CN108315494A

CN108315494A - 一种检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒

Info

Publication number: CN108315494A
Application number: CN201810382865.7A
Authority: CN
Inventors: 段新华; 采复拉·大木拉; 郑文新; 陶卫东; 高扬; 张玉华; 参都哈西·加吾丁
Original assignee: Institute Of Livestock Husbandry Standardization Xinjiang Academy Of Animal Sciences (xinjiang Breeding Sheep And Wool Cashmere Quality Safety Supervision And Inspection Center)
Current assignee: Institute Of Livestock Husbandry Standardization Xinjiang Academy Of Animal Sciences (xinjiang Breeding Sheep And Wool Cashmere Quality Safety Supervision And Inspection Center)
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2018-04-26
Publication date: 2018-07-24

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开一种检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，其具有SEQ ID No.3所示的序列或其特异性片段，以及其具有上游引物序列如SEQ ID NO.1和下游引物序列SEQ ID NO.2所示，并且试剂盒，包含有上述的特异性引物对。用该方法试剂盒进行牛群BVDV感染的检测简单、快速、灵敏，在牛群BVDV检疫中具有较好的实用价值。

Description

一种检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体公开一种检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）不仅是引起犊牛腹泻、妊娠牛流产的一种常见传染病原，还是存在于犊牛血清，导致细胞及其相关生物制品生物污染的主要原因。妊娠头3个月感染的牛所产犊牛对BVDV产生免疫耐受而成为持续感染(PI)牛。由于PI牛并没有明显的临床症状，从而成为散播BVDV的潜在传染源。因此，筛选和建立准确、快速、敏感的BVDV检测方法将为牛群的净化和检疫提供可靠技术方法。

目前，国内外报道用于检测、诊断BVDV的主要方法有：血清学、免疫学和分子生物学诊断方法等。前两种方法涉及病毒分离培养，诊断血清制备，操作费时、繁琐，特异性和灵敏度也有一定局限。分子生物学的检测方法不仅快速，而且敏感性高、特异性强。该实验采集疑似感染牛的血样，用本室建立的BVDV二重PCR检测方法和美国IDEXX公司生产的BVDV抗原ELISA检测试剂盒做平行检测，并对感染牛群的混合血样进行了检测应用。实验证明，所建立的BVDV二重PCR检测技术用于临床样品的检测敏感性、特异、适用。

发明内容

本发明的目的：本发明的目的是提供检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，解决常规检测试剂盒昂贵、特异性差、耗时等缺点。通过人工设计上下游引物，优化反应体系，以及增加二次扩增PCR技术手段，改进性的建立二次PCR检测方法，很好的适用于牛病毒性腹泻病毒的临床诊断和流行病学监测。

本发明的技术方案：一、一种用于检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的遗传标记物，其具有SEQ ID No.3所示的序列或其特异性片段。

二、用于扩增BVDV的特异性引物对，包括其具有上游引物序列如SEQ ID NO.1和下游引物序列SEQ ID NO.2所示。上游引物：5’TAGCCATGCCCTTAGTAGGAC3’；下游引物：5’ACTCCATGTGCCATGTACAGC3’。

三、一种检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，包含有上述的特异性引物对。

四、所述的试剂盒采用下述PCR方法进行检测，其25μL反应体系为：在0.5ul的Eppendorf管中依次加人10×Buffer 2.5ul，Mg²⁺（25mM）5ul，dNTP Mixture(2.5 M)2.5ul，20uM上、下游引物各0.5ul，Rnase Inhibitor 20U，AMV RTase XL 2.5U，Taq DNA聚合酶2.5U，模板 5ul，用Rnase Free dH₂O补足至25ul，混匀；扩增程序及反应条件：50℃30min，94℃4min，94℃30sec，56℃30sec，72℃1min，共30个循环后，再72℃延伸7min；取RT-PCR产物6ul，加溴酚蓝上样缓冲液1ul，混合后分别加入1%琼脂糖凝的样品孔，以5V/cm恒压电泳45min，在凝胶成像系统拍照观察结果；以100bp DNA Marker作为分子量参照物，分析记录结果；二重PCR扩增取扩增产物2ul作模板，按上述程序再做二轮PCR扩增；获得扩增产物按照上述步骤进行保存记录。

有益效果：根据牛病毒性腹泻病毒（BVDV）基因序列高度保守的5’UTR区，合成一对特异引物，从疑似BVDV感染的个体牛血清中提取RNA做为模板，采用二重PCR方法，获得290bp特异性扩增产物，以此鉴别是否有BVDV感染。用该方法对同一牛场混合血清样品进行检测，检测出该牛场存在BVDV感染。实验表明，用该方法进行牛群BVDV感染的检测简单、快速、灵敏，在牛群BVDV检疫中具有较好的实用价值。

附图说明

图1 为RT-PCR扩增结果；图2为二次PCR扩增结果，其中，1、100bpmarke r； 2、BVDV标准株；3、犊牛混合血清的扩增产物；4、成年牛混合血清的扩增产物；5、空白对照。图3为 RT-PCR扩增结果；图4为二次PCR扩增结果，其中，1：100bpmarker， 2：标准毒株，3-10：依次为样品XJE1、XJE2、XJE3、XJE4、XJE5、XJE6、XJE7和空白对照。

具体实施方式

实施例：1、材料与方法

1．1 实验毒株 BVDV标准株为本实验室保存的美国Orengen C24毒株。临床样品分别采自新疆伊犁一规模化牛场春季爆发腹泻的犊牛全血7头份；随机采集乌鲁木齐周边一牛场成年牛和犊牛全血各20份。血样冷藏，在采集后24小时内分离血清，-20℃冻存备用。

1．2 试剂盒与工具酶 QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit， dNTPS、TaqDNA聚合酶、100bpMaker等均为TIAN GEN生物科技公司产品。Takara One Step RNA PCR Kit（AMV）购自大连宝生物公司。

1．3 试验设计

1．3. 1 BVDV ELISA检测按照试剂盒说明书操作进行。

1．3. 2 二重PCR实验设计引物设计根据文献报道，参考BVDV的标准毒株NADL株序列的高度保守的5’UTR区，设计一对引物，上游引物序列为5’TAGCCATGCCCTTAGTAGGAC3’，下游引物序列为5’ACTCCATGTGCCATGTACAGC3’。

1．3．3 病毒RNA的提取按照QIAGEN Viral RNA Mini xtraction Kit的操作说明进行。提取的RNA用30ulRnase Free dH₂O溶解，立即做RT-PCR检测或冻存备用。

1.3.4 RT-PCR扩增反应总体系为25ul：在0.5ul的Eppendorf管中依次加人10×Buffer 2.5ul，Mg²⁺（25mM）5ul，dNTP Mixture(2.5 M)2.5ul，上、下游引物 (20uM) 各0.5ul，Rnase Inhibitor 20U，AMV RTase XL 2.5U，Taq DNA聚合酶2.5U，模板 5ul，用Rnase Free dH₂O补足至25ul，混匀。扩增程序及反应条件：50℃30min，94℃4min，94℃30sec，56℃30sec，72℃1min，共30个循环后，再72℃延伸7min。取RT-PCR产物6ul，加溴酚蓝上样缓冲液1ul，混合后分别加入1%琼脂糖凝的样品孔，以5V/cm恒压电泳45min，在凝胶成像系统拍照观察结果。以100bp DNA Marker作为分子量参照物，分析记录结果。

1.3.4 二重PCR扩增取扩增产物2ul作模板，按上述程序再做二轮PCR扩增。获得扩增产物按照上述步骤进行保存记录。

2 结果

2．1 血样中BVDV抗原的ELISA检测乌鲁木齐周边一牛场随机采集的成年牛和犊牛血样中，仅在成年牛中检出阳性血样2份，其它均为阴性；伊犁牛场的腹泻犊牛的7份血液样品中检出阳性一份（编号为XJE1）。

2．2 健康成年牛混合血清和犊牛混合血清的二重PCR检测结果 RT-PCR扩增结果除了BVDV标准株显示有290bp左右目的带，结果为阳性，其他均为阴性（见图1）。用其扩增产物做二轮PCR后，标准株和样品均获得目的产物（见图2）。

2．3 腹泻犊牛各样品BVDV的二重PCR检测结果用RT-PCR扩增BVDV标准株得到290bp目的带（见图3）；7个样品均没有获得扩增产物，但是将其产物继续再次PCR扩增，其中有 6个样品出现290bp的目的片段（见图4）。

3、讨论

3.1 RT-PCR 用于BVDV的检测在国内外都见有报道。在实际应用中只能对部分样品检出感染BVDV，本实验采集疑似BVDV感染的腹泻犊牛血清样品,获得良好结果。根据DANIELWEINSTOCK报道，RT-PCR还可用于牛群混合血清的BVDV检测以判断是否有持续感染牛或者说带毒牛。但是本试验RT-PCR的结果阴性，通过改进为二重PCR，就检测出牛群混合血清样品含有BVDV确定是带毒牛群，, 分析其原因是因为带毒牛的血清中BVDV含量极低，通过再次对扩增产物进行PCR，扩大病毒特异片段的拷贝数而呈现阳性,由此表明，通过二重PCR可以大大提高敏感度，降低假阴性率，能够更加准确地检测血液中是否有BVDV感染，步骤简单快速，从样品核酸提取到得到结果，可以当天完成，实验结果稳定，大大提高了敏感性，可重复性也很好。

3.2 国内无检测BVDV的商品购买,进口酶免试剂盒价格昂贵,不适用于基层,而病毒分离技术要求高，步骤烦琐复杂，而且耗时。本实验直接采集牛血液样品，分离血清，利用二重PCR方法获得特异性目的产物，本人还对疑似BVDV感染牛对规模化牛场进行群体抽样，采用混合血清检测,仅随机采集20头就就获得了可靠结果，说明敏感性是很高的，这将对确定是否为BVDV感染牛场,鉴定牛场是否存在PI牛，提供了一个经济实惠、切实可行的检测手段。

3.3 众所周知，猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株需要在原代牛睾丸细胞中培养增殖，这就必须事先对使用的牛睾丸细胞进行BVDV检测，利用二重PCR对已经确定为原代牛睾丸细胞BVDV感染阳性的细胞进行了检测证实，结果发现与酶免检测结果符合性很好，特异性非常高。可以证明，此方法经济、方便、实用。并且一次可以单个或多个样品检测，与酶联方法的批量检测相比，有着不可比拟的优势。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研究所（新疆维吾尔自治区种羊与羊毛羊绒质量安全监督检验中心）

<120> 一种检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211>21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tagccatgcc cttagtagga c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actccatgtg ccatgtacag c 21

<210> 3

<211> 290

<212> DNA

<213> 牛病毒性腹泻病毒

<400> 3

tagccatgcc cttagtagga ctagcataat gaggggggta gcaacagtgg tgagttcgtt 60

ggatggctta agccctgagt acagggtagt cgtcagtggt tcgacgcctt ggaataaagg 120

tctcgagatg ccacgtggac gagggcatgc ccaaagcaca tcttaacctg agcgggggtc 180

gcccaggtaa aagcagtttt aaccgactgt tacgaataca gcctgatagg gtgctgcaga 240

ggcccactgt attgctacta aaaatctctg ctgtacatgg cacatggagt 290

Claims

1.一种用于检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的遗传标记物，其具有SEQ ID No.3所示的序列或其特异性片段。

2.用于扩增BVDV的特异性引物对，包括其具有上游引物序列如SEQ ID NO.1和下游引物序列SEQ ID NO.2所示。

3.一种检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于：包含有权利要求2所述的特异性引物对。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：采用下述PCR方法进行检测，其25μL反应体系为：在0.5ul的Eppendorf管中依次加人10×Buffer 2.5ul，Mg²⁺（25mM）5ul，dNTP Mixture(2.5 M)2.5ul，20uM上、下游引物各0.5ul，Rnase Inhibitor 20U，AMV RTase XL 2.5U，Taq DNA聚合酶2.5U，模板 5ul，用Rnase Free dH₂O补足至25ul，混匀；扩增程序及反应条件：50℃30min，94℃4min，94℃30sec，56℃30sec，72℃1min，共30个循环后，再72℃延伸7min；取RT-PCR产物6ul，加溴酚蓝上样缓冲液1ul，混合后分别加入1%琼脂糖凝胶的样品孔，以5V/cm恒压电泳45min，在凝胶成像系统拍照观察结果；以100bp Marker作为分子量参照物，分析记录结果；二重PCR扩增取扩增产物2ul作模板，按上述程序再做二轮PCR扩增；获得扩增产物按照上述步骤进行保存记录。