CN110669852A - 用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒，属于生物检测技术领域。以高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌基因组中ampR基因序列为标志物，并以该特异性序列设计引物，最后基于聚合酶链反应，完成对高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的定性检测，以弥补现有技术中肺炎克雷伯菌定性检测方法只能通过是否为粘液型来判断肺炎克雷伯菌的毒力，而无法区分非粘液型菌株中的毒力差异，从而保证了检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的标志物、试剂盒及使用方法的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒，尤其涉及一种用于检测肺炎克雷伯菌毒力水平的试剂盒及其使用方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
肺炎克雷伯菌为革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科、克雷伯菌属，广泛分布于自然界，该菌近年来成为仅次于大肠杆菌的最重要的条件致病菌，主要存在于人体上呼吸道和肠道，属于条件致病菌，即一般情况下，肺炎克雷伯菌不致病，当机体免疫力低下或长期使用抗生素导致菌群失调时可引起感染。肺炎克雷伯菌包括高毒力肺炎克雷伯菌和低毒力（普通）肺炎克雷伯菌，其中，两者区别在于：一、前者可感染无基础疾病的年轻人群，而后者多发生在长期卧床或住院的免疫力低下的患者，主要引起院内感染，威胁重症病人；二、前者感染多以原发性肝脓肿为首要症状，并可转移感染，导致其他组织的感染包括脾肝脓肿、肺炎等严重社区获得性疾病，并能转移播散感染；三、前者培养后的菌落多为高粘液性，所以前者也被称为高黏性肺炎克雷伯杆菌，实验室用拉丝试验来测定肺炎克雷伯杆菌的黏性来判定是否为高毒力肺炎克雷伯菌。
目前，有关高毒力肺炎克雷伯菌的菌株鉴定尚无统一标准，通常以临床上将肺炎克雷伯菌粘液拉丝实验为阳性，且引起患者感染并伴全身转移的菌株鉴定为高毒力肺炎克雷伯菌。故，现在普遍使用拉丝实验作为判断肺炎克雷伯菌临床分离株是否为高毒力肺炎克雷伯菌的粗略筛选实验，但前期研究结果证实，临床上并不是所有高毒力肺炎克雷伯菌都具有高粘液性特征，因此，不能仅凭高粘液型鉴定高毒力。
论文文献“高毒力肺炎克雷伯菌的研究进展，邱世洁等，2018年3月”中记载：目前尚无金标准对高毒力肺炎克雷伯菌做出初步的鉴定，大部分实验室仅通过拉丝试验初步判断是否为高毒力肺炎克雷伯菌，具体为：使用接种环轻触琼脂平板上过夜培养的菌落，若有黏液丝并拉丝长度大于5mm即可初步判断为高毒力肺炎克雷伯菌。但目前仍不清楚是否所有的高毒力肺炎克雷伯菌都表现出高黏液性；以及认为在高毒力肺炎克雷伯菌中编码RmpA/RmpA2的主要有两个基因，分别为染色体上的c-rmpA基因及质粒上的p-rmpA/p-rmpA2基因。
论文文献“医院内高黏液性肺炎克雷伯菌的流行分布、毒力基因及临床特征分析，田李均等，2017年1月”中记载：高毒力肺炎克雷伯菌在琼脂平板的菌落生产表现为高黏液性，通过拉丝实验半定量定义。虽然是否所有的高毒力肺炎克雷伯菌都具有高黏液性目前仍不清楚，但是由于高黏性特征与引起侵袭性感染的肺炎克雷伯菌的毒力密切相关，且缺乏其他特异性的诊断指标，故目前多数研究仍将拉丝试验阳性作为高毒力肺炎克雷伯菌的一个诊断指标。
发明内容
发明人在研究中发现一组不具有高粘液性特征（即非粘液型）、动物实验呈现高死亡率的肺炎克雷伯菌，同时，临床信息也显示感染这一组肺炎克雷伯菌的病人也呈现高死亡率，即表现为高毒力；采用比较基因组学法，得知：这一组高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的基因组中含有ampR基因，而其他低毒力特征的非粘液型肺炎克雷伯菌不含有ampR基因，因此，基于这一研究结果，将ampR基因作为生物标志物，设计特异性引物且应用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒中。
本发明旨在解决现有技术问题，而提出了用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒。在本技术方案中，试剂盒以ampR基因为生物标志物，基于聚合酶链反应，完成对高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的定性检测，以弥补现有技术中高毒力肺炎克雷伯菌检测方法只能先通过是否为高粘液型来判断，而无法鉴定非粘液型肺炎克雷伯菌毒力的问题。
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
非粘液型肺炎克雷伯菌内ampR基因作为标志物在制备检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒中的应用，所述标志物经检测为阳性，则判断非粘液型肺炎克雷伯菌为高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌；反之，所述标志物经检测为阴性，则判断非粘液型肺炎克雷伯菌为低毒力非粘液型肺炎克雷伯菌；
所述ampR基因序列如SEQ ID NO.1所示。
用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒，包括PCR反应液、用于扩增标志物SEQ ID NO.1的引物、阳性对照及阴性对照；其中，
PCR反应液：包括浓度为5U/μL Taq聚合酶、浓度为200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为20mmol/L氯化镁溶液、浓度为500mmol/L氯化钾溶液、体积比为0.2%曲拉通溶液、体积比为10%甲酰胺溶液以及浓度为10mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸；
引物：包括上游引物和下游引物，上游引物序列为5’- AACAGGCGGCTGAACATACA-3’，下游引物序列为5’- TTTACCCTGCTGCGCTCATT-3’，且上游引物及下游引物浓度均为0.5μmol/L；
阳性对照：为临床医院收集的非粘液型且动物实验呈高致死率的肺炎克雷伯菌核酸样本（高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的DNA序列），即经全基因组测序确定含有标志物ampR基因且动物实验呈高致死率的临床非粘液型肺炎克雷伯菌核酸。
阴性对照：为临床医院收集的非粘液型且动物实验呈非致死性的肺炎克雷伯菌核酸样本（低毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的DNA序列），即经全基因组测序确定不含有标志物ampR基因且动物实验呈非致死性的临床非粘液型肺炎克雷伯菌核酸。
用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
S1：取样
将待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌接种于培养基中，培养，取培养液为待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌样品；
S2：PCR扩增体系配制
取至少四个PCR管，并分别编号为阳性对照管、阴性对照管、实验管及空白对照管；PCR扩增体系为20µL，其中，
阳性对照管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL阳性对照；
阴性对照管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL阴性对照；
实验管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL经步骤S1所得的待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌样品；
空白对照管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL灭菌水；
S3：扩增反应
将经步骤S2进行PCR扩增体系配制后的所有PCR管在转速为3000rpm的条件下，离心30s，再放置于PCR仪中扩增，扩增反应的条件为：
在94℃条件下反应3min；然后35个循环，其中，包括依次在94℃条件下反应30s，在60℃条件下反应30s，在72℃条件下反应30s；最后，在72℃条件下反应5min，然后在4℃条件下保持；
S4：判断及结果
将经步骤S3扩增反应后的产物分别进行电泳，观测182bp处是否出现条带；
若阳性对照管扩增反应后的产物对应出现条带，以及阴性对照管扩增反应后的产物和空白对照管扩增反应后的产物对应均不出现条带，则判断实验成功，然后，判读实验样本的结果；
若阳性对照管扩增反应后的产物对应不出现条带，或者阴性对照管和空白对照管中扩增反应后的产物均对应出现条带，或者阴性对照管和空白对照管中任一对照管扩增反应后的产物对应出现条带，则判断实验不成功，则需重新实验，直至实验成功，判读实验样本的结果。
进一步的，所述待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌样品中，OD600nm为0.6～0.8。同时，在步骤S1中，所述非粘液型肺炎克雷伯菌培养液中的待检测非粘液型肺炎克雷伯菌已经生化反应、质谱或拉丝实验进行鉴定，且所述生化反应、质谱或拉丝实验的鉴定技术为现有成熟技术；在步骤S1中，所涉及的接种、培养及菌浓度检测等为成熟的现有技术，比如：参考《临床细菌学实验室操作指南，于岩岩等译》。
所述PCR仪为现有成熟技术，如：东胜龙ETC811。
所述电泳为现有成熟技术，如：琼脂糖凝胶电泳。
在本技术方案中，所述“高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌”中的“高毒力”具体表现：在临床上病人死亡率高，且该菌株接种动物后死亡率高。
采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
1）在本发明中，试剂盒以ampR基因序列为生物标志物，并基于聚合酶链反应，完成对高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的定性检测，以弥补现有技术中高毒力肺炎克雷伯菌检测方法只能先通过是否为高粘液型来判断，而无法鉴定非粘液型肺炎克雷伯菌毒力问题；
2）本发明设计原理合理，结果判断较容易。基于比较基因组学方法，从高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌基因组中筛选出ampR基因，该基因的存在与非粘液型肺炎克雷伯菌的毒力相关，因此，基于该基因序列而设计特异性引物，经优化，筛选出扩增效果极佳且用于靶多核苷酸扩增的引物，即最终限定为非特异性反应较小的上游引物及下游引物，以保证PCR扩增体系反应为较小的非特异性反应；最终，以聚合酶链反应，定性检测出高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌，并具有较高的特异性；
3）在试剂盒的使用过程中，基于本检测试剂盒配制PCR扩增体系，然后进行扩增反应，在特定温度、特定时间以及特定循环次数等条件限制下，保证了较小的非特异性反应，提高扩增效率和质量。同时，在PCR扩增体系配制中，向实验管中直接加入非粘液型肺炎克雷伯菌培养液，使得检测过程简单、快速，仅需1～2h，即可完成对高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的定性检测，耗时短，适用性强；
4）在本试剂盒使用方法中，依次加入PCR反应液、上游引物、下游引物及非粘液型肺炎克雷伯菌培养液，由于各物质溶液存在较大的体积差异，而以该顺序加入，一方面保障实验的方便操作性；另一方面由于较小体积的溶液不易加入至空PCR管中，从而导致假阴性，故，间接的提高高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的检测准确性。
附图说明
图1为本发明中试剂盒使用方法的流程图；
图2为PCR反应后，扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳后的结果，其中，泳道M：核酸（DNA）分子量标准 （arker）；泳道1：阴性对照管的PCR扩增产物；泳道2：阳性对照管的PCR扩增产物；泳道3：空白对照管的PCR扩增产物；泳道4-7：实验管（样本）的PCR扩增产物；
图3为高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌生物标志物阳性样本、阴性样本在动物体内的致死率比较。
具体实施方式
下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
非粘液型肺炎克雷伯菌内ampR基因作为标志物在制备检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒中的应用，所述标志物经检测为阳性，则判断非粘液型肺炎克雷伯菌为高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌；反之，所述标志物经检测为阴性，则判断非粘液型肺炎克雷伯菌为低毒力非粘液型肺炎克雷伯菌；
所述ampR基因序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒，包括PCR反应液、用于扩增标志物SEQ ID NO.1的引物、阳性对照及阴性对照；其中，
PCR反应液：包括浓度为5U/μL Taq聚合酶、浓度为200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为20mmol/L氯化镁溶液、浓度为500mmol/L氯化钾溶液、体积比为0.2%曲拉通溶液、体积比为10%甲酰胺溶液以及浓度为10mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸；
引物：包括上游引物和下游引物，上游引物序列为5’- AACAGGCGGCTGAACATACA-3’，下游引物序列为5’- TTTACCCTGCTGCGCTCATT-3’，且上游引物及下游引物浓度均为0.5μmol/L；
阳性对照：为临床医院收集的非粘液型且动物实验呈高致死率的肺炎克雷伯菌核酸样本（高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的DNA序列），即全基因组测序确定含有标志物ampR基因且动物实验呈高致死率的临床非粘液型肺炎克雷伯菌核酸。
阴性对照：为临床医院收集的非粘液型且动物实验呈非致死性的肺炎克雷伯菌核酸样本（低毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的DNA序列），即全基因组测序确定不含有标志物ampR基因且动物实验呈非致死性的临床非粘液型肺炎克雷伯菌核酸。
实施例3
在实施例1-2的基础上，更进一步的，如图1所示：
用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
S1：取样
将待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌接种于培养基中，培养，取培养液为待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌样品；
S2：PCR扩增体系配制
取四个PCR管，并分别编号为阳性对照管、阴性对照管、实验管及空白对照管；PCR扩增体系为20µL，其中，
阳性对照管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL阳性对照；
阴性对照管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL阴性对照；
实验管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL经步骤S1所得的待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌样品；
空白对照管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL灭菌水；
S3：扩增反应
将经步骤S2进行PCR扩增体系配制后的所有PCR管在转速为3000rpm的条件下，离心30s，再放置于PCR仪中扩增，扩增反应的条件为：
在94℃条件下反应3min；然后35个循环，其中，包括依次在94℃条件下反应30s，在60℃条件下反应30s，在72℃条件下反应30s；最后，在72℃条件下反应5min，然后在4℃条件下保持；
S4：判断及结果
将经步骤S3扩增反应后的产物分别进行电泳，观测182bp处是否出现条带；
若阳性对照管扩增反应后的产物对应出现条带，以及阴性对照管扩增反应后的产物和空白对照管扩增反应后的产物对应均不出现条带，则判断实验成功，然后，判读实验样本的结果；
若阳性对照管扩增反应后的产物对应不出现条带，或者阴性对照管和空白对照管中扩增反应后的产物均对应出现条带，或者阴性对照管和空白对照管中任一对照管扩增反应后的产物对应出现条带，则判断实验不成功，则需重新实验，直至实验成功，判读实验样本的结果。
实施例4
在实施例3的基础上，在待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌样品中，OD600nm为0.6；
同时，在步骤S1中，非粘液型肺炎克雷伯菌培养液中的待检测非粘液型肺炎克雷伯菌已经生化反应进行鉴定，且生化反应的鉴定技术为现有成熟技术；
在步骤S1中，所涉及的接种、培养及菌浓度检测等为成熟的现有技术，比如：参考《临床细菌学实验室操作指南，于岩岩等译》。
实施例5
在实施例4的基础上，本实施例区别在于：
在待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌样品中，OD600nm为0.8；
同时，在步骤S1中，非粘液型肺炎克雷伯菌培养液中的待检测非粘液型肺炎克雷伯菌已经质谱进行鉴定，且质谱的鉴定技术为现有成熟技术；
PCR仪为东胜龙ETC811。
实施例6
在实施例4-5的基础上，本实施例区别在于：
在待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌样品中，OD600nm为0.7；
同时，在步骤S1中，非粘液型肺炎克雷伯菌培养液中的待检测非粘液型肺炎克雷伯菌已经拉丝实验进行鉴定，且拉丝实验的鉴定技术为现有成熟技术；
电泳为琼脂糖凝胶电泳。
实施例7
生物标志物与高毒力的非粘液型肺炎克雷伯菌的关联性验证。
一、应用Spine软件对不同毒力的非粘液型肺炎克雷伯菌全基因组序列进行比较，筛选出一段位于染色体上、且为高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌特有的ampR基因序列（如SEQID NO.1所示），以该基因序列为标志物；
二、使用Prokka软件将130株非粘液型临床分离株的全基因组序列进行注释，判定是否有标志物的存在。其中，一个临床分离株对应一个病例，比如：130株临床分离株对应130例感染非粘液型肺炎克雷伯菌的病人（样本的具体数量是以最大限度的能力设置）；
三、设计原理
高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌标志物阳性样本死亡率明显高于阴性样本死亡率（如下表1所示），且其结果具有统计学意义（卡方检验，p<0.01）。
采用比较基因组学方法，筛选出高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌基因组中的ampR基因（如SEQ ID NO.1所示），并针对该基因序列设计特异性引物。在此基础上，提供一种用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒及其使用方法（如图1所示）。
四、基于聚合酶链反应，对检测试剂盒进行使用，包括如下步骤：
S1：取样
将待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌接种于培养基中，直至培养OD600nm为0.7，取培养液为待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌样品；
2）PCR扩增体系配制
取七个PCR管，并分别编号为阳性对照管（一个）、阴性对照管（一个）、实验管（四个）及空白对照管（一个）；PCR扩增体系为20µL，其中，阳性对照管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL阳性对照；
阴性对照管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL阴性对照；
实验管中分别加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL经步骤1）所得的待检测的非粘液型肺炎克雷伯菌样品；
空白对照管中加入17μL PCR反应液、1μL上游引物、1μL下游引物及1μL灭菌水；
3)扩增反应
将经步骤S1进行PCR扩增体系配制后的所有PCR管在转速为3000rpm的条件下，离心30s，再放置于PCR仪（如：东胜龙ETC811）中扩增，扩增反应的条件如下表2所示；
在20µL PCR扩增体系中，Taq聚合酶浓度为5U/μL、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液浓度为200mmol/L、氯化镁溶液浓度为20mmol/L、氯化钾溶液浓度为500mmol/L、曲拉通溶液体积比为0.2%、甲酰胺溶液体积比为10%以及脱氧核糖核苷三磷酸浓度为10mmol/L。
在20µL PCR扩增体系中，上游引物及下游引物浓度均为0.5μmol/L，其中，
上游引物序列为：5’- AACAGGCGGCTGAACATACA-3’；
下游引物序列是：5’- TTTACCCTGCTGCGCTCATT-3’。
五、判断与结果分析
PCR扩增反应后，将各PCR反应产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳，182bp处出现条带为阳性（如图2所示）。在130株经全基因组测序验证的非粘液型肺炎克雷伯菌临床分离株中，含有高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌标志物的样本结果均为阳性；不含有高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌标志物的样本结果均为阴性。
六、验证高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌标志物检测阳性与毒力之间的关联
利用非粘液型肺炎克雷伯菌肺炎感染模型，以验证高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌标志物阳性样本的毒力。
具体的，随机选取高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌标志物检测阳性样本与阴性样本各2例（分别编号为非粘液型标志物阳性菌1、非粘液型标志物阴性菌1、非粘液型标志物阳性菌2及非粘液型标志物阴性菌2），此外，以ST23型高毒力粘液型肺炎克雷伯菌（临床分离株）为高毒力对照样本，以低毒力标准株ATCC700721（购自美国模式菌种收集中心）为低毒力对照样本。
以1×107 CFU的菌量经气管感染6～8 周BALB/c小鼠，7天后观察存活率，结果如图3所示，结果显示：经生物标志物阳性样本感染2天，小鼠死亡率为80～100%，存活率为0～20%；生物标志物阴性样本感染7天，死亡率为20～40%，存活率为60～80%，同时经log-rank检验，死亡率存在显著性差异（p<0.0001）。且表明：高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌标志物阳性菌株感染小鼠后呈现高死亡率，表明该菌株为高毒力的菌株。
此外，对来自蚌埠市（38株）、合肥市（13株）及六安市（11株）的非粘液型肺炎克雷伯菌的临床分离菌株（共62株）进行检测，验证了用于定性检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的标志物、试剂盒及使用方法的临床应用价值。结果显示：高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌标志物阳性样本死亡率明显高于与阴性样本死亡率（如表3所示），其结果均具有统计学意义（卡方检验，p<0.01）。
本发明第一方面示出一种检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的标志物，其具体为ampR基因序列；
第二方面示出基于该标志物设计特异性引物；
第三方面示出用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒及使用方法，在通常情况下，一般认为非粘液型肺炎克雷伯菌毒力较弱，临床医生无法准确判断病人是否使用抗生素。而本发明能够迅速、准确地检测非粘液型肺炎克雷伯菌中的高毒力株，因此，该本技术方案对非粘液型肺炎克雷伯菌感染病人的治疗方案制定具有重要的参考意义。
以上所述的仅是本发明的一般实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌标志物序列、特异性引物的前提下，还可以开发出若干其他方法和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市人民医院
<120> 用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒
<130> 2019.9.17
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 876
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 1
atggtcagac gttatctccc ccttaacccg ctgcgcgcct ttgaggccgc cgcccgtcat 60
ctcagtttta cccgcgcggc gattgagctg aatgtcaccc atgccgccgt cagccagcag 120
gtcagggcgc tggaagaaca actcggctgt gtgctgttta cccgcgtctc gcgcgggctg 180
gtgctgaccc atgaaggtga gggattactg ccggtgctca atgaggcgtt tgaccggatt 240
gcggatactc tggagtgttt ttctcacggg cagttccgtg agcgggtgaa agtcggtgcg 300
gtgggaacat ttgccgcagg ctggctgctg ccgcgtctgg ccggattcta tgacagccat 360
ccgcatattg atctgcatat ctccacccat aacaatcatg tggacccggc ggcggaaggg 420
catgattata cgatccgttt cggtaacggc gcgtggcatg agtcagatgc ggaactgatt 480
ttcagtgcac cacacgctcc gctgtgctca ccggccattg cagaacagtt acagcagccg 540
gatgatgttc accgctttac cctgctgcgc tcattccgcc gggatgaatg gagccgctgg 600
ctggattgtg cgggcggcac accgccttcc ccgtcacagc cggtaatggt gttcgatacc 660
tcactggcca tggccgaggc ggcacaactg ggtgccgggg tagcgatcgc accggtatgt 720
atgttcagcc gcctgttaca gtcaggcgca ctggtacagc cgtttgccgc agaaatcacc 780
ctcggcggct actggctgac gcggttacag tcccgtacgg aaaccccggc catgcagcaa 840
ttcgcccgct ggctgctgaa tacggcggcg gcgtaa 876
Claims (8)
1.非粘液型肺炎克雷伯菌内ampR基因作为标志物在制备检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒中的应用，所述ampR基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、用于扩增标志物SEQ ID NO.1的引物、阳性对照及阴性对照；其中，引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为5’- AACAGGCGGCTGAACATACA-3’，下游引物序列为5’- TTTACCCTGCTGCGCTCATT-3’。
3.根据权利要求2所述的用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括浓度为5U/μL Taq聚合酶、浓度为200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为20mmol/L氯化镁溶液、浓度为500mmol/L氯化钾溶液、体积比为0.2%曲拉通溶液、体积比为10%甲酰胺溶液以及浓度为10mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸。
4.根据权利要求2所述的用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于，所述上游引物及下游引物浓度均为0.5μmol/L。
5.根据权利要求2所述的用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为经全基因组测序确定含有标志物ampR基因且动物实验呈高致死率的非粘液型肺炎克雷伯菌核酸；
所述阴性对照为经全基因组测序确定不含有标志物ampR基因且动物实验呈非致死性的非粘液型肺炎克雷伯菌核酸。
6.根据权利要求2所述的用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用中：配制PCR扩增体系，并将PCR扩增体系分别在转速为3000rpm的条件下，离心30s，再放置于PCR仪中扩增。
7.根据权利要求6所述的用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增体系配制中，依次加入PCR反应液、上游引物及下游引物，再加入非粘液型肺炎克雷伯菌培养液、阳性对照、阴性对照或灭菌水。
8.根据权利要求6所述的用于检测高毒力非粘液型肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应的条件为：
在94℃条件下反应3min；然后35个循环，其中，包括依次在94℃条件下反应30s，在60℃条件下反应30s，在72℃条件下反应30s；最后，在72℃条件下反应5min，然后在4℃条件下保持。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200110 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |