CN102559905A

CN102559905A - 一组用于结核分枝杆菌实时荧光pcr检测的引物探针及其使用方法

Info

Publication number: CN102559905A
Application number: CN2012100233820A
Authority: CN
Inventors: TuofuZhu(朱托夫)
Original assignee: GUANGZHOU SUPBIO BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU SUPBIO BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-02-02
Filing date: 2012-02-02
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明公开了针对结核分枝杆菌(M.Tuberculosis，MTB)IS6110序列设计并筛选出的一组特异引物和探针及其使用方法，用于结核分枝杆菌DNA检测的实时荧光PCR，PCR反应体系包括防污染的UNG酶，属于生物技术领域。应用本发明引物和探针建立的实时荧光PCR检测灵敏度高，特异性强，尤其在MTB载量低的痰涂片阴性痰标本和血标本中的检测阳性率高于其他同类检测方法。

Description

一组用于结核分枝杆菌实时荧光PCR检测的引物探针及其使用方法

技术领域

本发明针对结核分枝杆菌(M.Tuberculosis，MTB)IS6110序列设计并筛选出的一组特异引物和探针，用于结核分枝杆菌实时荧光PCR检测，属于生物技术领域。

背景技术

TB是由MTB感染引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病。MTB可以在人体内潜伏感染长达数年乃至终生，全球人口的三分之一(约20亿)被认为感染了潜伏态的TB，中国人群中约44.6％有潜伏TB感染，而且其中超过10％的人在他们的一生中会发展成活动性疾病。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)2010年全球TB控制报告，2009年全球因TB死亡约170万，新增TB病人约940万。这些病人大多集中在诊断治疗技术落后、缺乏资金支持的发展中国家。我国的TB病人数居世界第二位，仅次于印度，每年发病发病人数约130万，成为我国急需关注的公共卫生问题和社会问题。

体内潜伏MTB被激活以及肺结核(Pulmonary Tuberculosis，PTB)病源传染是导致大多数PTB发病的主要原因。提高检测阳性率和及早诊断治疗MTB感染者是控制TB传播的最直接有效的手段之一。及早发现活动性PTB病人，及时采取隔离和治疗措施，则能显著降低发病率、死亡率和传染率。目前常见TB诊断方法有：结核菌菌数皮试试验(PPD)、计算机断层扫描(CT)、痰涂片法和痰培养法。PPD因为特异性差，容易出现假阳性结果而不能作为诊断依据；CT灵敏度低，只有在有出现肺部病灶时才能被诊断，达不到早期诊断效果，而且肺结核与其他肺部疾病难以区分，且不能作为确诊诊断；痰涂片法简单快速，但灵敏度不高，不能区分MTB和其他抗酸分支杆菌；培养法被誉为TB诊断“金标准”，可以鉴定MTB与其他分支杆菌，但诊断周期长，通常需要4～8周，且灵敏性低，延误病人治疗。

近十年来兴起的TB分子诊断技术如实时荧光PCR(Real Time PCR，RT PCR)等，提高了TB诊断的灵敏度和特异性。RT PCR利用一对MTB特异性引物和特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq emzyme)、4种脱氧核酸苷酸(dNTP)等成分，用体外热循环扩增法检测MTB基因片段，通过检测荧光强度变化来判断标本中是否存在MTB DNA。RT PCR检测对象为病原体基因保守序列，不受细胞表型和耐药性影响，可提高阳性检出率和结果准确性，而且在数小时内即可报告结果。

现有的RT PCR虽然能提高TB检测灵敏性和特异性，但其在痰涂片阴性病人(包括菌阴病人)检测阳性率依然有待提高。目前涂片阴性病人在总TB病人数60％左右，该部分病人因痰液中MTB菌量不高而难以被检测。虽然涂阴病人吐菌量不高，但他们是TB重要传染源之一。据报道，约20％受检查的涂阴病人密切接触者最终被确诊为TB。因此如何提高TB涂阴病人中检测阳性率，是RT PCR亟需解决的问题。

RT PCR体系中引物和探针的选择和设计是提高RT PCR检测效率的有效办法，本发明针对MTB复合群基因组重复性因子插入序列IS6110设计和筛选出一组用于荧光PCR的高特异性和灵敏度的引物和探针序列及其使用方法。本发明方法采用荧光PCR检测法，应用TaqMan荧光探针原理，加入一对TB复合群的特异性引物和一条特异性荧光双标记探针，两端分别标记一个报告荧光基团(FAM)和一个淬灭荧光基团(Taqman-MGB)。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，通过检测荧光信号的增加来判断结果阳性，提示标本含有TB DNA。本发明方法具有以下特点：<i>灵敏度高；<ii>兼容性好；<iii>高通量；<iv>特异性高。由本发明设计的引物探针序列建立的TB实时荧光PCR检测方法能明显提高RT PCR检测效率，通过临床标本检测证实其在涂阴病人标本和血标本检测阳性率高于其他RT PCR检测。此外，本发明可用于对TB药物治疗效果评价、指导用药和病情进展等。

发明内容

本发明目的在于设计一组高敏感和特异性的引物探针序列，用于结核分枝杆菌荧光PCR检测，进一步提高荧光PCR检测灵敏度。本发明设计的引物探针以及基于该引物探针所建立的荧光PCR能有效提高临床上结核涂阴病人和血标本的检出率。

作为本发明的核心，所述的一组用于MTB实时荧光PCR检测的核苷酸序列：

SEQ ID NO.1：GTC CAC GCC GCC AAC TAC

SEQ ID NO.2：ATG CCC TCA CGG TTC AGG

SEQ ID NO.3：FAM-CCG CAAAGT GTG GCT A-MGB

其中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为实时荧光PCR检测结核分枝杆菌的引物对；SEQ ID NO.3是实时荧光PCR检测结核分枝杆菌的探针序列。

基于上述引物探针序列，本发明对所述的荧光PCR反应体系进行优化，其中体系各组分浓度如：

20mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM KCl，5mM(NH₄)SO₄，2mM MgCl₂，0.2mM dNTP(dATP， dCTP，dUTP，dGTP或dTTP)，0.4mM引物1，0.4mM引物2，0.2mM探针，1.5U Hot Start Taq emzyme和0.1UUNG酶；

上述PCR反应体系中的引物1、2分别对应为SEQ ID NO.1、2；探针为SEQ ID NO.3。

针对上述引物探针序列和PCR反应体系，设置的PCR反应参数为：第一步：37℃5分钟；第二步：95℃10分钟；第三步：95℃15秒，60℃60秒；40个循环。60℃时设置FAM荧光通道采集荧光。

附图说明

图1：为应用本发明设计的引物探针所建立的实时荧光PCR特异性实验检测图。

图2：为应用本发明设计的引物探针所建立的实时荧光PCR敏感性实验检测图。

图3：为应用本发明设计的引物探针所建立的实时荧光PCR对涂片阴性痰标本检测图。

图4：为应用本发明设计的引物探针所建立的实时荧光PCR对血标本检测图。

具体实施方式

实施例1：MTB实时荧光PCR检测法的引物和探针设计

从MTB基因组DNA中选择一条高度保守多拷贝数的IS6110基因(Genebank No.NC_000962)，针对该基因，用多种软件，根据引物的退火温度在55-65℃的原则，筛选出28组引物，经PCR比较结果后，选择了引物SEQ ID NO.1和NO.2，Blast同源性分析显示确认，选择的引物为TB复合群特异性序列，与其他序列无同源性。根据引物退火温度为60℃，探针退火温度高于引物退火温度10℃左右的原则，探针SEQ ID NO.3。扩增产物长度为70bp。

探针5’端标记FAM发光荧光基团，3’端标记Taqman-MGB淬灭荧光基团。PCR引物、探针序列见序列表。

实施例2：本发明MTB实时荧光PCR检测临床标本具体操作

1)配制反应液：根据上述发明内容2所述，在试剂准备区配制PCR反应，各物质浓度如下：20mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM KCl，5mM(NH₄)SO₄，2mM MgCl₂，0.2mM dNTP，0.4mM引物1，0.4mM引物2，0.2mM探针，1.5U Hot Start Taq emzyme和0.1U UNG；

配制反应液时，应包含2个对照管的反应液，包括：阴性对照和阳性对照。

2)加模板：在样本区，每个反应加2ul模板DNA，阴性对照用无菌生理盐水，阳性对照用结核分枝杆菌标准株H₃₇R_V基因组DNA。盖上反应管盖或96孔板膜。

3)PCR检测：在检测区，将配制好的PCR反应管放到ABI 7500荧光PCR仪上，按照实验设计设定阴阳性对照孔，循环程序参数设定为：

第一步：37℃5分钟；第二步：95℃10分钟；第三步：95℃15秒，60℃60秒；40个循环。60℃时设置FAM荧光通道采集荧光。

4)结果解释：将背景荧光设置为None，阈值基线设定为6至10cycles，阈值设定为阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线及背景信号的最高点为准，并落在阳性对照扩增曲线对数增长区段。Ct值显示为None的样本为阴性样本，Ct值小于或等于38的样本为阳性。Ct值大于38的样本可重复一次PCR实验，若仍出现Ct值，即可判断为阳性。

实施例3：MTB实时荧光PCR检测法特异性研究

选择MTB荧光PCR检测试剂盒国家标准品中阴性参考品的15种非结核分枝杆菌DNA作为模板，包括：鸟分枝杆菌、土地分枝杆菌、施氏分枝杆菌、堪萨斯分支杆菌、亚洲分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、偶然分枝杆菌、草分枝杆菌、巴西诺卡氏菌、北京棒杆菌、肺炎球菌、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌。以MTB标准株H₃₇Rv DNA作为本次实验阳性对照。用本发明RT PCR检测，模板量均为2ul，每个反应3个重复。

结果显示，只有MTB标准株H₃₇Rv DNA检测为阳性，其他均为阴性，证实本发明的引物与探针特异性极好。结果见附图1，扩增曲线为阳性对照。

实施例4：MTB实时荧光PCR检测法灵敏度研究

为考察本发明MTB实时荧光PCR检测法灵敏性，本实验根据MTB基因组大小，用TE buffer将提取的MTB基因组DNA稀释成8个系列浓度，分别相当于为：5×10⁶、5×10⁵、5×10⁴、5×10³、5×10²、50、5、和0.5，单位为菌数/ul。应用本发明设计的MTB实时荧光PCR对8个系列浓度的MTB基因组DNA检测，以及TE buffer为模板的阴性对照，每个浓度设3个重复，模板量为2ul，即每个反应中加入DNA量为1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、100、10和1个结核菌基因组DNA量。本发明的MTB实时荧光PCR检测法灵敏度可达1个结核菌基因组DNA量。结果见附图2，为应用本发明设计的引物探针所建立的实时荧光PCR敏感性实验检测图。

实施例5：由本发明设计的引物探针建立的MTB实时荧光PCR检测法检测临床标本结果与RTPCR试剂盒比较

为进一步证实MTB实时荧光PCR检测法在TB临床标本检测灵敏性，本实验选择了国内已上市的TB诊断被认为较好的RT PCR检测试剂盒作为对比试剂，共同对由广州市胸科医院收集的病人痰标本和血标本进行检测。入选标本分为3个队列：1、痰涂片阳性组，100例；2、痰涂片阴性组，150例；3、健康人和其他肺部疾病对照组，150例。其中队列1和队列2为临床诊断为TB。最终的结果比较如表1：

表1两种RT PCR结果比较(例)

结果显示，本发明MTB实时荧光PCR检测法与已上市RT PCR试剂盒特异性高。在涂阳组痰标本检测无区别，两种荧光PCR共同检测出9例阴性标本，后经痰培养结果证实为非结核分枝杆菌。而在极低病原载量的涂阴组痰标本检测对比证实，本发明实时荧光PCR检测灵敏度(34.6％)明显高于上市荧光PCR检测试剂盒(24％)。在血标本检测中，由于血标本中MTB量极少，目前没有上市的产品用于检测血样中MTB DNA。但从表1结果看出，在极低MTB载量的血标本中，本发明方法检测阳性率比已上市荧光PCR试剂盒高。图3为应用本发明设计的引物探针所建立的实时荧光PCR对涂片阴性痰标本检测图。图4为应用本发明设计的引物探针所建立的实时荧光PCR对血标本检测图。

Claims

1.一种用于结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法包括以结核杆菌复合群IS6110序列为目标序列设计并筛选的一组引物探针序列、基于该组引物探针序列所建立的荧光PCR反应体系以及PCR热循环参数。

2.根据权利要求1所述的一组用于结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法的核苷酸序列，其特征在于，序列表SEQ ID NO.1至序列SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列：

SEQ ID NO.1：GTC CAC GCC GCCAAC TAC

SEQ ID NO.2：ATG CCC TCA CGG TTC AGG

SEQ ID NO.3：FAM-CCG CAA AGT GTG GCT A-MGB

其中，EQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为荧光PCR检测结核分枝杆菌的引物对；SEQ ID NO.3是荧光PCR检测结核分枝杆菌的探针序列。

3.根据权利要求1所述的基于本发明设计的引物探针序列所建立的荧光PCR反应体系，其特征在于，反应体系的各组分浓度为：

20mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM KCl，5mM(NH₄)SO₄，2mM MgCl₂，0.2mM dNTP(dATP，dCTP，dUTP，dGTP或dTTP)，0.4mM引物1，0.4mM引物2，0.2mM探针，1.5U Hot Start Taqemzyme和0.1U UNG酶；

4.根据权利要求3所述的荧光PCR反应体系所设置的热循环参数，其特征在于：

第一步：37℃5分钟；第二步：95℃10分钟；第三步：95℃15秒，60℃60秒； 40个循环。60℃时设置FAM荧光通道采集荧光。