CN113913559A

CN113913559A - 一种荧光定量检测prrsv的试剂、其应用于prrsv分型的检测方法

Info

Publication number: CN113913559A
Application number: CN202111409738.XA
Authority: CN
Inventors: 尹丽萍; 张凯云; 丁小燕; 刘岳龙; 程立力
Original assignee: Jiangsu Lihua Animal Husbandry Stock Co ltd
Current assignee: Jiangsu Lihua Animal Husbandry Stock Co ltd
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2041-11-25
Also published as: CN113913559B

Abstract

本发明涉及一种荧光定量检测PRRSV的试剂、其应用于PRRSV分型的检测方法，所述的试剂包括引物组和探针组，引物组中，鉴定美洲型的引物对序列如SEQ NO.1‑2所示；鉴定欧洲型的引物对序列如SEQ NO.3‑4所示。探针组中，鉴定美洲型的探针序列如SEQ NO.5所示，鉴定欧洲型的引物序列如SEQ NO.6所示。本发明针对PRRSV美洲株、欧洲株分别保守序列，建立多重TaqMan荧光定量RT‑PCR技术，提供PRRSV美洲型和欧洲型分别通用的双通道分型检测方法，为猪场流行病学调查、病原排毒情况跟踪等提供重要的技术保障。

Description

一种荧光定量检测PRRSV的试剂、其应用于PRRSV分型的检测方法

技术领域

本发明涉及一种PRRSV实时荧光定量RT-PCR分型检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是以母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道疾病为主要症状的一种高度接触性、高死亡率传染病，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起，对养猪业造成了重大损失，已成为严重威胁我国养猪业发展的重要传染病之一。PRRSV只有一个血清型，依据其遗传进化的差异可分为欧洲型(I型)和美洲型(II型),目前我国流行毒株主要以美洲株为主，也存在一定比例的欧洲株。

PRRSV主要通过呼吸道在猪群间进行水平传播，易感猪也会因接触污染了的运输工具、器械受到感染。带毒的公猪精液也是本病传播的一个重要因素，为防止公猪精液带毒，目前在规模化养殖场PRRSV检测是公猪的必检一项。猪感染PRRSV后2～14周在病猪的鼻腔、尿液及粪便中均可检测到病毒，仔猪感染PRRSV后，病毒血症会存在1～2周。

PRRSV存在广泛又快速的基因变异，不断积累将进一步导致病毒某些生物学特性的改变。加上国内疫苗株毒株种类繁多，猪场的盲目选择和频繁更换疫苗加快导致各类毒株之间的相互重组变异，变异后毒株有强有弱，强毒株会对养猪业造成极大影响，使得猪群死亡率大幅升高，弱毒株则在猪群长期带毒，久治不愈，慢性消耗。国内各大学者对我国PRRSV分子流行病学研究是基于NSP2、GP5等基因系统进化树分析的，结果表明，近几年HP-PRRSV毒株在国内流行毒株中所占比例最高，类NADC30毒株所占比例具有逐年上升的趋势，而类CH-1a这类经典毒株所占比例越来越少的流行规律。

但也有研究显示，我国部分地区类NADC30毒株已取代HP-PRRSV毒株成为新的优势毒株，虽然我国不同地域的蓝耳毒株流行情况有差异，但是都存在不同类型PRRSV流行毒株的多个基因不同模式、不同程度的变异。当然包括编码M、N蛋白的保守基因也会存在不同程度变异，这极易导致实际检测过程中发生漏检。

申请号CN 201010602083.3专利公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测的方法，该发明适于猪繁殖与呼吸综合征美洲型毒株和欧洲型毒株的检测，但是该方法为通用型检测引物，无法快速区分鉴定猪只为美洲型还是欧洲型毒株的感染，加上该方法采用普通RT-PCR检测，实验室诊断时间较长。申请号为CN 103725793 A的专利申请文件公开了检测PRRSV的多重荧光定量RT-PCR方法及其应用，该方法可同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、HP-PRRSV及高致病性蓝耳活疫苗TJ-F92株，具有特异性强，敏感性高、自动化程度高优点；申请号CN 102220435 A的专利申请文件公开了一种实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株的方法，结果显示可以将PRRSV同PRRSV变异株(NSP2 1594-1680缺失)以及猪类其他易感病毒区分开，且灵敏度可达到0.47TCID50，但是以上2种荧光定量RT-PCR专利文件中涉及的方法均对PRRSV的欧洲型的毒株检测没有覆盖。

因此，实际应用中需要找到检测出所有PRRSV核酸的检测方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种荧光定量检测PRRSV的试剂、其应用于PRRSV分型的检测方法，针对PRRSV美洲株、欧洲株分别保守序列，建立多重TaqMan荧光定量RT-PCR技术，提供PRRSV美洲型和欧洲型分别通用的双通道分型检测方法，为猪场流行病学调查、病原排毒情况跟踪等提供重要的技术保障。

为解决上述技术问题，本发明是这样实现的：

荧光定量检测PRRSV的试剂应用于PRRSV分型的检测方法，包含如下步骤：

(1)样本中RNA的提取：

对待测样本进行信息记录后，进行前处理，使用提取试剂盒进行RNA提取。

(2)配制荧光定量PCR反应体系：

所述体系为20ul体系，其中包括一步法qRT-PCR Mix 11ul；

美洲株通用型引物各0.25ul，探针引物0.125ul；

欧洲株通用型引物各0.25ul,探针引物0.125ul；模板7ul。

上述荧光定量检测PRRSV的试剂，包括：

一种用于PRRSV实时荧光定量PCR的美洲型和欧洲型分型引物对，其中鉴定美洲型的引物对如序列如SEQ NO.1-2所示；鉴定欧洲型的引物序列如SEQ NO.3-4所示。

一种用于PRRSV实时荧光定量PCR的美洲型和欧洲型分型探针组，其中鉴定美洲型的探针序列如SEQ NO.5所示，鉴定欧洲型的引物序列如SEQ NO.6所示。

引物序列：

SEQ NO.1 5’gccagccagtcaatcagctgtgc 3’

SEQ NO.2 5’cgcctgatccgcgtcacagcat 3’

SEQ NO.3 5’gtaaaaaccagagccagaag 3’

SEQ NO.4 5’agtttatgctgccggttgct 3’

SEQ NO.5 5’F-cccggagaagccccattttcct-Q 3’

SEQ NO.6 5’F-ctgtgccagttgctgggtgc-Q 3’。

作为本发明的进一步限定，SEQ NO.5和SEQ NO.6中F代表报告基团包括但不限于FAM、HEX、VIC、Cy5中任一种，但反应中两条序列报告基团不重复，其中Q代表淬灭基团包括但不限于BHQ或TAMRA。

(3)荧光定量RT-PCR反应体系扩增：

所述扩增体系程序为50℃、15min；95℃、30min；95℃、10s；60℃、30s，40个循环。

(4)结果判定：根据实验结果判定，具体如下:

阳性对照：CT值FAM,27-28；HEX,27-28；阴性对照：无CT值。

样本结果：

	阳性对照	阴性对照	样本CT值	结果判定及措施
					情况一	成立	成立	无CT值	阴性
情况二	成立	成立	CT≤36	阳性
					情况三	成立	成立	36<CT≤38	可疑，可复检
情况四	成立	成立	CT>38	阴性，可复检。
					情况五	成立	不成立	/	实验不成立，样本可能存在污染，重检。
情况六	不成立	成立	/	实验不成立，扩增存在问题，重检。

本发明有以下积极的效果：

(1)本发明提供一种PRRSV实时荧光定量RT-PCR分型检测方法，可同步检测并区分鉴定美洲株和欧洲株，灵敏度高、特异性好。

(2)本发明荧光定量检测PRRSV的试剂，针对动脉炎病毒mRNA合成的特点，结合非编码区保守位点设计引物，可以极大增加检测广谱性，降低漏检风险的同时提高检测灵敏度。

附图说明

图1美洲株灵敏度实验荧光扩增曲线图；

图2欧洲株灵敏度实验荧光扩增曲线图；

图3美洲株、欧洲株特异性荧光扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。

实施例1扩增体系的优化

(1)退火温度的优化：采用20ul的反应体系，退火温度设置为55、56、58、59、59.5、60、60.5、61、61.5、62、64℃的10个温度梯度,结果最佳退火温度为60℃。

(2)引物浓度优化：采用20ul的反应体系，上下游引物终浓度从0.125pmol、0.25pmol、0.5pmol、0.625pmol共5个浓度梯度，扩增后分别统计Ct值和ΔR值，结果两对引物最佳终浓度均为0.25pmol。

(3)探针浓度优化：采用20ul的反应体系，探针浓度从0.075pmol、0.125pmol、0.25pmol、0.325pmol、0.5pmol分别5个浓度梯度，扩增后分别统计Ct值和ΔR值，结果两条探针引物最佳终浓度均为0.125pmol。

实施例2特异性试验

以重组质粒DNA作为标准的阳性对照。JEV(猪乙型脑炎病毒)、CSFV(猪瘟病毒)、PEDV(猪流行性腹泻病毒)、PRV(伪狂犬病毒)、PCV2(圆环2型病毒)、PPV(细小病毒)等基因组核酸作为其他毒株模板，无菌水作为阴性对照；

使用罗氏96实时荧光定量PCR仪进行扩增，以验证所建立方法的特异性，如图3，从图中可以获悉：本方法能特异性检测美洲株(实线)和欧洲株(虚线)，而JEV、CSFV、PEDV、PRV、PCV2、PPV等病原核酸无特异性等扩增。

实施例3灵敏性试验

阳性克隆质粒：阳性克隆质粒由北京爱科博生物技术有限公司合成并测序，测序结果与GenBank上公布的序列无误后，采用全自动酶标仪测定质粒的浓度和纯度，置-20℃保存备用。

以重组质粒为标准阳性样品，分别做10倍的倍比稀释，每个模板浓度作3个平行样品。根据已经建立的反应体系和反应参数进行相应的扩增，通过观察扩增曲线来确定检测到重组质粒的最低拷贝数，对反应体系的灵敏性进行评价，如图1美洲株、图2欧洲株。

实施例4重复性试验

以10³copies/ul-10⁷copies/ul浓度的质粒,每个稀释度设置3个重复平行样进行试验,按每个稀释度所得的Ct值计算平均数、标准差和变异系数。若变异系数小于5％,证明重复性良好，如表1。

表1

实施例5与市售试剂盒灵敏度的对比实验

(1)实验材料

采用国内外7个厂家，8个的蓝耳活疫苗，分别是瑞普生物R98株、普莱柯生物CH-1R株、南农高科R98株、普莱柯生物JXA1-R株、青岛易邦TJM-F92株、中牧实业R98株、硕腾TJM-F92株、勃林格VR2332株，分别对样本编号为1-8号，按每头份100ul的体积的量初步稀释，稀释好后取100ul样本，10倍倍比稀释，将10^^-4-10^^-7的浓度作为阳性对照检测，使用本发明检测方法与市售试剂盒同步检测。

(2)实验设备

反转录和扩增酶为诺唯赞MIX，罗氏8连管，罗氏96实时荧光定量PCR仪。

(3)实验步骤：

提样：取上述稀释好的10^^-4-10^^-7的梯度的疫苗稀释后样本各200ul，分别提取RNA。

体系配制：一步法qRT-PCR Mix(购自诺唯赞生物科技股份有限公司)11ul，美洲株通用型引物各0.25ul，探针引物0.125ul；欧洲株通用型引物各0.25ul，探针引物0.125ul；模板7ul。

扩增：程序为50℃15min；95℃30min，95℃10s，60℃30s，45个循环。

(4)实验结果：

由表1可以看出本发明检测方法在检测各个毒株时的灵敏度较市售试剂盒(Thermo Fis her Applied Biosystems,REF4468465)CT值低1～3，表明本发明方法的灵敏度高2～10倍，如表2。

表2

实施例6临床应用

为评估江苏部分猪场蓝耳病原流行情况，采用上述实施例1的具体方法,2020年4季度对江苏3个猪场的临床样进行监测评估，共监测样本671份，总阳性率为16.39％。

其中场1总检测217份，病原总阳性率27.18％(59/217)，其中美洲株阳性率24.42％，欧洲株阳性率3.69％，同时感染两种血清型的比例为1.38％(3/217)。

场2总检测247份，病原总阳性率19.43％(48/247)，其中美洲株阳性率17.0％(42/247)，欧洲株阳性率2.43％(6/247)，同时感染两种血清型的比例为0％。

场3总检测207份，病原总阳性率1.45％(3/207)，全为美洲株，未监测到欧洲株。

上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏立华牧业股份有限公司

<120> 一种荧光定量检测PRRSV的试剂、其应用于PRRSV分型的检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccagccagt caatcagctg tgc 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcctgatcc gcgtcacagc at 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaaaaacca gagccagaag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtttatgct gccggttgct 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccggagaag ccccattttc ct 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgtgccagt tgctgggtgc 20

Claims

1.一种荧光定量检测PRRSV的试剂，其特征在于，用于PRRSV实时荧光定量PCR的美洲型和欧洲型分型，所述的检测试剂包括引物组和探针组；

引物组中，鉴定美洲型的引物对如序列如SEQ NO.1-2所示；鉴定欧洲型的引物序列如SEQ NO.3-4所示；

探针组中，鉴定美洲型的探针序列如 SEQ NO.5所示，鉴定欧洲型的引物序列如SEQNO.6所示；

SEQ NO.1 5’gccagccagtcaatcagctgtgc 3’

SEQ NO.2 5’cgcctgatccgcgtcacagcat 3’

SEQ NO.3 5’gtaaaaaccagagccagaag 3’

SEQ NO.4 5’agtttatgctgccggttgct 3’

SEQ NO.5 5’F-cccggagaagccccattttcct-Q 3’

SEQ NO.6 5’F-ctgtgccagttgctgggtgc-Q 3’。

2.根据权利要求1所述的荧光定量检测PRRSV的试剂，其特征在于，所述SEQ NO.5和SEQNO.6中F代表报告基团包括但不限于FAM、HEX、VIC、Cy5中任一种，但反应中两条序列报告基团不重复，其中Q代表淬灭基团包括但不限于BHQ或TAMRA。

3.根据权利要求1所述的荧光定量检测PRRSV的试剂，其特征在于，引物组和探针组的浓度如下：

美洲株通用型引物终浓度0.25 pmol，探针引物终浓度0.125pmol；

欧洲株通用型引物终浓度0.25 pmol, 探针引物终浓度0.125pmol；模板7ul。

4.权利要求1所述的荧光定量检测PRRSV的试剂用于检测PRRS美洲型和欧洲型分型的应用。

5.权利要求4所述的应用，其特征在于，检测所针对的样本包括：猪血液/血清、唾液、精液、鼻肛拭子；以及肺脏、淋巴结、脾脏或者扁桃体的组织病料。

6.权利要求4所述的应用，其特征在于，包含如下步骤：

（1）样本中RNA的提取：

对待测样本进行信息记录后，进行前处理，使用提取试剂盒进行RNA提取，得到样品核酸；

（2）配制荧光定量PCR反应体系：

所述体系为20 ul体系，其中包括一步法qRT-PCR Mix 11 ul，

美洲株通用型引物各0.25 ul，探针引物0.125 ul；

欧洲株通用型引物各0.25 ul,探针引物0.125 ul；模板7 ul；

（3）荧光定量RT-PCR反应体系扩增：所述扩增体系程序为50℃、15 min ；95℃、30 min；95℃、10s；60℃、30s，45个循环，实时记录PCR扩增过程中的荧光信号；

（4）结果判定：根据实验结果判定，阳性对照：CT值 FAM,27-28; HEX,27-28；阴性对照：无CT值。