PrimeScript^TMRT Enzyme MixⅡ，荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye。

所述的模板RNA ，如果是制作标准曲线，用体外转录的RNA标准品作为模板，浓度为10¹~10⁸，如果是样品检测，用腹泻物提取的RNA为模板，阴性对照模板为DEPC水，

检测条件为：在ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为50℃ 30分钟，然后经过95℃10秒钟，60℃30秒钟40个循环。

本发明的优点是：

（1）本发明所述试剂盒能够直接从猪腹泻物中检测病毒是否存在，样品采集比较方面。

（2）本发明所述试剂盒可以RT-PCR一步完成，节约时间和成本。

（3）本方法在一个PCR管中同时检测两种病毒，大大提高了检测效率，并能做到鉴别诊断两种病毒。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。

实施例1、试剂盒的组成

一、试剂盒的组成

1）RNA提取试剂；Qiagen公司的RNA提取试剂盒（QIAamp Viral RNA Mini kit，cat.no 52906）；

3）实时定量RT-PCR反应液，其包括：1×含有dNTP的RT-PCR缓冲液，检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物0.2µM、反义引物0.2µM和荧光探针0.4µM，检测猪流行性腹泻病毒的正义引物0.2µM、反义引物0.2µM和荧光探针0.4µM，Taq DNA聚合酶2U，反转录酶5U，1×荧光定量PCR参比染料；

其中，所述RT-PCR缓冲液为One Step RT-PCR Buffer，购自Takra，（DRR064），所述反转录酶为PrimeScript^TMRT Enzyme MixⅡ购于大连宝生物公司(Takra)，（DRR064），所述Taq DNA聚合酶可以是TaKaRa Ex Taq^TM HS，购自大连宝生物公司(Takra)，（DRR064）。所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye购自大连宝生物公司，货号（DR0X01），所述引物和探针均委托大连宝生物公司合成；

4）阴性对照：DEPC水；

二、RNA标准品的制备

通过序列比较，根据的TGEV Miller M6株N基因序列（GenBank：DQ811785），在其保守区27682-28027位置设计一对引物：

上游引物TGEV- T7 (F)：

5'*GGAAGGGAGGGGATTAATACGACTCACTATAGGG*CCATCTGTGTCTAGCATTTT3'，（SEQ ID No：7）；

下游引物TGEV-T7(R) 5'TCTCGTTTAGTTCGTTACCT3'（SEQ ID No：8）；

其中“* *”内部碱基序列代表T7启动子位置，扩增目的片段大小为346bp，见序列表SEQ ID No：9所示的核苷酸序列。

通过序列比较，根据PEDV CV777株N基因的序列(GenBank：AF353511)，在其保守区27059-27394位置设计一对引物：

上游引物PEDV-T7(F)

5'*AGGAGAGGGAACTAATACGACTCACTATAGGG*GACAGGCATAAGCAACAGCA3'，（SEQ ID No：10）；

下游引物PEDV-T7(R) 5' GAACAGCCACATTACCACCA3'（SEQ ID No：11）；

其中“* *”内部碱基序列代表T7启动子位置，扩增目的片段大小为336bp，见序列表SEQ ID No：12所示的核苷酸序列。

利用Qiagen公司的RNA提取试剂盒（QIAamp Viral RNA Mini kit，cat.no 52906），从冻存的TGEV和PEDV疫苗毒（购自哈尔滨兽医研究所维科公司）提取病毒RNA，反转录成cDNA，并以此为模板，分别以PEDV(F)和PEDV-T7(R) 、TGEV-T7(F) 和TGEV-T7(R) 为上下游引物扩增目的基因，得到336bp和346bp大小的DNA片段，经DNA纯化试剂盒纯化后连接到大连宝生物公司购买的pMD18-T载体中，转化Top10感受态细胞，筛选出阳性克隆，送Invitrogen公司测序验证，验证后以此阳性质粒为模板大量扩增DNA，并纯化，测其浓度和纯度。-20℃保存，用于体外转录。

根据Ambion公司T7体外转录试剂盒（MEGAshortscript TM Kit， AM1354）提供的方法进行操作。20μl反应体系：2μL T7缓冲液，ATP、CTP、GTP、UTP (75 mM)各2μL，转录用DNA（不超过8μg），2μL转录酶混合物，最后加灭菌水至20μL；37℃作用2～3小时；加入TURBO Dnase 1μL，37℃作用15min，去除反应体系中的DNA；反应结束后加入115μL无核酸酶的灭菌水和15μL醋酸铵反应终止液，用酚：氯仿抽提纯化RNA，核酸蛋白分析仪测其纯度和浓度，最后-70℃冻存，做标准品备用。

实施例2利用RNA标准品建立标准曲线

根据上述已经测出的RNA(TGEV-N-T7/PEDV-N-T7)的浓度，利用公式：（6.02 x 1023拷贝数/摩尔) x (浓度g/ml) x10^-3 / (MW g/mol) = 拷贝/μL，分别计算出TGEV -N-T7和PEDV-N-T7拷贝数，共同十倍稀释，以10³～10⁷拷贝/μl的RNA为模板，在ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应，反应体系为20μL，其中2x One Step RT-PCR Buffer 10μL，TaKaRa Ex Taq^TMHS(5U/μL) 0.4μL，PrimeScript^TMRT Enzyme MixⅡ 0.4μL，PEDV-F和TGEV-F(10μM)各0.4μL，PEDV-R和TGEV-R (10μM)各 0.4μL，PEDV-Probe和TGEV- Probe (10μM) 各0.8μL，ROX Reference Dye (50x) 0.4μL，模板RNA 2μL，DDW至25μL。反应条件为50℃ 30分钟，然后经过95℃10秒钟，60℃30秒钟40个循环。利用软件对数据进行分析，得到标准曲线。其R值分别为0.994587（PEDV）、0.997931（TGEV）。

实施例3、试剂盒的特异性试验

1材料，见表2：

病毒	来源
		猪流行性腹泻病毒	哈尔滨兽医研究所维科公司
猪传染性胃肠炎病毒	哈尔滨兽医研究所维科公司
		猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒	上海海利生物药品有限公司
猪圆环病毒	浙江省农科院畜牧兽医研究所猪病组分离鉴定保存
		猪伪狂犬病毒	武汉科前动物生物制品有限责任公司
猪细小病毒	购于中国兽药监察所
		猪瘟病毒	南京天邦猪瘟细胞苗
猪乙型脑炎病毒	湖南亚华种业股份有限公司生物药厂
		猪轮状病毒	浙江省农科院畜牧兽医研究所猪病组分离鉴定保存

2 方法：

利用本发明所述的试剂盒使用方法对猪常见病毒病进行检测，同时以10⁵浓度的体外转录RNA为阳性控制，验证其特异性。

3 结果

本发明试剂盒对7种猪常见病毒病进行检测，只有阳性控制出现扩增曲线，结果表明，本发明试剂盒特异性良好。

实施例4 试剂盒的敏感性检测

为了验证本发明试剂盒的检测敏感性，以10倍稀释的RNA标准品（2×100～2×10⁷拷贝/μL）为模板，每个稀释度的模板分别加2μL，同时设阴性对照，按照所建立的方法，在定量PCR仪上进行扩增反应，得出动力学曲线和标准曲线，当模板为2×10拷贝/μL 时，其CT值仍在可检测范围内（CT<40），表明本实验所建立的方法最低能检测到2×10拷贝/μL的R NA。

实施例5 批间重复和批内重复

为了检验本发明所述的TaqMan多重荧光定量RT-PCR试剂盒检测TGEV和PEDV方法的稳定性，进行了批间重复实验和批内重复实验，最后利用统计学方法对所得数据进行分析处理，结果显示TGEV和PEDV Ct值变异系数CV%均不超过2%（表1，2），从而表明该检测方法具有很好的稳定性。

表3检测4份不同批次试剂盒批间重复检测结果

	1	2	3	4
					PEDV Mean Ct±S.D	18.66±0.01	17.91±0.04	17.18±0.04	19.60±0.01
变异系数CV(%)	0.03	0.22	0.22	0.07
					TGEV Mean Ct±S.D	17.24±0.16	17.73±0.14	16.77±0.16	18.99±0.27
变异系数CV(%)	0.9	0.8	0.9	1.4

表4检测4份不同批次试剂盒批内重复检测结果

	1	2	3	4
					PEDV Mean Ct±S.D	18.70±0.05	19.00±0.01	18.94±0.06	17.51±0.10
变异系数CV(%)	0.3	0.03	0.3	0.6
					TGEV Mean Ct±S.D	17.12±0.34	17.42±0.12	16.19±0.17	18.55±0.06
变异系数CV(%)	2.0	0.7	1.0	0.3

实施例6临床验证

利用本发明TaqMan双重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，对从浙江7个县市采集到的176份猪腹泻粪样品进行TGEV和PEDV的检测，同时设阴阳性对照。检测结果为： 176份腹泻粪样品中PEDV阳性172份，阳性率为97.7%；TGEV阳性11份，阳性率为6.3%；混合感染11份，与TGEV感染相同；而PEDV/TGEV含量小于<100copies/μl的样品分别有24和9份。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成TGEV正义引物（TGEV-F）

<400> 1

acaattcctt cagcagatta atgc 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成TGEV反义引物（TGEV-R）

<400> 2

cctcttgctc tgacctttct g 21

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成TGEV探针（TGEV-probe）

<400> 3

atgctcgycc atcagaagtg gcaaa 25

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成PEDV正义引物（PEDV-F）

<400> 4

aacaaatcca gggccactt 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成PEDV反义引物（PEDV-R）

<400> 5

taaactggcg atctgagca 19

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成PEDV 探针（PEDV-probe）

<400> 6

tcaaagacat cccagagtgg aggagaat 28

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成上游引物TGEV-T7(F)

<400> 7

ggaagggagg ggattaatac gactcactat agggccatct gtgtctagca tttt 54

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成下游引物TGEV-T7(R)

<400> 8

tctcgtttag ttcgttacct 20

<210> 9

<211> 346

<212> DNA

<213> TGEV体外转录的RNA片段对应的DNA序列

<400> 9

ggaagggagg ggattaatac gactcactat agggccatct gtgtctagca ttttgtttgg 60

aagctattgg acttcaaagg aagatggcga ccagatagaa gtcacgttca cacacaaata 120

ccacttgcca aaggatgatc ctaaaactga acaattcctt cagcagatta atgcctatgc 180

tcgcccatca gaagtggcaa aagaacagag aaaaagaaaa tctcgttcta aatctgcaga 240

aaggtcagag caagaggtgg tacctgatgc attaatagaa aattacacag atgtgtttga 300

tgacacacag gttgagatga ttgatgaggt aacgaactaa acgaga 346

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成上游引物PEDV- T7 (F)

<400> 10

aggagaggga actaatacga ctcactatag gggacaggca taagcaacag ca 52

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成下游引物PEDV-T7(R)

<400> 11

gaacagccac attaccacca 20

<210> 12

<211> 336

<212> DNA

<213> PEDV体外转录的RNA片段对应的DNA序列

<400> 12

aggagaggga actaatacga ctcactatag gggacaggca taagcaacag cagaagccta 60

agcaggaaaa gtctgacaac agcggaaaaa atacacctaa gaagaacaaa tccagggcca 120

cttcgaagga acgtgacctc aaagacatcc cagagtggag gagaattccc aagggcgaaa 180

atagcgtagc agcttgcttc ggacccaggg ggggcttcaa aaattttgga gatgcggaat 240

ttgtcgaaaa aggtgttgac gcgtcaggct atgctcagat cgccagtttg gcaccaaatg 300

ttgcagcatt gctctttggt ggtaatgtgg ctgttc 336

Claims

1.一组检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的核苷酸引物和探针，其特征在于，所述核苷酸引物和探针为序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3为检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光探针，序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5分别为检测猪流行性腹泻病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：6为检测猪流行性腹泻病毒的荧光探针。

2.根据权利要求1所述的检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的核苷酸引物和探针，其特征在于：所述探针SEQ ID NO：3的5’端标记报告荧光基团JOE，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。

3.根据权利要求1所述的检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的核苷酸引物和探针，其特征在于：所述探针SEQ ID NO：6的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。

4.一种猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：

1）RNA提取试剂；

3）实时定量RT-PCR反应液，其包括：含有dNTP的RT-PCR缓冲液，检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物、反义引物和荧光探针，检测猪流行性腹泻病毒的正义引物、反义引物和荧光探针，Taq DNA聚合酶，反转录酶，荧光定量PCR参比染料；

4）阴性对照：DEPC水；

5）DEPT水；

5.根据权利要求4所述的猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA提取试剂为RNA提取试剂盒。

6.根据权利要求4所述的猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述实时定量RT-PCR反应液包括：1×含有dNTP的RT-PCR缓冲液，检测猪传染性胃肠炎病毒的正义引物0.2µM、反义引物0.2µM和荧光探针0.4µM，检测猪流行性腹泻病毒的正义引物0.2µM、反义引物0.2µM和荧光探针0.4µM，Taq DNA聚合酶2U，反转录酶5U，1×荧光定量PCR参比染料。

7.根据权利要求6所述的猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述含有dNTP的RT-PCR缓冲液为One Step RT-PCR Buffer，所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye，所述Taq DNA聚合酶为TaKaRa Ex Taq ^TM HS，所述反转录酶为PrimeScript^TMRT Enzyme MixⅡ。