CN106957924A - 一种能同时检测和鉴别猪繁殖呼吸综合征和猪流感的检测试剂盒及引物和探针 - Google Patents

一种能同时检测和鉴别猪繁殖呼吸综合征和猪流感的检测试剂盒及引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能同时检测和鉴别猪繁殖呼吸综合征和猪流感的检测试剂盒及引物和探针。所述引物和探针如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：27所示。本发明还公开了快速、准确、使用方便的同时检测和鉴别北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV‑NA)、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV‑EU)和猪流感病毒(SIV)的一步法多重荧光RT‑PCR检测试剂盒。本发明的检测方法可以实现一次采样，一次分析，可同时检测和区分3种重要猪病的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成疫病的检测，为疾病防治赢得时间。

Description

一种能同时检测和鉴别猪繁殖呼吸综合征和猪流感的检测试 剂盒及引物和探针
技术领域
本发明涉及一种可同时检测和鉴别北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-NA)、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-EU)和猪流感病毒的一步法多重荧光RT-PCR检测试剂盒及引物和探针，可实现一次采样，一次分析，同时检测和区分3种猪病毒的目的，属于检验检疫领域。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪流感病毒(SIV)是引起猪呼吸道疾病的主要常见病原，经常混合感染，给诊断和防治带来困难，是危害养猪业最为严重的几种病原。猪繁殖与呼吸综合征和猪流感被世界动物卫生组织(OIE)规定为跨界传播病原，也是我国动物及动物产品国际贸易中重要的检疫对象。
目前，针对上述几种猪病病原建立了多种分子检测技术，如PCR和荧光PCR技术等，在这些疫病的诊断和防控中发挥了重要作用。但目前所建立的方法多是针对一种病原的单目标检测，在实际检测中需要重复多次，才能完成检测不同病原的目的，检测工作量大且时间长，不能满足大批量动物检疫快速通关的实际需要。且难以实现实际样品中大量存在的混合感染以及症状相似疫病的鉴别诊断。在建立单目标病原检测技术的同时，各国兽医机构也相继研制了可同时检测牛常见病毒的多重PCR，但传统PCR技术灵敏度低、结果不易判定等缺点限制了其在多重检测中的应用。
本研究利用荧光PCR技术在核酸检测方面具有的特异、敏感等特性，建立了PRRAV-NA、PRRSV-EU、SIV三种猪病毒一步法多重荧光RT-PCR检测和鉴别方法并组装成试剂盒，可以实现一次采样，一次分析，可同时检测和区分3种重要猪病的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成疫病的检测，为疾病防制赢得时间。
发明内容
本发明的第一个目的是提供特异性强、灵敏度高的同时检测和鉴别北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-NA)、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-EU)和猪流感病毒(SIV)的多重荧光RT-PCR引物和探针。
本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的同时检测和鉴别北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-NA)、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-EU)和猪流感病毒(SIV)的一步法多重荧光RT-PCR检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
在序列比对分析的基础上，针对北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因和猪流感病毒M基因，分别设计并筛选能覆盖大部分分离株又适合多重检测并能进行鉴别的引物和探针(序列见表1)。北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-NA)引物对由3条正向引物、3条反向引物和2条探针组成，欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-EU)引物对由4条正向引物、5条反向引物和2条探针组成，猪流感病毒引物对由4条正向引物、3条反向引物和1条探针组成，多重反应体系中引物混合物是这22条引物组成的混合物，探针是这5条探针组成的混合物，经过一步法多重荧光RT-PCR反应，可以实现三种病原的同时检测和鉴别。
表1猪繁殖与呼吸综合征病毒(包括北美型和欧洲型)和猪流感病毒的一步法多重荧光RT-PCR检测引物和探针
注：胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)。简并碱基W代表A或T，简并碱基Y代表C或T，简并碱基R代表G或A，简并碱基S代表C或G。探针5‘端标记有发光集团，探针3‘端标记有淬灭基团。
我们采用多重荧光PCR技术建立了同时检测和鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒(包括北美型和欧洲型)和猪流感病毒的检测方法并组装了试剂盒。
检测和鉴别北美型猪繁殖呼吸综合征病毒、欧洲型猪繁殖呼吸综合征病毒和猪流感病毒的一步法多重荧光RT-PCR检测试剂盒，包括上述多重荧光RT-PCR检测引物和探针。进一步地，该试剂盒还包括完成多重荧光RT-PCR反应所需的材料和试剂，例如，反应缓冲液、酶、阳性对照、阴性对照等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述反应液为Multiplex RT-PCR反应缓冲液；所述酶为Multiplex酶；所述阴性对照为无核酸灭菌水；所述阳性对照分别为北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-NA)N基因、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-EU)N基因、猪流感病毒(SIV)M基因的体外反转录cRNA。
本发明还提供了一种检测和鉴别北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒的一步法多重荧光RT-PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)提取病毒总核酸；
(2)配制RT-PCR反应体系，其中，所述反应体系中包含上述的多重荧光RT-PCR引物和探针；
(3)进行一步法多重荧光RT-PCR反应；
(4)结果判定；
①质控标准：
阳性对照均有S形扩增曲线，CT值大约在20左右，阴性对照无扩增信号。
满足此条件，视为此次试验有效。
②结果判断：
有扩增曲线，且CT值在30以下的判定为阳性；
有扩增曲线，但30<CT值<35的，属于疑似区间，需要重新确认；
没有扩增曲线或者CT值大于35的，判定为阴性。
本发明的优点是：1)多重性：可同时检测并区分猪流感病毒、北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒及欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，节约了检测时间和成本，有利于疫病特别是混合感染的及时确诊。2)灵敏：此多重荧光RT-PCR体系可以同时检测三种病原，其特异性与单个荧光RT-PCR相当。3)特异：设计引物和探针时充分考虑了病原之间可能存在的干扰，经过筛选保证了引物和探针的特异性和排他性。3)涵盖性和通用性好：本发明中设计的引物和探针都分别针对猪流感病毒和猪繁殖与呼吸道综合征病毒最保守的基因设计，可以实现每种病毒不同亚型或血清型之间的通用检测。对于每个病毒，其引物和探针都是多条，而且包含了简并引物，基本上覆盖了Genebank中现有该种病毒的所有序列。4)简便、易自动化：所有引物和探针的设计都是从可以进行多重检测考虑，不管是DNA或RNA病毒，都可以使用该一步法程序，省却了反转录过程，省时省力。
附图说明
图1：PRRSV-NA单荧光RT-PCR标准曲线。
图2：PRRSV-EU单荧光RT-PCR标准曲线。
图3：SIV单荧光RT-PCR标准曲线。
图4：PRRSV-NA,PRRSV-EU和SIV多重荧光RT-PCR标准曲线。
图5：PRRSV-NA单荧光RT-PCR与多重荧光RT-PCR的比较。
图6：PRRSV-EU单荧光RT-PCR与多重荧光RT-PCR的比较。
图7：SIV单荧光RT-PCR与多重荧光RT-PCR的比较。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1试剂盒的组成和使用
1.试剂盒的配制组成
表2试剂盒的组成
组份(50Tests/kit) 数量
2×Multiplex RT-PCR缓冲液 600μL×1管
Multiplex酶 60μL×1管
引物混合物 90μL×1管
PRRSV-NA探针 12μL×1管
PRRSV-EU探针 42μL×1管
SIV探针 32μL×1管
PRRSV-NA阳性对照 60μL×1管
PRRSV-EU阳性对照 60μL×1管
SIV阳性对照 60μL×1管
阴性对照 60μL×1管
DEPC处理水 500μL×1管
其中2×Multiplex RT-PCR缓冲液和Multiplex酶购自AB公司产品Path-ID TMMultiplex one-step RT-PCR kit。
引物混合物包括PRRSV-NA的3条正向引物、3条反向引物，PRRSV-EU的4条正向引物、5条反向引物以及SIV的4条正向引物和3条反向引物，引物序列如表1，混合引物的工作浓度为400nM，引物委托大连宝生物公司合成。
PRRSV-NA探针包括PRRSV-NA的2条探针、PRRSV-EU探针包括PRRSV-EU的2条探针，SIV探针包括1条SIV探针，探针序列如表1，浓度分别为200nM，探针委托大连宝生物公司合成。
阴性对照为无核酸灭菌水。
PRRSV-NA阳性对照为北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-NA)N基因的体外反转录cRNA；PRRSV-EU阳性对照为欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-EU)N基因的体外反转录cRNA；SIV阳性对照为猪流感病毒(SIV)M基因的体外反转录cRNA。
北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-NA)N基因体外转录RNA的制备：回收北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1株N基因的RT-PCR扩增产物，长度为372bp，与pGEM-T载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-PRRSV-NA-N。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNAProduction System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNAse除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到PRRSV-NA病毒N基因的体外转录RNA，命名为PRRSV-NA-N-cRNA；猪繁殖与呼吸道综合征病毒JXA1株N基因序列如序列表中SEQ ID NO：28所示。
欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-EU)N基因体外转录RNA的制备：回收欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的RT-PCR扩增产物，长度为387bp，与pGEM-T载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-PRRSV-EU-N。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNAse除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到PRRSV-EU病毒N基因的体外转录RNA，命名为PRRSV-EU-N-cRNA；欧洲型猪繁殖与呼吸道综合征病毒N基因序列如序列表中SEQ ID NO：29所示。
猪流感病毒M基因体外转录RNA的制备：回收猪流感病毒A/swine/2003(H1N1)株M基因的RT-PCR扩增产物，长度为982bp，与pGEM-T载体(购自PromeGA公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-SIV-M。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTMLarge Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNAse除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到猪流感病毒M基因的体外转录RNA，命名为SIV-M-cRNA；猪流感病毒A/Swine/2003(H1N1)株M基因序列如序列表中SEQ IDNO：30所示。
2.试剂盒的使用方法
1)病毒总核酸(RNA/DNA)的提取
病毒核酸的提取采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(TIANamp Virus DNA/RNAKit)，步骤如下：
Carrier RNA溶液的配制：
(1)Carrier RNA储存液：向装有310μg Carrier RNA冻干粉的管子中加入310μLRNase-Free ddH2O，将Carrier RNA彻底溶解，得到终浓度为1μg/μL的溶液，并分装、置于-20℃储存。
(2)Carrier RNA工作液：根据样品的数量计算所需缓冲液GB和Carrier RNA溶液的体积(计算公式如下)，将缓冲液GB与Carrier RNA溶液颠倒混匀，即得到Carrier RNA工作液；为避免溶液出现起泡现象，请勿使用涡旋振荡。
计算公式：
n×0.22mL＝y mL
y mL×28μL/mL＝zμL
式中n＝同时提取的样品个数，y＝需要加入缓冲液GB的体积，z＝需要加入Carrier RNA溶液的体积。
操作步骤：
(1)用移液器将20μL Proteinase K加入一个干净的1.5ml离心管中。
(2)向离心管中加入200μL血浆/血清/淋巴液或25mg磨碎的组织(样品需平衡至室温)，如果样本体积小于200μL，可加入0.9％NaCl溶液补充。
(3)加入200μL Carrier RNA工作液，盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀。
(4)56℃孵育15min，简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。
(5)加入250μL无水乙醇，涡旋振荡15sec，彻底混匀，在室温(15-25℃)放置5min。
(6)简短离心，以收集附着在管壁及管盖的液体。
(7)将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱CR2(吸附柱放在收集管中)，盖上管盖，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
(8)小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。
(9)小心打开吸附柱盖子，加入600μL溶液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，盖上管盖，静置2min，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。
(10)重复步骤(9)。
(11)小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，8,000rpm(～6,000×g)离心1min，弃废液。
(12)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液。
(13)将吸附柱放入一个新的RNase-Free离心管(1.5ml)中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干。向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150μLRNase-FreeddH2O，盖上盖子，室温放置5min。
(14)12,000rpm(～13,400×g)离心1min，收集到的即为病毒总核酸(DNA或RNA)。
2)荧光RT-PCR检测
分别取检测样品、阳阴性对照，按照下表3配制反应体系：
表3一步法多重荧光RT-PCR反应体系：总体积20uL
混合液组份 体积(uL) 终浓度(nM)
2×Multiplex RT-PCR缓冲液 10 1×
Multiplex酶混合液 1 1×
引物混合物 1.6 400
PRRSV-NA探针 0.2 200
PRRSV-EU探针 0.8 200
SIV探针 0.6 200
模板RNA 1
DEPC处理水 4.8
反应总体积 20
将混合液充分混合后，最后加入模板，简短离心，按照下列反应程序，进行一步法荧光RT-PCR反应，见表4：
表4多重荧光RT-PCR反应程序
3)结果描述及判定
①质控标准：
阳性对照均有S形扩增曲线，CT值大约在20左右，阴性对照无扩增信号。
满足此条件，视为此次试验有效。
②结果判断：
有扩增曲线，且CT值在30以下的判定为阳性；
有扩增曲线，但30<CT值<35的，属于疑似区间，需要重新确认；
没有扩增曲线或者CT值大于35的，判定为阴性。
实施例2、试剂盒的敏感性试验
1、材料
猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒均由本实验室保存。
2、方法
1)阳性标准品的制备
如实施例1所述的方法。
2)标准品定量测定
取制备好的体外转录cRNA用无RNA酶的灭菌水分别作200倍稀释，用紫外分光仪测定其260nm和280nm的吸光度值(OD260和OD280)，计算待测样品的浓度与纯度。纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0(＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存)。RNA样品的浓度(μg/μL)：OD260×稀释倍数×40/1000。同时根据测序结果，利用DNAMAN(Version 6)推算出RNA和DNA的分子量(MW)，并按以下公式计算拷贝数(Copies/μL)＝(6.02×1023Copies/mol)×(浓度μg/μL)/(MW g/mol)。
标准曲线绘制：
将PRRSV-NA体外标准品进行10倍梯度稀释后进行荧光RT-PCR，用模板浓度倒数与对应的荧光CT值做浓度标准曲线，PCR扩增效率E值、相关系数R2值和曲线斜率Slope值都落在可接受范围内，说明扩增效率良好。见图1。
将PRRSV-EU体外标准品进行10倍梯度稀释后进行荧光RT-PCR，用模板浓度倒数与对应的荧光CT值做浓度标准曲线，PCR扩增效率E值、相关系数R2值和曲线斜率Slope值都落在可接受范围内，说明扩增效率良好。见图2。
将SIV体外标准品进行10倍梯度稀释后进行荧光RT-PCR，用模板浓度倒数与对应的荧光CT值做浓度标准曲线，PCR扩增效率E值、相关系数R2值和曲线斜率Slope值都落在可接受范围内，说明扩增效率良好。见图3。
将PRRSV-NA、PRRSV-EU和SIV体外标准品等量混合后，再进行10倍梯度稀释，进行多重荧光RT-PCR，用模板浓度倒数与对应的荧光CT值做浓度标准曲线，PCR扩增效率E值、相关系数R2值和曲线斜率Slope值都落在可接受范围内，说明多重PCR之间没有互相干扰，扩增效率良好。见图4。
3)一步法多重荧光RT-PCR方法检测极限的确定
将上述定量的RNA溶液调整为浓度大致相当，每种各取10μL，充分混匀后，制成阳性标准品。将该标准品10倍梯度稀释后，按最佳条件进行荧光RT-PCR检测，最高稀释倍数所能检测出的CT值所对应的的浓度即为最低检测限。
3、结果
1)RNA溶液拷贝数测定结果
将制备好的体外转录RNA，分别用紫外分光仪测定其260nm和280nm的吸光度值并推算出拷贝数，详见下表5。
表5RNA纯度及含量测定
2)多重荧光RT-PCR方法检测限的确定
利用建立的多重荧光RT-PCR检测方法，对10倍系列稀释的阳性标准品进行检测，结果该方法可稳定检测到的最高CT值为35，所对应的的标准品浓度达到1-10拷贝数/反应。
实施例3、试剂盒的特异性试验
1材料
本试验中所用到的病毒如表6。
表6特异性试验研究过程中应用到的病毒和核酸
2、方法
2.1分别用猪流感病毒、北美型猪繁殖与呼吸道综合征病毒和欧洲型猪繁殖与呼吸道综合征病毒的引物和探针对表格中的其他8种病毒核酸进行荧光RT-PCR检测，以验证引物和探针的特异性。
2.2利用建立的多重荧光RT-PCR检测方法对表格中的9种病毒进行检测，验证多重荧光RT-PCR方法的特异性。
2.3进行单荧光RT-PCR与多重荧光RT-PCR的比较。
3、结果
3.1每种病毒的引物和探针只能从自己的病毒核酸中扩增出曲线，其他病毒模板的扩增均为阴性，表明所设计的引物和探针特异性良好。
3.2利用建立的多重荧光RT-PCR方法对表格6中的病毒进行检测，结果猪流感病毒、北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒有扩增曲线，其它病毒均无特异性的扩增信号，表明所建立的方法特异性良好。
表7特异性检测结果
3.3将PRRSV-NA、PRRSV-EU和SIV体外标准品等量混合后，再进行10倍梯度稀释，分别进行多重荧光RT-PCR和PRRSV-NA单荧光PCR，将相同模板浓度对应的荧光CT值进行比较，求解回归方程，二者之间相关系数R2值达到了0.9979，说明单荧光RT-PCR和多重荧光RT-PCR之间符合性良好，多重荧光RT-PCR没有产生干扰，没有影响扩增效率。见图5。
将PRRSV-NA、PRRSV-EU和SIV体外标准品等量混合后，再进行10倍梯度稀释，分别进行多重荧光RT-PCR和PRRSV-EU单荧光PCR，将相同模板浓度对应的荧光CT值进行比较，求解回归方程，二者之间相关系数R2值达到了0.9987，说明单荧光RT-PCR和多重荧光RT-PCR之间符合性良好，多重荧光RT-PCR没有产生干扰，没有影响扩增效率。见图6。
将PRRSV-NA、PRRSV-EU和SIV体外标准品等量混合后，再进行10倍梯度稀释，分别进行多重荧光RT-PCR和SIV单荧光PCR，将相同模板浓度对应的荧光CT值进行比较，求解回归方程，二者之间相关系数R2值达到了0.9969，说明单荧光RT-PCR和多重荧光RT-PCR之间符合性良好，多重荧光RT-PCR没有产生干扰，没有影响扩增效率。见图7。
实施例4：试剂盒对临床样品检测的实验报告
1、材料
实验室收集的已知PRRSV-NA试验性感染血液样品45份、血液样品80份和组织样品53份。
2、方法
对实验室收集的已知PRRSV-NA试验性感染血液样品45份、血液样品80份和组织样品53份进行多重荧光RT-PCR检测，用实际样品验证方法的敏感性和特异性。
3、结果
临床样品的检测结果如表8。由表8可知，45份PRRSV-NA阳性感染样品可检测到PRRSV-NA阳性45份，而PRRSV-EU和SIV的检测均为阴性。80份血样样品中，原来已知PRRSV-NA样品44份，本次检测出PRRSV-NA阳性43份，PRRSV-EU1份，SIV阳性1份，由于之前保存的血样只做了PRRSV-NA检测，所以从中再检出SIV和PRRSV-EU阳性是极有可能的。同样，53份组织样品中，原来已知SIV阳性的28份，本次检测出SIV阳性28份，检测出PRRSV-NA阳性3份。这些结果表明本专利申请的多重荧光RT-PCR与临床样品的检测性符合率较高，而且检测到了原来靠单一荧光RT-PCR没有进行筛查的非目标病原，检出了混合感染，避免了漏检。
表8临床样品的检测结果
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种能同时检测和鉴别猪繁殖呼吸综合征和猪流感的检测试剂盒及引物和探针
<130>
<160> 30
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 1
ccagccwgtc aatcagctgt 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 2
ccagccggtc aatcagct 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 3
ccagccagtc aaccagct 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 4
ggcttctccg ggtttttctt y 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 5
ggcttctccg ggcttttct 19
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 6
gggcttctcc gggtttttat tc 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成探针
<400> 7
cggtcccttg cctctggac 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成探针
<400> 8
ccggtccctt rcctctrgac t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 9
ccagccagtc aatcaactgt g 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 10
gccagtcagt caatcaactg tg 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 11
ccagccagtc aatcagctgt 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 12
gccagtcagt caatcagctg t 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 13
tcatcttcwg cagccaggg 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 14
tcatcttcag cagccaaggg 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 15
tcatcttcag cagctagggg a 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 16
tcatcttcag cagctaaggg aaa 23
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 17
tcatcttcag cggccagg 18
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成探针
<400> 18
tgatraartc ccagcgccag c 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成探针
<400> 19
atgataaggt cccagcgcca g 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 20
cctgtcacct ctgactaagg g 21
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 21
atcctgtcac ctctgactaa agg 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 22
atcttgtcac ctctgactaa ggg 23
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 23
cctgtcacct ctgaccaagg 20
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 24
cgtctacgct gcagtcctc 19
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 25
cgtctacgct gwagtcctcg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成引物
<400> 26
cgtctacgtt gcagtcctcg 20
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成探针
<400> 27
acgctcaccg tgccsag 17
<210> 28
<211> 372
<212> DNA
<213> 猪繁殖与呼吸道综合征病毒JXA1株N基因序列
<400> 28
atgccaaata acaacggcaa gcagcaaaag aaaaagaagg ggaatggcca gccagtcaat 60
cagctgtgcc aaatgctggg taagatcatc gcccaacaaa accagtccag aggcaaggga 120
ccggggaaga aaaataggaa gaaaaacccg gagaagcccc atttccctct agcgactgaa 180
gatgacgtca ggcatcactt tacccctagt gagcggcaat tgtgtctgtc gtcgatccag 240
actgccttca atcagggcgc tggaacttgt gccctgtcag attcagggag gataagttac 300
actgtggagt ttagtttgcc gacgcaacat actgtgcgtc tgatccgcgc cacagcatca 360
ccctcagcgt ga 372
<210> 29
<211> 387
<212> DNA
<213> 欧洲型猪繁殖与呼吸道综合征病毒N基因序列
<400> 29
atggccggta aaaaccagag ccagaagaaa aagaaaagta cagctccgat ggggaatggc 60
cagccagtca atcaactgtg ccagttgctg ggtgcaatga taaagtccca gcgccagcaa 120
cctaggggag gacaggccaa aaagaaaaag cctgagaagc cacattttcc cctggctgct 180
gaagatgaca tccggcacca cctcacccag actgaacgct ccctctgctt gcaatcgatc 240
cagacggctt tcaatcaagg cgcaggaact gcgtcgcttt catccagtgg gaaggtcagt 300
tttcaggttg agttcatgct gccggttgct catacagtgc gcctgattcg cgtgacttct 360
acatccgcca gtcagggtgc aagttaa 387
<210> 30
<211> 982
<212> DNA
<213> 猪流感病毒A/Swine/2003(H1N1)株M基因序列
<400> 30
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtat gttctctcta tcgttccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tagcgcagag actcgaagat gtgtttgcag ggaaaaacac cgatcttgaa 120
gcactcatgg aatggttaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
cagaatgccc taaatgggaa tggtgatccg aacaacatgg acaaagcggt caaactgtac 300
agaaaactta aaagggaaat aacattccac ggggccaaag aagtagcgct cagttactct 360
gctggtgcac ttgccagttg catgggcctc atatacaaca gaatggggac tgtcaccgct 420
gaggtggcct ttggtctagt atgcgcaacc tgtgaacaaa ttgctgattc ccagcatcga 480
tctcatagac aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca ggcatgagaa cagaatggta 540
ctagccagca caacagctaa agccatggaa caaatggctg gatcaagtga acaagcagca 600
gaggctatgg aggttgctag ccaggctaga caaatggtac aggcaatgag aacaattggg 660
actcacccta gttccagtgc tggtctaaaa gatgatcttc ttgaaaatct acaggcctat 720
cagaaacgaa tgggagtgca aatgcaacga ttcaagtgat cctctcattg ctgccgcaag 780
catcattggg attttgcacc tgatattgtg gattcttgat cgtctttttt tcaaatgcat 840
ttaccatcac tttaaatatg gtcgaaaaag agggccttct acggaaggag tgccggagtc 900
catgagggaa gaatatcggc agaaacagca gagtgctgtg gatgttgacg atggtcattt 960
tgtcaacata gtgctagagt aa 982

Claims (7)

1.一组用于同时检测和鉴别北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒的一步法多重荧光RT-PCR引物和探针，其特征在于，所述引物和探针分别为：
用于检测北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒的3条正向引物，如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示，3条反向引物，如序列表SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6所示，和2条探针，如序列表SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：8所示；
用于检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的4条正向引物，如序列表SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：12所示，5条反向引物，如序列表SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：17所示，和2条探针，如序列表SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：19所示；
用于检测猪流感病毒的4条正向引物，如序列表SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：23所示，3条反向引物，如序列表SEQ ID NO：24至SEQ ID NO：26所示，和1条探针，如序列表SEQ IDNO：27所示。
2.根据权利要求1所述的一步法多重荧光RT-PCR引物和探针，其特征在于，所述用于检测北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒的探针的5‘端标记FAM，3‘端标记BHQ1；所述用于检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的探针的5‘端标记HEX，3‘端标记BHQ1；所述用于检测猪流感病毒的探针的5‘端标记Cy5，3‘端标记BHQ2。
3.一种同时检测和鉴别北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的一步法多重荧光RT-PCR引物和探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-PCR反应缓冲液、酶、阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照分别为北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因、猪流感病毒M基因的体外反转录cRNA。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应缓冲液为MultiplexRT-PCR反应缓冲液，所述酶为Multiplex酶。
7.一种同时检测和鉴别北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒的检测方法，其特征在于：该方法包括：
(1)提取病毒总核酸；
(2)配制RT-PCR反应体系，其中，所述反应体系中包含权利要求1或2所述的多重荧光RT-PCR引物和探针；
(3)进行一步法多重荧光RT-PCR反应；
(4)结果判定。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110735005A (zh) * 2019-11-26 2020-01-31 广西大学 Siv和prrsv多重rt-pcr快速检测试剂盒及引物
CN111500598A (zh) * 2020-05-08 2020-08-07 华南农业大学 一种检测欧洲型prrsv抗体效价的试剂盒及检测方法
CN112195273A (zh) * 2020-09-08 2021-01-08 华南农业大学 一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的试剂盒
CN113913559A (zh) * 2021-11-25 2022-01-11 江苏立华牧业股份有限公司 一种荧光定量检测prrsv的试剂、其应用于prrsv分型的检测方法
CN117844988A (zh) * 2024-03-06 2024-04-09 赛锐思生物技术(吉林)有限公司 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-qPCR检测引物、试剂盒及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102373296A (zh) * 2011-08-04 2012-03-14 河南农业大学 PRRSV、SIV H9亚型与PCV2多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法
CN102943129A (zh) * 2012-11-30 2013-02-27 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 一种用于同时检测5种猪病病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针
CN105936944A (zh) * 2016-04-22 2016-09-14 浙江省检验检疫科学技术研究院 Csfv、prrsv和siv h1亚型的三重荧光rt-pcr检测试剂盒及引物、探针

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102373296A (zh) * 2011-08-04 2012-03-14 河南农业大学 PRRSV、SIV H9亚型与PCV2多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法
CN102943129A (zh) * 2012-11-30 2013-02-27 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 一种用于同时检测5种猪病病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针
CN105936944A (zh) * 2016-04-22 2016-09-14 浙江省检验检疫科学技术研究院 Csfv、prrsv和siv h1亚型的三重荧光rt-pcr检测试剂盒及引物、探针

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "GenBank登录号：KC862552.1", 《NCBI GENBANK》 *
NCBI: "GenBank登录号：KP860912.1", 《NCBI GENBANK》 *
XIJU SHI等: "A multiplex real-time PCR panel assay for simultaneous detection and differentiation of 12 common swine viruses", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
王洪光等: "猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立", 《猪业科学》 *
罗俊等: "双重RT-PCR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒", 《中国预防兽医学报》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110735005A (zh) * 2019-11-26 2020-01-31 广西大学 Siv和prrsv多重rt-pcr快速检测试剂盒及引物
CN110735005B (zh) * 2019-11-26 2023-01-10 广西大学 Siv和prrsv多重rt-pcr快速检测试剂盒及引物
CN111500598A (zh) * 2020-05-08 2020-08-07 华南农业大学 一种检测欧洲型prrsv抗体效价的试剂盒及检测方法
CN112195273A (zh) * 2020-09-08 2021-01-08 华南农业大学 一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪繁殖与呼吸综合征病毒检测的试剂盒
CN113913559A (zh) * 2021-11-25 2022-01-11 江苏立华牧业股份有限公司 一种荧光定量检测prrsv的试剂、其应用于prrsv分型的检测方法
CN117844988A (zh) * 2024-03-06 2024-04-09 赛锐思生物技术(吉林)有限公司 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-qPCR检测引物、试剂盒及其应用
CN117844988B (zh) * 2024-03-06 2024-05-14 赛锐思生物技术(吉林)有限公司 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-qPCR检测引物、试剂盒及其应用

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