CN104087661A

CN104087661A - TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法

Info

Publication number: CN104087661A
Application number: CN201410270487.5A
Authority: CN
Inventors: 栗冬梅; 刘云彦; 杜鹏程; 宋秀平; 刘起勇
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2014-06-17
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2034-06-17
Also published as: CN104087661B

Abstract

本发明提供一种TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法，选取杆菌样巴尔通体特异的一段基因序列，基于该特异基因序列，设计PCR引物与TaqMan探针，并建立了杆菌样巴尔通体的实时荧光探针定量PCR检测方法。该方法具有很好的特异性和稳定性，能够满足一般临床样品要求，不会出现假阳性反应。所设计的探针具有极高的敏感性，最低检测限可达到每个PCR反应检出3个拷贝的目的基因。本发明建立的实时荧光探针定量PCR方法可为杆菌样巴尔通体引起一系列疾病的早期临床诊断、疾病监测和筛查以及流行病学调查提供一种高效的实验室检测手段。

Description

TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法。

背景技术

早在1905年，秘鲁的微生物学家艾尔伯特·巴顿(Alberto Barton)在红细胞中发现人类巴尔通体病(Bartonellosis)的致病因子，此病又称为卡瑞恩病(Carrion's disease)，急性期为奥罗亚热(Oroya fever)，慢性期为秘鲁疣(Verruga Peruana或Peruvian Wart)。1919年，泰勒马克·巴蒂斯梯尼(Telémaco S.Battistini)和野口英世(Hideyo Noguchi)分离出该病原体，他们为纪念巴顿医生首次发现这种微生物，将其命名为杆菌样巴尔通体(B.bacilliformis,Bb)。这种细菌主要分布在秘鲁、哥伦比亚和厄瓜多尔等南美安第斯山脉地区，人是唯一的宿主，主要通过当地的一种白蛉(Lutzomyia verrucarum)传播。这种白蛉只栖息于安第斯山麓的丘陵地区，该生境被称为“疣症地带(verruga zone)”，卡瑞恩病与这种传播媒介地理分布一致，为一种地方性流行病。近年来报道在秘鲁乌鲁班巴(Urubama)地区发生一起卡瑞恩病暴发流行，并没有在所谓的“疣症地带”且Lutzomyia verrucarum也不是当地白蛉的优势种，此外传播该疾病的媒介据报道还有sandfly和另外一种白蛉(Lutzomyia columbiana)，由此推测可能还存在其他传播媒介或未知的传播方式。因此，带菌人群的流动及非疫区适宜传播媒介的孳生都可能会引起此病的暴发流行。与当地人群相比，外来人群对此病易感且病情更为严重，随着南美旅游热度的增加，特别是前往此病流行区的游客将成为高危人群。对于Bb引起的卡瑞恩病，及早的诊断治疗可以显著降低病死率。此外，到流行区旅游，适当个人防护对避免白蛉叮咬十分重要。

目前，对此菌检测方法主要是分离培养、血清学检测和常规PCR检测。Bb生长缓慢、营养条件要求苛刻而难于分离培养，判断结果时只靠肉眼观察，没有足够可靠依据，降低实验的准确性。血清学检测通常用ELISA和IFA法检测巴尔通体抗体，有些种如汉赛巴尔通体(B.henselae)和五日热巴尔通体(B.quintana)有市售的检测试剂盒，对于Bb国外仅有个别实验室能够进行，此外IFA法判读有一定的主观性，灵敏度不高。常规PCR虽然避免了上述两类方法的缺陷，但是存在引物结合缺乏特异性、实验室污染和临床样品中PCR抑制物存在造成假阴性等问题，限制了在临床诊断上的推广应用。探针法实时荧光PCR技术依据序列特异性探针区别物种，增加了实验特异性和敏感性，结果准确率提高，能够很好地解决上述问题，在传染病病原检测上日渐普及。Bb引起的疾病严重影响人类健康，急性期病死率高，慢性期可造成毁容，给病人带来身心痛苦，造成社会卫生经济负担。近年来，我国与南美洲国家交往日益加深，贸易往来及工程合作方兴未艾，加之国内赴南美旅游不断升温，使得我国此病的高危人群不断增加，输入病例的可能性越来越大，因此，有必要建立一种特异性强、灵敏度高、稳定性好的方法，能够快速准确地检测Bb，以辅助临床实验室诊断。

发明内容

本发明的目的是提供一种TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法。

为了实现本发明目的，本发明选取杆菌样巴尔通体特有的一段未知功能的基因(BARBAKC583_1366)为目标序列，设计特异性PCR引物和探针，利用TaqMan探针技术建立检测该菌的实时荧光定量PCR方法。

本发明提供用于检测杆菌样巴尔通体的TaqMan实时荧光定量PCR引物及探针，

所述引物包括：

上游引物Bb2F：5′-CAATTATCATCATTATTTGCTCCTGG-3′

下游引物Bb2R：5′-TACTGCTGAGGTTGGGCGA-3′

所述探针为：

探针BbT：5′-F-AGAAGACGATCCGTTACAT-Q-3′

其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。

优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为MGB。

本发明还提供含有上述引物及探针的用于TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的一种或多种。

优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法，其是利用引物Bb2F和Bb2R及探针BbT，或所述试剂盒对杆菌样巴尔通体进行TaqMan实时荧光定量PCR检测。

前述方法包括以下步骤：

1)提取样品组织中的总DNA；

2)以步骤1)中的总DNA为模板，Bb2F和Bb2R为引物，BbT为探针，进行PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

其中，PCR反应体系以20μl计为：

PCR反应条件为：95℃2分钟，单个循环；95℃3秒，60℃3秒，共40个循环。

本发明选取Bb特异的一段基因序列，基于该特异基因序列，设计引物与TaqMan探针。应用目标基因克隆质粒作为标准品，检测敏感性、扩增效率等指标，应用多种巴尔通体和其它种属的细菌共计39种菌株作为阴性对照进一步验证本方法的特异性，建立了Bb的实时荧光探针定量PCR检测方法。除目标菌外，其它11种巴尔通体、20余株其它种属细菌和犬、猫、人、鼠和蜱的基因组DNA均无扩增信号，表明该方法具有很好的特异性，能够满足一般临床样品要求，不会出现假阳性反应。所设计的探针具有极高的敏感性，最低检测限可达到每个PCR反应检出3个拷贝的目的基因。十倍倍比稀释标准品6次平行重复实验的组内和组间变异值均较低，具有很好的重复性，表明该方法稳定，规范操作可实现数据的良好重复性，数据可靠。标准曲线的绘制反应出Cq值与质粒浓度有良好的线性关系和高扩增效率，说明PCR反应条件得到了最佳优化、实验操作准确，结果可信。因而，本发明建立的实时荧光探针定量PCR方法可为Bb引起一系列疾病的早期临床诊断、疾病监测和筛查以及流行病学调查提供一种高效的实验室检测手段。

附图说明

图1为本发明实施例中不同退火温度的扩增曲线(同一模板8个退火温度的3平行样的实时定量PCR扩增曲线)。

图2为本发明实施例中不同探针浓度的扩增曲线。

图3为本发明实施例中不同引物浓度的扩增曲线。

图4A和图4B为本发明实施例中标准质粒荧光定量PCR的扩增曲线。

图5为本发明实施例中不同稀释浓度标准质粒的扩增曲线。

图6为本发明实施例中杆菌样巴尔通体TaqMan探针荧光定量PCR特异性检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法

1材料和方法

1.1菌株和生物样本DNA

巴尔通体基因组DNA包括杆菌样巴尔通体(B.bacilliformis,Bb)、文森巴尔通体博格霍夫亚种(B.vinsonii subsp.berkhoffii)ATCC51672、汉赛巴尔通体(B.henselae,Bh)ATCC49882、五日热巴尔通体(B.quintana,Bq)ATCC VR-358、克氏巴尔通体(B.clarridgeiae,Bc)ATCC51734、克勒巴尔通体(B.koehlerae,Bk)ATCC700693、ATCC35685、文森巴尔通体阿鲁潘亚种(B.vinsonii subsp.arupensis,Bva)ATCC700727、文森巴尔通体文森亚种(B.vinsonii subsp.vinsonii,Bvv)ATCC VR-152、伊丽莎白巴尔通体(B.elizabethae,Be)ATCC49927、格拉汉姆巴尔通体(B.grahamii,Bg)ATCC700132、道志巴尔通体(B.doshiae,Bd)ATCC700133和特利波契巴尔通体(B.tribocorum,Bt)CIP105476；根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；人、猫、犬、兔、羊、鼠和蜱基因组DNA均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所媒介生物控制室提供。

其它细菌基因组DNA包括脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meninyitidis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷白杆菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、马赛立克次体(R.massilliae)、日本立克次体(R.japonica)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis EV76)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、链球菌肺炎(Streptococcus pneumonia)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)和伯氏疏螺旋体(Bolrelia burgdorferi)，均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所相关实验室提供。

1.2主要仪器设备与试剂

伯乐(BioRad)CFX96荧光定量PCR仪、台式高速离心机Eppendorf centrifuge5804R、核酸浓度测定仪NanoDrop-1000。

QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN)，pEASY-T1Cloning Kit、GoqPCR Master Mix购自Promega公司；质粒提取试剂盒购自北京擎科新业生物技术有限公司。

1.3靶基因筛选、引物与TaqMan探针的设计与合成

选择杆菌样巴尔通体一特有未知功能的基因(BARBAKC583_1366)为目标序列，采用ABI Primer Express2.0软件设计探针和引物，引物和探针由上海基康生物技术有限公司合成。扩增的目标基因的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

设计的引物为：

上游引物Bb2F：5′-CAATTATCATCATTATTTGCTCCTGG-3′

下游引物Bb2R：5′-TACTGCTGAGGTTGGGCGA-3′

设计的探针为：

探针BbT：5′-FAM-AGAAGACGATCCGTTACAT-MGB-3′

1.4标准品的制备

以BbF和BbR为引物，Bb标准菌株ATCC51672TM的DNA为模板，扩增得到大小为117bp的目的片段；PCR产物切胶回收纯化后连接到pEASY-T载体上；将连接后载体导入DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，用PCR测序方法验证后提取质粒，测定浓度，作为绘制定量PCR标准曲线的标准品。质粒和含有重组子的阳性菌分别保存于-20℃和-70℃。

1.5质粒拷贝数浓度换算

Bb质粒浓度为11.8ng/μL，pEASY-T载体的碱基数为3928bp，每个碱基的平均分子量为660道尔顿/bp，扩增产物大小为117bp，每μL样品中检测基因拷贝数按照公式估算：样品拷贝数＝浓度ng/L×阿伏伽德罗常数×10^-9/(660×重组质粒碱基数)，计算得出拷贝数浓度为2.66×10⁹拷贝/μL。

1.6反应体系及反应参数

反应体系共20μL：Promega GoqPCR Master Mix为10μL，上、下游引物(10μmol/L)分别为0.4μL，荧光标记探针(10μmol/L)为0.4μL，DNA模板DNA1μL，无核酸酶水补齐。扩增程序：第一步95℃预变性2min，单个循环；第二步，95℃变性3s，60℃退火温度30s，40个循环。

1.7反应条件优化

1.7.1退火温度优化：以Bb阳性对照DNA为模板，51℃～62℃进行梯度定量PCR，筛选最佳退火温度。

1.7.2探针浓度优化：固定引物浓度为500nmol/L，探针浓度分别为100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L和500nmol/L，根据扩增反应的循环阈值(Cq)和扩增曲线的荧光信号强度选择最优探针浓度，设3孔平行样进行检测。

1.7.3引物浓度优化：固定探针浓度为选择的最优浓度，引物浓度为100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L和500nmol/L，根据扩增反应的循环阈值(Cq)和扩增曲线的荧光信号强度选择最优探针浓度，设3孔平行样进行检测。

1.8标准曲线的制备

将原液按10×倍比稀释，使浓度达到2.66×10⁸～2.66×10²拷贝/μL，其引物、探针浓度分别为200nmol/L，进行定量PCR，同时做3个平行样品。

1.9引物和探针的敏感性分析

用10×倍比稀释的标准质粒(2.66×10¹拷贝/μL和2.66×10⁰拷贝/μL)为模板，引物探针浓度均为200nmol/L来检测本方法的敏感性。

1.10引物探针特异性分析

确认引物和探针对Bb的特异性，将Bb、其它种巴尔通体、根癌土壤杆菌等非巴尔通体菌及犬、猫、人、鼠和蜱基因组DNA的浓度调整至大约1～10ng/μL左右，取模板1μL进行定量PCR检测。

1.11实验重复性分析

按探针引物浓度分别为200nmol/L配制荧光定量PCR检测反应体系，以Bb标准质粒(2.66×10⁴拷贝/μL～2.66×10⁷拷贝/μL)为模板进行稳定性检测。在同一次定量PCR反应中，每个稀释度标准质粒做6个重复孔，以分析组内差异；用上述相同条件分别进行6次独立重复实验，分析组间差异，计算其变异系数，变异系数(CV)＝标准偏差(SD)/平均数(X)。

1.12统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计学分析，方差分析用于比较不同样本之间的差异，P＜0.05有统计学意义。

2结果

2.1反应条件的优化

2.1.1退火温度优化：退火温度为51.0℃、51.7℃、53.2℃、55.3℃、58.0℃、60.2℃、61.4℃和62.0℃，通过设置温度梯度优化退火温度，结果显示，从51℃至62℃上述8个温度梯度，Cq值在20.66～21.18之间，对实验结果影响甚微，没有显著差异(P＞0.05)。考虑较低温度时易发生非特异性扩增，为了使实验具有较高的特异性和保持酶的最佳聚合活性，选择60℃为退火温度(图1)。

2.1.2探针浓度优化：当探针浓度为100nmol/L时，Cq值最大(21.21)，荧光强度最小(P<0.05)；当探针浓度为200～500nmol/L时，Cq值在20.52～20.91之间，差别不显著(P＞0.05)，重复实验结果稳定。因此选择200nmol/L为探针的工作浓度(图2)。

2.1.3引物浓度优化：当引物浓度分别为100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L和500nmol/L时，其Cq值均在23.56～23.73之间，对实验结果没有影响(P＞0.05)。当引物浓度为100nmol/L时，特异性较差，扩增曲线趋于平坦，未呈现经典的“S”型曲线，即未见到明显的指数扩增期；当引物浓度过高时容易出现非特异性扩增，此外考虑到临床应用，需应尽量减少试剂浪费，因此最佳引物浓度为200nmol/L，此时也获得了理想的扩增效果，扩增曲线呈现典型的“S”型(图3)。

2.2标准曲线

根据Cq值与标准质粒的浓度对数值绘制标准曲线，其相关系数R²为1.000，扩增效率E为98.18％，Cq值和浓度之间呈现良好的线性关系(图4A和图4B)。

2.3引物及探针敏感性检测

用10×倍比稀释的标准质粒(2.66×10¹拷贝/μL和2.66×10⁰拷贝/μL)为模板，引物和探针浓度均为200nmol/L检测本方法的敏感性。最低检测出浓度2.66×10⁰拷贝/μL，即每个反应需3个拷贝，检测以上的浓度均出现良好的扩增信号，空白对照没有扩增信号(图5)。

2.4重复性分析

组内各孔之间CV值在0.21％～0.89％之间，组间重复测定CV值在0.29～0.59％之间，小于1％。(表1和表2)

表1TaqMan探针实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体组内重复性

表2TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体组间重复性

注：表1和表2中，为平均值，SD为标准差，CV为变异系数。

2.5杆菌样巴尔通体引物探针的特异性检测

杆菌样巴尔通体菌株扩增为阳性，Bva、Bvv及汉赛巴尔通体等其它种巴尔通体和根癌土壤杆菌及大肠杆菌等非巴尔通体属细菌的核酸样品检测均未见荧光信号，扩增结果均为阴性，空白对照NTC为阴性。(图6)

Bb是一种重要致病性病原体，能够引起人卡瑞恩病等严重疾病，其主要宿主为人类，传播媒介为昆虫白蛉，此病在抗生素应用以前病死率极高。为了便于开展对Bb的检测和监测调查，本发明建立了实时荧光TaqMan探针PCR方法，用以方便、快捷、灵敏、特异地检出该菌。

本发明选取Bb特异的一段基因序列，依据这段特异基因序列，设计引物与TaqMan探针。应用目标基因克隆质粒作为标准品，检测敏感性、扩增效率等指标，应用多种巴尔通体和其它种属的细菌共计39种菌株作为阴性对照进一步验证方法的特异性，建立了Bb的实时荧光探针定量PCR检测方法。除目标菌外，其它11种巴尔通体、20余株其它种属细菌和犬、猫、人、鼠和蜱的基因组DNA均无扩增信号，表明该方法具有很好的特异性，能够满足一般临床样品要求，不会出现假阳性反应。所设计的探针具有极高的敏感性，最低检测限可达到每个PCR反应检出3个拷贝的目的基因。10倍比稀释标准品6次平行重复实验的组内和组间变异值均较低，具有很好的重复性，表明该方法稳定、规范操作可实现数据的良好重复性，数据可靠。标准曲线的绘制反应出Cq值与质粒浓度有良好的线性关系和高扩增效率，说明PCR反应条件得到了最佳优化、实验操作准确，结果可信。因而，本发明建立的实时荧光探针定量PCR方法可为Bb引起一系列疾病的早期临床诊断、疾病监测和筛查以及流行病学调查提供一种高效的实验室检测手段。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

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Claims

1.用于检测杆菌样巴尔通体的TaqMan实时荧光定量PCR引物及探针，其特征在于，

所述引物包括：

上游引物Bb2F：5′-CAATTATCATCATTATTTGCTCCTGG-3′

下游引物Bb2R：5′-TACTGCTGAGGTTGGGCGA-3′

所述探针为：

探针BbT：5′-F-AGAAGACGATCCGTTACAT-Q-3′

其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的引物及探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为MGB。

3.含有权利要求1所述引物及探针的用于TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

6.TaqMan实时荧光定量PCR检测杆菌样巴尔通体的方法，其是利用权利要求1或2所述引物及探针，或权利要求3-5任一项所述试剂盒对杆菌样巴尔通体进行TaqMan实时荧光定量PCR检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取样品组织中的总DNA；

3)分析PCR产物。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μl计为：

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃2分钟，单个循环；95℃3秒，60℃3秒，共40个循环。