CN105018485A - 一种应用rpa技术检测小反刍兽疫病毒的引物和探针 - Google Patents

一种应用rpa技术检测小反刍兽疫病毒的引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种应用RPA技术检测小反刍兽疫病毒的引物及探针，其中正向引物序列如SEQ？ID？No.1所示，反向引物序列如SEQ？ID？No.2所示，探针序列如SEQ？ID？No.3所示。本发明方法根据小反刍兽疫病毒基因组序列设计了大量RPA引物和探针，从中筛选出一对可快速有效检测小反刍兽疫病毒核酸的引物及探针组合。利用该套引物和探针进行快速检测，以国内分离的西藏株和新疆株小反刍兽疫病毒核酸RNA为模板均可以得到明显的扩增曲线，其他病原核酸如口蹄疫病毒、羊传染性脓疱病毒、山羊支原体和蓝舌病病毒为模板进行反应均没有扩增曲线。

Description

一种应用RPA技术检测小反刍兽疫病毒的引物和探针
技术领域
本发明属于兽医病原微生物检测技术领域，具体涉及到一种检测小反刍兽疫病毒的引物组和探针。即应用重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术快速检测小反刍兽疫病毒的引物、探针和检测方法。
背景技术
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种感染山羊和绵羊的烈性传染病，该病主要感染绵羊、山羊和野生小反刍动物。小反刍兽疫主要在中非、西非、东非、中东和南亚等地区流行。我国于2007年首先发现该病，随后又有几次小规模暴发，但只局限在西藏阿里地区。自2013年重新传入我国以来，迅速传播到我国的大部分省区，给我国的养羊业带来巨大经济损失。虽然该病的临床症状很明显，但是仍有可能与其他疫病如羊支原体肺炎、羊口蹄疫和羊口疮等相混淆。因此，急需快速确诊该病的检测技术。
目前病毒核酸检测的主要方法为PCR法，常规的PCR检测需要特殊的热循环仪以及繁琐的试验程序，难以满足现场或田间条件下的检测需要。近年来，一些核酸等温扩增技术逐渐发展起来，这些技术不需要昂贵的PCR仪，并且可以在短时间内快速大量扩增出目的片段，具有简单、快速、灵敏度高等优点。其中的RPA技术更是被称为可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。RPA技术是模拟了生物体内DNA复制、基于重组酶聚合酶介导的扩增原理发展而来。它可以在非常短的时间内使目的基因以指数级增长，若配合荧光标记的探针和荧光信号检测仪便可实现对模板扩增的实时监测。RPA技术大大减少了检测时间，简化了反应程序，结合快速核酸提取技术和便携式的实时荧光检测设备后非常适于现场或田间检测，具有广阔的应用前景。利用RPA技术检测小反刍兽疫病毒具有重大的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用RPA技术检测小反刍兽疫病毒的引物及探针，从而弥补现有技术的不足。
本发明提供的引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。
探针PPRV-RPAp中的第30个碱基标记BHQ1淬灭基团，第32位碱基标记FAM发光基团，3′末端进行磷酸化修饰。
本发明还提供了一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测小反刍兽疫病毒的方法：提取待检样品中的RNA作为模板，利用引物和探针进行荧光快速检测，如果有明显的荧光曲线扩增，则说明所检测样品中含有小反刍兽疫病毒核酸。实施步骤为：在1.5ml离心管中加入再水化缓冲液29.5μl，Transcriptor反转录酶(Roche)0.5μl，10μM的引物各2.1μl，10μM的TwistAmp exo探针0.6μl，模板RNA和dH2O 12.7μl，涡旋混匀短暂离心后，将前述混合液加入到RPA冻干酶球的反应管中，加入280mM的醋酸镁溶液2.5μl，混匀，将反应管置于RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪中，37℃反应15分钟。
本发明方法根据小反刍兽疫病毒基因组序列设计了大量RPA引物和探针，从中筛选出一对可快速有效检测小反刍兽疫病毒核酸的引物及探针组合。利用该套引物和探针进行快速检测，以国内分离的西藏株(Tibet2007)和新疆株(XJ 2013)小反刍兽疫病毒核酸RNA为模板均可以得到明显的扩增曲线，其他病原核酸如口蹄疫病毒、羊传染性脓疱病毒、山羊支原体和蓝舌病病毒为模板进行反应均没有扩增曲线。
附图说明
图1为小反刍兽疫病毒特异性检测，其中1为新疆株PPRV，2为西藏株PPRV，3-7分别为口蹄疫病毒、羊传染性脓疱病毒、山羊支原体、蓝舌病病毒和健康羊淋巴结。
图2为检测灵敏度试验图，使用新疆株小反刍兽疫病毒为模板，拷贝数依次从105到100个拷贝时的检测阳性率。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅作为示例。
实施例1：检测方法的建立
根据GenBank中小反刍兽疫病毒基因组序列，设计引物和探针。引物长度约为30-35nt，由于目前没有针对RPA的引物设计软件，本发明前期工作过程中设计合成了大量引物，从中筛选出一对灵敏度高且特异性好的引物，引物和探针序列SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、和SEQ ID No：3(表1)。
表1：用于RPA检测PPRV的引物和探针
注：R代表G或A，Y代表T或C，PPRV-RPAp中的第30个碱基标记BHQ1淬灭基团，第31位碱基替换为四氢呋喃(tetrahydrofuran)，第32位碱基标记FAM发光基团，3’末端进行磷酸化修饰。
1.材料与方法
(1)材料小反刍兽疫西藏株和新疆株病毒，口蹄疫病毒，蓝舌病病毒，羊支原体和羊传染性脓疱病毒。健康羊淋巴结样品。引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成，其他试剂均为进口分装或国产分析纯。
(2)病原核酸提取取200μl病原培养物或经2000g离心后的组织匀浆液，使用Roche公司的High Pure PCR Template Preparation kit按照产品说明书提取各种材料中的总核酸。
(4)体外转录制备小反刍兽疫病毒模板提取小反刍兽疫病毒新疆株RNA，以引物GACCATCRGCCCAATCAATTAAAAAGGG和CTGAGTCR GTGATGCTATGGTACC进行RT-PCR扩增，对PCR产物进行纯化后连接到pGEM-T载体上，重组质粒经鉴定方向后，提取质粒使用限制性酶酶切成线性，然后按照Riboprobe In vitro Transcription systems的说明书进行体外转录，产物经DNase I消化、3M的醋酸钠乙醇沉淀后，溶解于无RNase的水中，测定浓度后计算出对应拷贝数，依次从105拷贝/μl以10倍倍比稀释至100个拷贝/μl，-70℃保存。
(3)RPA扩增使用TwistAmp exo(TwistDx，Cambridge，UK)试剂盒在50μl反应体系进行RPA试验，首先在1.5ml离心管中加入再水化缓冲液29.5μl，Transcriptor反转录酶(Roche)0.5μl，10μM的引物各2.1μl，10μM的TwistAmp exo探针0.6μl，模板RNA和dH2O 12.7μl，涡旋混匀短暂离心后，将前述混合液加入到RPA冻干酶球的反应管中，加入280mM的醋酸镁溶液2.5μl，混匀，将反应管置于RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪中，37℃反应15分钟。以不同种类的病原核酸和健康羊总核酸为模板进行特异性检测，以不同稀释度的RNA标准为模板进行反应的灵敏性检测。
2.结果
2.1 特异性
用本发明所设计的引物和探针进行快速检测，以国内分离的西藏株(Tibet 2007)和新疆株(XJ 2013)小反刍兽疫病毒核酸RNA为模板均可以得到明显的扩增曲线，其他病原核酸如口蹄疫病毒、羊传染性脓疱病毒、山羊支原体、蓝舌病病毒和健康羊淋巴结总核酸为模板进行RPA反应均没有扩增曲线(图1)。
2.2 检测灵敏度
将病毒核酸10倍稀释至多个梯度，每个梯度重复检测10次，使用统计软件计算出结果在模板低至约300个拷贝时有95％的检出可能性，具有较高的灵敏度(图2)。
实施例2 在临床样品中的应用
使用实施例1中建立的RPA方法对国内12份临床疑似病例的羊口鼻拭子和组织病料样品进行检测。使用Roche公司的High Pure PCR TemplatePreparation kit提取待检样品中的总核酸模板，然后用RPA方法检测这些样品中是否含有PPRV。同时参照世界动物卫生组织(OIE)推荐的普通RT-PCR方法对12份样品进行平行检测。结果两种检测方法的检测结果一致，12份样品均为PPRV核酸阳性。上述结果表明本发明的引物组和探针及其检测方法所获得的结果与RT-PCR的结果一致，证明本发明的可靠性。

Claims (7)

1.一种引物和探针，其特征在于，引物的正向引物序列为SEQ ID NO:1，反向引物序列为SEQ ID NO:2，探针序列为SEQ ID NO:3。
2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述的探针的第30位碱基标记BHQ1淬灭基团。
3.如权利要求1或2所述的引物和探针，其特征在于，所述的探针的第32位碱基标记FAM发光基团。
4.如权利要求3所述的引物和探针，其特征在于，所述的探针的3′末端进行磷酸化修饰。
5.权利要求1所述的引物和探针在检测小反刍兽疫病毒中的应用。
6.权利要求1所述的引物和探针在制备检测小反刍兽疫病毒制品中的应用。
7.一种通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测小反刍兽疫病毒的方法，提取待检样品中的RNA作为模板，利用权利要求1所述的引物和探针进行荧光快速检测，如果有明显的荧光曲线扩增，则说明所检测样品中含有小反刍兽疫病毒核酸。
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