CN112094953B - 用于同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的试剂盒及引物和探针 - Google Patents

用于同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的试剂盒及引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病毒检测领域，具体讲，涉及一种用于同时检测牛轮状病毒，牛病毒性腹泻病毒和牛冠状病毒的试剂盒及引物和探针。试剂盒中引物和探针的核苷酸序列如SED ID NO:1～SEQ ID NO:9所示。本发明的试剂盒具有操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，可以同时实现对BVDV、BRV和BCoV的定性检测和准确定量的技术优势。

Description

用于同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒 的试剂盒及引物和探针
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，具体讲，涉及一种用于同时检测牛轮状病毒，牛病毒性腹泻病毒和牛冠状病毒的试剂盒及引物和探针。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)的病原，主要引起牛的病毒性腹泻病，临床主要表现为发热、粘膜糜烂、溃疡、白细胞减少、持续感染、咳嗽及怀孕母牛流产或产生畸形胎儿等，除主要感染牛外，该病毒还可引起羊、猪、鹿和多种野生动物的感染，呈现世界性分布，对各国畜牧业造成巨大的经济损失。
牛轮状病毒(Bovine rotavirus，BRV)又称犊牛腹泻病毒(Calf diarrheavirus)，属于呼肠孤病毒科(Reoviridea)轮状病毒属(Rotavirus)。牛轮状病毒主要感染1月龄以内的犊牛，其中1周龄以内犊牛最为易感，主要症状包括食欲废绝、精神萎顿、水样腹泻、甚至死亡，其严重程度可以分为无症状感染、温和的自限性腹泻及严重脱水和电解质失衡的重度腹泻，犊牛感染该病毒后的发病率可高达90％～100％，犊牛感染病毒后，容易继发引起细菌感染，促使犊牛的死亡率升高，同时也会严重影响犊牛的生长发育进而影响生产性能，此外轮状病毒也可以感染人、绵羊、仔猪、犬、猫、鸡、马、兔、恒河猴和鼠等动物。犊牛腹泻是造成养牛业损失的重要原因之一，给牛肉和奶制品生产也造成了直接和间接经济损失。
牛冠状病毒(Bovine Coronavirus，BCoV)属于冠状病毒科，冠状病毒属2a亚群，是引起新生犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道感染的重要病原。流行病学调查表明，牛冠状病毒在牛场中普遍存在，主要通过消化道和呼吸道传播，感染的牛长期带毒并在一定时期内持续排毒，易造成牛群的大范围感染。因此，对带毒牛的及时检出和牛场环境监测就显得尤为重要。
引起犊牛腹泻有很多的病原，且随着养牛业的发展，大规模和集约化的饲养增加了牛与牛之间的身体接触，从而加速传染病的传播，由BVDV、BRV和BCoV引起的单重或混合感染对养牛业影响极为严重，目前国内外尚无针对BVDV、BRV和BCoV感染治疗的特效药物，奶业发达国家应用灭活疫苗或减毒疫苗预防本病，而我国尚无相关商品化疫苗。因此，需建立该病毒快速敏感的检测方法，并对我国部分地区奶牛场的BCoV流行情况进行调查，及早发现BVDV、BRV和BCoV感染的牛，掌握流行病学数据，以便及时采取更有效的针对性措施进行防控，以减少该病毒对养牛业造成的经济损失。因此实验室检测显得尤为重要。除此之外，目前这三种病毒的主要诊断方法包括分离鉴定、血清中和试验、ELISA技术、PCR、实时荧光定量PCR技术等。病毒分离鉴定是经典技术方法，不过该方法操作繁琐，诊断花费时间较长；血清中和试验和ELISA技术操作简单、特异性较强、应用广泛，不过该方法检测时有严格的要求，因为误差而有可能会引起阳性率下降；传统的PCR技术是1985年研发出来的，不过传统的PCR技术无法对模板DNA定量，并且最后结果是通过电泳辅助才能判读，操作时间相对长，并且会出现假阳性；1993年Higuchi等人发明了实时荧光定量PCR技术，是将荧光物质与传统PCR技术结合起来，让扩增产物发出荧光。该技术综合了光谱技术、传统的PCR技术和计算机技术，其灵敏度高，特异性强，并且可以监测PCR扩增的所有过程，还能对样品准确定量，可同时检测三种病毒感染情况，省时省力。已有的PCR扩增技术尚存在敏感性、特异性不足的缺陷。鉴于此，特提出本发明。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种用于同时检测牛轮状病毒，牛病毒性腹泻病毒和牛冠状病毒的试剂盒
本发明的第二发明目的在于提供用于同时检测牛轮状病毒，牛病毒性腹泻病毒和牛冠状病毒及引物和探针。
本发明的第三发明目的在于提供分别含有牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛冠状病毒的基因片段的重组质粒。
为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：
本发明提出一种用于同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒中含有核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有用于检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的引物和探针；用于检测牛病毒性腹泻病毒的上游引物的核苷酸序列如SED ID NO:1所示、下游引物如SEQ ID NO:2所示、探针如SEQ ID NO:3所示；用于检测牛轮状病毒的上游引物的核苷酸序列如SED ID NO:4所示、下游引物如SEQ IDNO:5所示、探针如SEQ ID NO:6所示；用于检测牛冠状病毒的上游引物如SED ID NO:7所示、下游引物如SEQ ID NO:8所示、探针如SEQ ID NO:9所示。
可选的，所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。可选的，所述SEQ ID NO:3的荧光基团选自HEX、荧光淬灭基团选自BHQ1；所述SEQ ID NO:6的荧光基团选自ROX、荧光淬灭基团选自BHQ2；所述SEQ ID NO:9的荧光基团选自CY5、荧光淬灭基团选自BHQ3。
可选的，在所述核酸扩增试剂中，SED ID NO:1所示上游引物的浓度为240～720nmol/L、SEQ ID NO:2所示下游引物的浓度为240～720nmol/L、SEQ ID NO:3所示探针的浓度为240～720nmol/L；优选的，SED ID NO:1所示上游引物的浓度为480nmol/L、SEQ IDNO:2所示下游引物的浓度为480nmol/L、SEQ ID NO:3所示探针的浓度为480nmol/L；在所述核酸扩增试剂中，SED ID NO:4所示上游引物的浓度为200～600nmol/L、SEQ ID NO:5所示下游引物的浓度为200～600nmol/L、SEQ ID NO:6所示探针的浓度为200～600nmol/L；优选的，SED ID NO:4所示上游引物的浓度为400nmol/L、SEQ ID NO:5所示下游引物的浓度为400nmol/L、SEQ ID NO:6所示探针的浓度为400nmol/L；在所述核酸扩增试剂中，SED IDNO:7所示上游引物的浓度为240～720nmol/L、SEQ ID NO:8所示下游引物的浓度为240～720nmol/L、SEQ ID NO:9所示探针的浓度为140～420nmol/L；优选的，SED ID NO:7所示上游引物的浓度为480nmol/L、SEQ ID NO:8所示下游引物的浓度为480nmol/L、SEQ ID NO:9所示探针的浓度为280nmol/L。
可选的，所述核酸扩增试剂中还含有2X One Step RT-PCR BufferⅢ、TaKaRa ExTaq HS和PrimeScript RT Enzyme MixⅡ；优选的，TaKaRa Ex Taq HS的浓度为5U/μL。
可选的，所述试剂盒中含有用于定量的参考品，所述参考品中含有三种重组质粒，所述三种重组质粒为分别含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的重组质粒；优选的，所述试剂盒中含有阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照中含有三种重组质粒，所述三种重组质粒为分别含有SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的重组质粒。
本发明还涉及一种用于同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的引物和探针，用于检测牛病毒性腹泻病毒的上游引物的核苷酸序列如SED ID NO:1所示、下游引物如SEQ ID NO:2所示、探针如SEQ ID NO:3所示；用于检测牛轮状病毒的上游引物的核苷酸序列如SED ID NO:4所示、下游引物如SEQ ID NO:5所示、探针如SEQ ID NO:6所示；用于检测牛冠状病毒的上游引物如SED ID NO:7所示、下游引物如SEQ ID NO:8所示、探针如SEQ ID NO:9所示；优选的，所述SEQ ID NO:3的荧光基团选自HEX、荧光淬灭基团选自BHQ1；所述SEQ ID NO:6的荧光基团选自ROX、荧光淬灭基团选自BHQ2；所述SEQ ID NO:9的荧光基团选自CY5、荧光淬灭基团选自BHQ3。
本发明还涉及含有由SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列的重组质粒。
本发明还涉及含有由SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列的重组质粒。
本发明还涉及含有由SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的重组质粒。
本发明至少具有以下有益的效果：
本发明的试剂盒具有操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，可以同时实现对BVDV、BRV和BCoV的定性检测和准确定量的技术优势。
附图说明
图1为实施例3中三重荧光定量RT-PCR标准曲线；
图2为实施例4中BVDV三重荧光定量RT-PCR敏感性检测结果，1-8为1×101～1×108copies/μL，9为阴性对照；
图3为实施例4中BRV三重荧光定量RT-PCR敏感性检测结果，1-8为1×101～1×108copies/μL，9为阴性对照；
图4为实施例4中BCoV三重荧光定量RT-PCR敏感性检测结果，1-8为1×101～1×108copies/μL，9为阴性对照；
图5实施例5的特异性检测结果，1为BVDV1阳性核酸；2为BVDV2阳性核酸；3为BRV阳性核酸；4为BCoV阳性核酸；5分别为阴性对照和其他病毒核酸；
图6为BVDV的三对引物的筛选试验结果；
图7为BRV的三对引物筛选试验结果；
图8为BCoV的三对引物筛选试验结果；
图9为单重BVDV引物浓度优化试验结果；
图10为单重BVDV探针浓度优化试验结果；
图11为单重BRV引物浓度优化试验结果；
图12为单重BRV探针浓度优化试验结果；
图13单重BCoV引物浓度优化试验结果；
图14为单重BCoV探针浓度优化试验结果；
图15为BVDV-BCoV引物浓度优化试验结果；
图16为BVDV-BCoV探针浓度优化试验结果；
图17为BVDV-BRV-BCoV三重引物浓度优化试验结果；
图18为BVDV-BRV-BCoV三重探针浓度优化试验结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例参考GenBank上发表的BVDV1 C24V分离株(AF091605.1)、1-SD1分离株(M96751.1)、LN-1分离株(KT896495.1)、SD-15分离株(KR866116.1)、NADL分离株(AJ133738.1)、SuwaCp分离株(KC853441.1)和BVDV2 11F011分离株(KC963968.1)、JZ05-1分离株(GQ888686.2)、XJ-04分离株(FJ527854.1)、New York'93分离株(AF502399.1)、C413分离株(AF002227.1)的5`UTR基因序列，利用Lasergener软件中MegAlign程序进行多序列比对，选取5`UTR基因片段上的保守序列分别设计合成了一对特异性引物和一个探针。上下游引物和探针分别命名为BVDV-F、BVDV-R和BVDV-P，探针5'端的荧光报告集团为HEX，3'端的荧光淬灭集团为BHQ1。
本发明实施例参考GenBank上发表的BRV LS00005_OSU分离株(KR052766.1)、WI79-9分离株(GU565062.1)、TOPORF11#1分离株(KF729678.1)、B10925分离株(EF554125.1)、PTRV分离株(FJ422141.1)和UCD/IRL分离株(GQ428140.1)的NSP5全基因序列，利用Lasergener软件中MegAlign程序进行多序列比对，选取NSP5基因片段上的保守序列分别设计合成了一对特异性引物和一个探针。上下游引物和探针分别命名为BRV-F、BRV-R和BRV-P，探针5'端的荧光报告集团为ROX，3'端的荧光淬灭集团为BHQ2。
本发明实施例参考GenBank上发表的BCoV 0502分离株(EU401981.1)、V270分离株(EF193074.1)、BCoV/CH/HB-BD/2019分离株(MK903505.1)、HLJ-14/CHN分离株(KM985634.1)、YC分离株(FJ556872.1)和SUN5分离株(EU401984.1)的N全基因序列，利用Lasergener软件中MegAlign程序进行多序列比对，选取N基因片段上的保守序列分别设计合成了一对特异性引物和一个探针。上下游引物和探针分别命名为BCoV-F、BCoV-R和BCoV-P，探针5'端的荧光报告集团为CY5，3'端的荧光淬灭集团为BHQ3。具体的，引物和探针序列如表1所示：
表1
名称 核苷酸编号 序列(5'-3') 修饰
BVDV-F SEQ ID NO:1 gaggctagccatgcccttagt -
BVDV-R SEQ ID NO:2 ctcgtccacrtggcatctcga -
BVDV-P SEQ ID NO:3 cctgagtacagggkagtcgtcrgtggttcgac 5'HEX、3'BHQ1
BRV-F SEQ ID NO:4 catgytgtcaaagtctccaga -
BRV-R SEQID NO:5 tgaatccatagacacgccagc -
BRV-P SEQID NO:6 ctgattctgcttcaaacgatccactcaccagc 5'ROX、3'BHQ-2
BCoV-F SEQID NO:7 gctagtaaccaggctgatgtc -
BCoV-R SEQID NO:8 gatgcgcgtgaagtagatctg -
BCoV-P SEQID NO:9 cgatcgggacccaagtagcgatgaggc 5'Cy5、3'BHQ3
可选的，在核酸扩增试剂中，SED ID NO:1所示上游引物的浓度为240～720nmol/L、SEQ ID NO:2所示下游引物的浓度为240～720nmol/L、SEQ ID NO:3所示探针的浓度为240～720nmol/L；优选的，SED ID NO:1所示上游引物的浓度为480nmol/L、SEQ ID NO:2所示下游引物的浓度为480nmol/L、SEQ ID NO:3所示探针的浓度为480nmol/L；在核酸扩增试剂中，SED ID NO:4所示上游引物的浓度为200～600nmol/L、SEQ ID NO:5所示下游引物的浓度为200～600nmol/L、SEQ ID NO:6所示探针的浓度为200～600nmol/L；优选的，SED IDNO:4所示上游引物的浓度为400nmol/L、SEQ ID NO:5所示下游引物的浓度为400nmol/L、SEQ ID NO:6所示探针的浓度为400nmol/L；在核酸扩增试剂中，SED ID NO:7所示上游引物的浓度为240～720nmol/L、SEQ ID NO:8所示下游引物的浓度为240～720nmol/L、SEQ IDNO:9所示探针的浓度为140～420nmol/L；优选的，SED ID NO:7所示上游引物的浓度为480nmol/L、SEQ ID NO:8所示下游引物的浓度为480nmol/L、SEQ ID NO:9所示探针的浓度为280nmol/L。
可选的，核酸扩增试剂中还含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ、TaKaRa Ex TaqHS和PrimeScript RT Enzyme MixⅡ。优选的，TaKaRa Ex Taq HS的浓度为5U/μL。
可选的，试剂盒中含有用于定量的参考品，参考品中含有三种重组质粒：BVDV重组质粒、BRV重组质粒、BCoV重组质粒，BVDV重组质粒含有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列、BRV重组质粒含有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列、BVDV重组质粒含有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。参考品为一组含有不同浓度的上述三种重组质粒混合物的试剂，每种重组质粒的具体浓度分别为：1×107copies/μL、1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL。
SEQ ID NO:10所示的BVDV的核苷酸序列具体为：
gaggctagccatgcccttagtaggactagcatagcgaggggggtagcaacagtggtgagttcgttggatggcttaagccctgagtacagggtagtcgtcagtggttcgacgccttaacatgaaggtctcgagatgccacgtggacgag
SEQ ID NO:11所示的BRV的核苷酸序列具体为：
catgctgtcaaagtctccagaagatattggaccatctgattctgcttcaaacgatccactcaccagcttttcgattagatcgaatgcagttaagaca aatgcagacg ctggcgtgtc tatggattca
SEQ ID NO:12所示的BCoV的核苷酸序列具体为：
gctagtaaccaggctgatgtcaataccccggctgacattctcgatcgggacccaagtagcgatgaggctattccgactaggtttccgcctggcacggtactccctcagggttactatattgaaggctcaggaaggtctgctcctaattccagatctacttcacgcgcatc
可选的，试剂盒中含有阴性对照和阳性对照，阴性对照为工艺用水，阳性对照中含有上述三种重组质粒的混合物，三种重组质粒分别包含由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12分别所示的BVDV、BRV和BCoV的核苷酸序列。阳性对照中相同拷贝数的三种重组质粒等体积混合。
本发明实施例还提出一种用于同时检测BVDV，BRV和BCoV的引物和探针，用于检测牛病毒性腹泻病毒的上游引物的核苷酸序列如SED ID NO:1所示、下游引物如SEQ ID NO:2所示、探针如SEQ ID NO:3所示；用于检测牛轮状病毒的上游引物的核苷酸序列如SED IDNO:4所示、下游引物如SEQ ID NO:5所示、探针如SEQ ID NO:6所示；用于检测牛冠状病毒的上游引物如SED ID NO:7所示、下游引物如SEQ ID NO:8所示、探针如SEQ ID NO:9所示；优选的，SEQ ID NO:3的荧光基团选自HEX、荧光淬灭基团选自BHQ1；SEQ ID NO:6的荧光基团选自ROX、荧光淬灭基团选自BHQ2；SEQ ID NO:9的荧光基团选自CY5、荧光淬灭基团选自BHQ3。
本发明实施例还提出含有由SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列的重组质粒。本发明实施例还提出含有由SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列的重组质粒。本发明实施例还提出含有由SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的重组质粒。本发明实施例还提出含有上述三种重组质粒的混合物，相同拷贝数的三种重组质粒等体积混合。
本发明实施例和实验例中所用到的试剂有：One Step PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)、RNase-Free ddH2O、6×Loading Buffer、500bpDNAladder和PremixEx Taq购于TaKaRa公司；质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收DNA试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；RNAsimple Total RNAKit购于北京天根(TIANGEN)生化科技有限公司。
实施例1试剂盒
一种检测试剂盒，其组成如表2所示：
表2
Figure GDA0002961873450000071
其中，混合重组质粒为分别含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的重组质粒。
本发明实施例试剂盒的使用方法为：
1、样本处理：
进行核酸提取(推荐使用商业化的试剂盒来提取RNA)，阴性对照与标本同时处理。提取完的核酸建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存。
2、扩增试剂准备：
三重荧光定量RT-PCR反应液体系1人份均按如下配制：12.5μL 2×One Step RT-PCR BufferⅢ+0.5μL TaKaRa Ex Taq HS+0.5μL PrimeScript RT Enzyme MixⅡ+0.24μLBVDV上下游引物(50μmol/L)+0.24μL BCoV上下游引物(50μmol/L)+0.20μL BRV上下游引物(50μmol/L)+1.2μL BVDV探针(10μmol/L)+0.7μL BCoV探针(10μmol/L)+1.0μL BRV探针(10μmol/L)+5.24μL RNase-Free ddH2O，将上述配制好的三重荧光定量RT-PCR预混液，分别按每管23μL的量，分装于各PCR管内。
3、加样：
取出试剂盒中对照品、参考品以及样本处理液，室温融化并混匀后，1500rpm离心15s。分别加2μL至装有上述RT-PCR预混液的PCR管中。每个反应体系的总体积为25μL。盖紧PCR管盖，1500rpm离心15s后，将其移至检测扩增区。
4、三重荧光定量RT-PCR扩增：三重荧光定量RT-PCR扩增的条件具体如表3所示：
表3
参数 温度(℃) 时间 循环
反转录 42 5min 1
预变性 95 10s 1
变性 95 5s 40
退火延伸 60 30s 40
5、检测：
(1)基线的确定：选择荧光曲线波动较小，较稳定的那段作为基线，用户可根据实际情况自行酌情调整。起点设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方。
(2)阈值的确定：在阴性对照无扩增的情况下，阈值设定在无扩增曲线样本的最高点，即高于无扩增增长曲线(即在结果分析“Component”栏中无柺点出现)的最高点，且阴性对照未检出为原则，确定起始阈值。计算机自动处理和分析数据。
实施例2
1、BVDV、BRV和BCoV三重荧光定量RT-PCR标准品的制备
委托华大基因(北京)股份有限公司合成重组质粒pMD19T-BVDV、pMD19T-BRV和pMD19T-BCoV。
(1)参考GenBank上发表的BVDV1 C24V分离株(AF091605.1)、1-SD1分离株(M96751.1)、LN-1分离株(KT896495.1)、SD-15分离株(KR866116.1)、NADL分离株(AJ133738.1)、SuwaCp分离株(KC853441.1)和BVDV2 11F011分离株(KC963968.1)、JZ05-1分离株(GQ888686.2)、XJ-04分离株(FJ527854.1)、New York'93分离株(AF502399.1)、C413分离株(AF002227.1)的5`UTR基因序列，合成一段全长148bp的BVDV基因序列(SEQ ID NO:10)，并将序列连接到pMD19-T Vector克隆载体上，获得重组质粒pMD19T-BVDV。
(2)参考GenBank上发表的BRV LS00005_OSU分离株(KR052766.1)、WI79-9分离株(GU565062.1)、TOPORF11#1分离株(KF729678.1)、B10925分离株(EF554125.1)、PTRV分离株(FJ422141.1)和UCD/IRL分离株(GQ428140.1)的NSP5全基因序列，合成一段全长127bp的BRV NSP5基因序列(SEQ ID NO:11)，并将序列连接到pMD19-T Vector克隆载体上，获得重组质粒pMD19T-BRV。
(3)参考GenBank上发表的BCoV 0502分离株(EU401981.1)、V270分离株(EF193074.1)、BCoV/CH/HB-BD/2019分离株(MK903505.1)、HLJ-14/CHN分离株(KM985634.1)、YC分离株(FJ556872.1)和SUN5分离株(EU401984.1)的N全基因序列合成一段全长170bp的BCoV基因序列(SEQ ID NO:12)，并将序列连接到pMD19-T Vector克隆载体上，获得重组质粒pMD19T-BCoV。
2、重组质粒pMD19T-BVDV、pMD19T-BRV和pMD19T-BCoV鉴定
将阳性重组质粒送上海生工公司测序，验证质粒构建是否成功。测序结果表明获得了序列正确的分别携带BVDV、BRV和BCoV目的基因的3个重组质粒，提取质粒DNA得到标准品，分别命名为BVDV标准品、BRV标准品和BCoV标准品。
3、BVDV、BRV和BCoV标准品拷贝数的计算及稀释
测定BVDV、BRV和BCoV三个标准品的浓度，并通过计算公式：质粒拷贝数(copies/μL)＝6.02×(重组质粒浓度ng/μL×10-9)×1023/(660×重组质粒碱基数)计算质粒拷贝数。BVDV标准品浓度为96.4ng/μL，通过相应的公式可算出质粒拷贝数为3.08×1010copies/μL。BRV标准品浓度为92ng/μL，通过相应的公式可算出质粒拷贝数为2.98×1010copies/μL。BCoV标准品浓度为100ng/μL，通过相应的公式可算出质粒拷贝数为3.19×1010copies/μL。
实施例3三重荧光定量RT-PCR反应体系
三重荧光定量RT-PCR反应参数如表3所示：三重荧光定量RT-PCR 25μL反应体系如表4所示：
表4
组分 体积
2×One Step RT-PCR BufferⅢ 12.5μL
TaKaRa Ex Taq HS 0.50μL
PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.50μL
BVDV/BCoV上下游引物(50μmol/L) 0.24μL
BRV上下游引物(50μmol/L) 0.20μL
BVDV探针(10μmol/L) 1.2μL
BRV探针(10μmol/L) 1.0μL
BCoV探针(10μmol/L) 0.7μL
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O 5.24μL
模板 2μL
荧光定量RT-PCR标准曲线的建立：
将上述浓度为1×1010拷贝数的BVDV标准品、BRV标准品和BCoV标准品等体积混合，按照10倍梯度将标准品混合液稀释至1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102copies/μL的梯度浓度作为标准样品，每个标准样品做3个重复，以不同浓度的标准样品作为模板，使用实施例1中的引物和探针浓度进行三重荧光定量RT-PCR检测。
各标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图1所示，从图1中得出的BVDV的标准曲线回归方程为y1＝-3.370x1+42.312，相关系数达0.999误差较小，标准曲线可用。BRV的标准曲线回归方程为y2＝-3.580x2+39.890，相关系数达1，误差较小，标准曲线可用。BCoV的标准曲线回归方程为y3＝-3.367x3+40.484，相关系数达1，误差较小，标准曲线可用。因此标准曲线可用于对BVDV、BRV和BCoV进行三重实时荧光定量RT-PCR检测。
实施例4三重荧光定量RT-PCR的敏感性试验
模板为1×101copies/μL、1×102copies/μL、1×103copies/μL、1×104copies/μL、1×105copies/μL、1×106copies/μL、1×107copies/μL、1×108copies/μL共8个标准阳性混合质粒，阴性对照为ddH2O。进行定量RT-PCR从而得出定量RT-PCR检测方法能够检出的最低浓度。得到的实验结果如图2、图3和图4所示。根据图2、3、4可知，本发明实施例建立的BVDV、BRV和BCoV定量RT-PCR最低能检出浓度均为1×101copies/μL的质粒。
实施例5荧光定量RT-PCR的特异性试验
为了确定该方法的特异性，分别以牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟牛副流感病毒、魏氏梭菌A型、B型和D型、牛巴氏杆菌A型和B型的核酸为模板，阳性对照分别为BVDV1、BVDV2、BRV和BCoV的阳性核酸，阴性对照为ddH2O进行定量RT-PCR。实验结果如图5所示。从图5可看出，除了BVDV1、BVDV2、BRV和BCoV的阳性核酸产生了扩增曲线，其他病毒的核酸未产生扩增曲线。
实施例6荧光定量RT-PCR的重复性试验
选用三个不同拷贝数的混合标准品，即1×104copies/μL、1×105copies/μL和1×106copies/μL，分别作三次组内和组间重复检测，对实验数据进行分析，验证本发明实施例所建立的定量RT-PCR方法的稳定性。模板为1×104copies/μL～1×106copies/μL 3个不同浓度的阳性混合质粒，进行定量RT-PCR。实验结果如表5所示。从表5中可看出，同一模板Ct值差异不大，扩增曲线也大致相同；同一模版不同拷贝数的组内重复变异系数均小于2％，表明本发明实施例的方法的重复性和稳定性良好。三重荧光定量RT-PCR重复性实验结果如表5所示：
表5
Figure GDA0002961873450000101
实施例7定量RT-PCR方法的应用
采用本发明实施例所建立的牛轮状病毒定量RT-PCR检测方法，对29份牛粪便拭子核酸样品进行检测。
首先对采集的样品进行核酸提取，先后用定量RT-PCR方法进行检测。利用这种方法检测从内蒙古某发病牛场采集的29份犊牛腹泻病例的粪便样品，定量RT-PCR检出18份BVDV阳性病料，6份BRV阳性病料和8份BCoV阳性病料。将这些阳性病料经测序鉴定方法验证均为阳性。具体如表6所示。
表6
Figure GDA0002961873450000102
Figure GDA0002961873450000111
实施例8
本发明实施例参考GenBank上发表的BVDV1 C24V分离株(AF091605.1)、1-SD1分离株(M96751.1)、LN-1分离株(KT896495.1)、SD-15分离株(KR866116.1)、NADL分离株(AJ133738.1)、SuwaCp分离株(KC853441.1)和BVDV2 11F011分离株(KC963968.1)、JZ05-1分离株(GQ888686.2)、XJ-04分离株(FJ527854.1)、New York'93分离株(AF502399.1)、C413分离株(AF002227.1)的5`UTR基因序列，利用Lasergener软件中MegAlign程序进行多序列比对，选取5`UTR基因片段上的保守序列设计合成了三对特异性引物，分别对BVDV核酸进行扩增，筛选效果较好的引物。引物序列如表7所示：
表7
Figure GDA0002961873450000112
采用以上BVDV的三对引物进行引物筛选试验，结果如图6所示。由图6可知，SEQ IDNO:1与SEQ ID NO:2所示序列的这对引物可扩出特异性条带。
本发明实施例参考GenBank上发表的BRV LS00005_OSU分离株(KR052766.1)、WI79-9分离株(GU565062.1)、TOPORF11#1分离株(KF729678.1)、B10925分离株(EF554125.1)、PTRV分离株(FJ422141.1)和UCD/IRL分离株(GQ428140.1)的NSP5全基因序列，利用Lasergener软件中MegAlign程序进行多序列比对，选取NSP5基因片段上的保守序列分别设计合成了三对特异性引物，分别对BRV核酸进行扩增，筛选效果较好的引物。设计引物序列如表8所示：
表8
名称 核苷酸编号 序列(5'-3') 扩增目的片段的长度
BRV-F1 SEQ ID NO:17 ccagatgcagaagcattcagt 172bp
BRV-R1 SEQ ID NO:18 atggccgtgattgtgttgatg
BRV-F2 SEQ ID NO:19 tctattggtaggagtgaacaataca 176bp
BRV-R2 SEQ ID NO:20 atagacacgccagcgtctg
BRV-F3 SEQ ID NO:4 catgytgtcaaagtctccaga 127bp(最终)
BRV-R3 SEQ ID NO:5 tgaatccatagacacgccagc
采用以上BRV的三对引物进行引物筛选试验，结果如图7所示，三对引物均可以扩出特异性条带，选择扩出目的片段最短的那一对(择SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5所示的序列)，以便与另外两个病毒的目的基因大小进行区分。
本发明实施例参考GenBank上发表的BCoV 0502分离株(EU401981.1)、V270分离株(EF193074.1)、BCoV/CH/HB-BD/2019分离株(MK903505.1)、HLJ-14/CHN分离株(KM985634.1)、YC分离株(FJ556872.1)和SUN5分离株(EU401984.1)的N全基因序列，利用Lasergener软件中MegAlign程序进行多序列比对，选取N基因片段上的保守序列分别设计合成了三对特异性引物，分别对BCoV核酸进行扩增，筛选效果较好的引物。设计引物序列如表9所示：
表9
名称 核苷酸编号 序列(5'-3') 扩增目的片段的长度
BCoV-F1 SEQ ID NO:21 cgacattgacggagtcttct 164bp
BCoV-R1 SEQ ID NO:22 cagaccttcctgagccttc
BCoV-F2 SEQ ID NO:23 gaccagtatggcaccgaca 153bp
BCoV-R2 SEQ ID NO:24 gtaaccctgagggagtaccg
BCoV-F SEQ ID NO:7 gctagtaaccaggctgatgtc 170bp(最终)
BCoV-R SEQ ID NO:8 gatgcgcgtgaagtagatctg
采用以上BCoV的三对引物进行引物筛选试验，结果如图8所示，三对引物均可以扩出特异性条带，选择扩出目的片段最长的那一对(SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8所示的序列)，以便与另外两个病毒的目的基因大小进行区分。
实施例9：引物与探针浓度的优化实验：
单重引物探针浓度优化：
采用25μL反应体系，其中2×one step RT-PCR buffer III 12.5μL，Ex Taq HS0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL，上下游引物各200nmol/L、240nmol/L、280nmol/L、320nmol/L、360nmol/L、400nmol/L，探针各200nmol/L、240nmol/L、280nmol/L、320nmol/L、360nmol/L、400nmol/L，模板2μL，无酶水补充至25μL，分别对BVDV、BRV与BCoV进行引物和探针浓度优化，确定单重反应引物与探针浓度。
单重BVDV引物优化图如图9所示，单重BVDV探针优化图如图10所示。如图9、10所示，BVDV所示上游引物的浓度为400nmol/L、BVDV所示下游引物的浓度为400nmol/L、BVDV所示探针的浓度为400nmol/L时，Ct值最小。单重BRV引物优化图如图11所示，单重BRV探针优化图如图12所示。如图11、12所示，BRV所示上游引物的浓度为360nmol/L、BRV所示下游引物的浓度为360nmol/L、BRV所示探针的浓度为360nmol/L时，Ct值最小。单重BCoV引物优化图如图13所示，单重BCoV探针优化图如图14所示。如图13、14所示，BCoV所示上游引物的浓度为400nmol/L、BCoV所示下游引物的浓度为400nmol/L、BCoV所示探针的浓度为280nmol/L时，Ct值最小。
BVDV与BCoV双重引物探针浓度优化：
确定单重反应条件后，使用矩阵法调节BVDV的引物用量(320nmol/L、400nmol/L、480nmol/L)、BCoV的引物用量(320nmol/L、400nmol/L、480nmol/L)，BVDV的探针用量(320nmol/L、400nmol/L、480nmol/L)、BCoV的探针用量(200nmol/L、280nmol/L、360nmol/L)，对BVDV与BCoV进行引物和探针浓度优化，选择CT值小，并且综合荧光值确定BVDV-BCoV双重反应的引物与探针浓度。BVDV-BCoV引物优化结果如表10与图15所示。
表10
序号 BVDV引物浓度/BCoV引物浓度 BVDV-CT值 BCoV-CT值
1 480nmol/L/480nmol/L 16.57 16.00
2 480nmol/L/400nmol/L 16.54 17.08
3 480nmol/L/320nmol/L 16.70 16.59
4 400nmol/L/480nmol/L 16.83 17.07
5 400nmol/L/400nmol/L 16.44 17.05
6 400nmol/L/320nmol/L 16.41 16.97
7 320nmol/L/480nmol/L 16.24 16.92
8 320nmol/L/400nmol/L 16.27 16.47
9 320nmol/L/320nmol/L 16.87 16.86
如表10与图15所示，最终选择1号组合，BVDV上游引物的浓度为480nmol/L、BVDV下游引物的浓度为480nmol/L、BCoV上游引物的浓度为480nmol/L、BCoV下游引物的浓度为480nmol/L。
BVDV-BCoV探针优化结果如表11与图16所示。
表11
序号 BVDV探针浓度/BCoV探针浓度 BVDV-CT值 BCoV-CT值
1 480nmol/L/200nmol/L 14.65 16.77
2 480nmol/L/280nmol/L 14.31 16.57
3 480nmol/L/360nmol/L 14.65 16.49
4 400nmol/L/200nmol/L 14.44 16.59
5 400nmol/L/280nmol/L 14.32 16.44
6 400nmol/L/360nmol/L 14.67 16.81
7 320nmol/L/200nmol/L 14.42 16.47
8 320nmol/L/280nmol/L 14.60 16.63
9 320nmol/L/360nmol/L 14.47 16.46
如表11与图16所示，最终选择2号组合，BVDV探针的浓度为480nmol/L，BCoV探针的浓度为280nmol/L。
BVDV-BRV-BCoV三重引物探针优化：
确定BVDV与BCoV引物与探针浓度后，使用矩阵法调节BVDV-BCoV(480nmol/L/480nmol/L)的引物用量与BRV的引物用量(240nmol/L、280nmol/L、320nmol/L、360nmol/L、400nmol/L、440nmol/L、480nmol/L、520nmol/L、560nmol/L)；BVDV-BCoV(480nmol/L/280nmol/L)的探针用量与BRV的探针用量(200nmol/L、240nmol/L、280nmol/L、320nmol/L、360nmol/L、400nmol/L、440nmol/L、480nmol/L、520nmol/L)，对BVDV-BCoV与BRV进行三重荧光定量引物和探针浓度优化，确定三重荧光定量的引物与探针浓度。BVDV-BRV-BCoV三重引物优化结果如表12与图17所示：
表12
序号 (BVDV-BCoV/BRV) BVDV-CT值 BCoV-CT值 BRV-CT值
1 480nmol/L-480nmol/L/240nmol/L 18.35 16.50 16.70
2 480nmol/L-480nmol/L/280nmol/L 18.17 16.24 15.32
3 480nmol/L-480nmol/L/320nmol/L 18.54 16.37 16.50
4 480nmol/L-480nmol/L/360nmol/L 18.14 16.53 14.16
5 480nmol/L-480nmol/L/400nmol/L 18.28 16.55 16.25
6 480nmol/L-480nmol/L/440nmol/L 18.28 16.56 15.66
7 480nmol/L-480nmol/L/480nmol/L 18.40 16.57 16.18
8 480nmol/L-480nmol/L/520nmol/L 18.37 16.67 16.13
9 480nmol/L-480nmol/L/560nmol/L 18.40 16.66 15.89
如表12与图17所示，最终选择5号组合，BVDV上游引物的浓度为480nmol/L、BVDV下游引物的浓度为480nmol/L、BCoV上游引物的浓度为480nmol/L、BCoV下游引物的浓度为480nmol/L，BRV上游引物的浓度为400nmol/L、BRV下游引物的浓度为400nmol/L。BVDV-BRV-BCoV三重探针优化结果如表13与图18所示：
表13
序号 (BVDV-BCoV/BRV) BVDV-CT值 BCoV-CT值 BRV-CT值
1 480nmol/L-280nmol/L/200nmol/L 17.82 17.33 16.21
2 480nmol/L-280nmol/L/240nmol/L 16.21 16.98 16.01
3 480nmol/L-280nmol/L/380nmol/L 17.83 17.21 16.04
4 480nmol/L-280nmol/L/320nmol/L 18.40 17.24 15.95
5 480nmol/L-280nmol/L/360nmol/L 17.92 17.25 16.21
6 480nmol/L-280nmol/L/400nmol/L 18.06 17.58 16.58
7 480nmol/L-280nmol/L/440nmol/L 17.73 17.22 16.14
8 480nmol/L-280nmol/L/480nmol/L 17.99 17.33 16.23
9 480nmol/L-280nmol/L/520nmol/L 17.44 17.08 15.97
如表13与图18所示，最终选择6号组合，BVDV所示探针的浓度为480nmol/L、BRV所示探针的浓度为400nmol/L、BCoV所示探针的浓度为280nmol/L。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。
序列表
<110> 内蒙古农业大学
<120> 用于同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的试剂盒及引物和探针
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggctagcc atgcccttag t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcgtccacr tggcatctcg a 21
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctgagtaca gggkagtcgt crgtggttcg ac 32
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catgytgtca aagtctccag a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaatccata gacacgccag c 21
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgattctgc ttcaaacgat ccactcacca gc 32
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctagtaacc aggctgatgt c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatgcgcgtg aagtagatct g 21
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgatcgggac ccaagtagcg atgaggc 27
<210> 10
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaggctagcc atgcccttag taggactagc atagcgaggg gggtagcaac agtggtgagt 60
tcgttggatg gcttaagccc tgagtacagg gtagtcgtca gtggttcgac gccttaacat 120
gaaggtctcg agatgccacg tggacgag 148
<210> 11
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catgctgtca aagtctccag aagatattgg accatctgat tctgcttcaa acgatccact 60
caccagcttt tcgattagat cgaatgcagt taagacaaat gcagacgctg gcgtgtctat 120
ggattca 127
<210> 12
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctagtaacc aggctgatgt caataccccg gctgacattc tcgatcggga cccaagtagc 60
gatgaggcta ttccgactag gtttccgcct ggcacggtac tccctcaggg ttactatatt 120
gaaggctcag gaaggtctgc tcctaattcc agatctactt cacgcgcatc 170
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgaatcctcc tccgcgaag 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
catgttaagg cgtcgaacca c 21
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcccttagta ggactagcat agc 23
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgctcgggct aagatgtgc 19
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccagatgcag aagcattcag t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atggccgtga ttgtgttgat g 21
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tctattggta ggagtgaaca ataca 25
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atagacacgc cagcgtctg 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgacattgac ggagtcttct 20
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cagaccttcc tgagccttc 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gaccagtatg gcaccgaca 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtaaccctga gggagtaccg 20

Claims (7)

1.一种用于同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有用于检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的引物和探针；
用于检测牛病毒性腹泻病毒的上游引物的核苷酸序列如SED ID NO:1所示、下游引物如SEQ ID NO:2所示、探针如SEQ ID NO:3所示；
用于检测牛轮状病毒的上游引物的核苷酸序列如SED ID NO:4所示、下游引物如SEQIDNO:5所示、探针如SEQ ID NO:6所示；
用于检测牛冠状病毒的上游引物如SED ID NO:7所示、下游引物如SEQ ID NO:8所示、探针如SEQ ID NO:9所示；
SED ID NO:1所示上游引物的浓度为480nmol/L、SEQ ID NO:2所示下游引物的浓度为480nmol/L、SEQ ID NO:3所示探针的浓度为480nmol/L；SED ID NO:4所示上游引物的浓度为400nmol/L、SEQ ID NO:5所示下游引物的浓度为400nmol/L、SEQ ID NO:6所示探针的浓度为400nmol/L；SED ID NO:7所示上游引物的浓度为480nmol/L、SEQ IDNO:8所示下游引物的浓度为480nmol/L、SEQ ID NO:9所示探针的浓度为280nmol/L。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO:3的荧光基团选自HEX、荧光淬灭基团选自BHQ1；所述SEQ ID NO:6的荧光基团选自ROX、荧光淬灭基团选自BHQ2；所述SEQ ID NO:9的荧光基团选自CY5、荧光淬灭基团选自BHQ3。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中还含有2×OneStepRT-PCR BufferⅢ、TaKaRa Ex Taq HS和PrimeScript RT Enzyme MixⅡ。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，TaKaRa Ex Taq HS的浓度为5U/μL。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有用于定量的参考品，所述参考品中含有三种重组质粒，所述三种重组质粒为分别含有SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的重组质粒。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照中含有三种重组质粒，所述三种重组质粒为分别含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的重组质粒。
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CN113249517A (zh) * 2021-01-04 2021-08-13 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种牛疫病实时荧光定量pcr检测用引物和探针及试剂盒
CN112853000B (zh) * 2021-02-04 2022-07-05 西北农林科技大学 牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒的三重rpa检测试剂盒
CN112760421A (zh) * 2021-02-10 2021-05-07 北京三元集团畜牧兽医总站 同时检测牛轮状病毒、冠状病毒和病毒性腹泻病毒的三重荧光定量pcr试剂盒及应用方法
CN113136455A (zh) * 2021-04-23 2021-07-20 河北农业大学 一种检测BVDV、BCoV、BRV和IBRV的多重荧光定量PCR方法及试剂盒
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GB0217434D0 (en) * 2002-07-27 2002-09-04 Royal Vetinary College Biological material
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