CN106811529A

CN106811529A - 结核分枝杆菌的荧光定量pcr检测试剂盒及引物、探针

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Publication number: CN106811529A
Application number: CN201710108469.0A
Authority: CN
Inventors: 车团结; 同重湘; 尤崇革; 谢小冬; 李琳; 李亚鹏
Original assignee: Suzhou Baiyuan Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Baiyuan Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2017-02-27
Filing date: 2017-02-27
Publication date: 2017-06-09

Abstract

本发明属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测，具体涉及一种结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、探针。该引物和探针根据结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列设计，包括具有SEQ NO.2所示碱基序列的正向引物、具有SEQ NO.3所示碱基序列的反向引物和具有SEQ NO.4所示序列的探针。采用本发明提供的引物、探针对结核分枝杆菌进行检测能够具有良好的准确性、特异性和灵敏度。经实验证实，本发明提供引物、探针的准确性可达100％，特异性良好，最低检测浓度为1.00×10³copies/ml。因此，采用包含该引物和探针的试剂盒能够实现对包含或不包含结核分枝杆菌的样品的快速、准确检测。

Description

结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒及引物、探针

技术领域

本发明属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测，具体涉及一种结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、探针。

背景技术

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一种慢性人畜共患病，能够感染人和多种哺乳动物以及禽类。其中导致人类感染的结核菌大多数是人结核分枝杆菌，也有10％以上是由牛分枝杆菌引起的。各个器官都可以被侵染，但以肺器官被侵染为多见，侵染结核分枝杆菌的组织和器官会形成肉芽肿和干酪样、钙化结节病变。结核病是一种危害严重的慢性传染病，全球有约20亿人被感染，每年新增结核病患者达800-1000万，每年因结核病死亡人数为200-300万，死于结核病的成年人多于艾滋病、疟疾和热带病死亡人数的总和。

我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病患病人数居世界第2位。当今结核病疫情呈现“六多”的特点：感染人数多，患病人数多，新发患者多，死亡人数多，农村患者多和耐药患者多。在我国，有450万活动性肺结核患者，其中痰AFB阳性者130万，每年因结核病死亡的人数30万。至2003年以来，肺结核经常占据国家CDC法定传染病(除艾滋病外)的首位。2012年全国肺结核病报告新增患者位居乙肝之后，新发生病例95万人，其中死亡2662例。结核病防治作为我国乃至全球疾病防治的重要课题，如何提供敏感、特异、快速、可靠、简便和适合临床的实验室检查技术是国内外研究重点。

目前，临床上应用的结核性分枝杆菌的检测方法包括涂片测试、培养测试和分子诊断测试等。涂片测试通过Ziehl-Neelsen染色确定耐酸性，虽然可简单快速的获得结果，但是检测敏感度仅为45％-80％；培养测试是诊断结核病的金标准，该方法对实验室的生物安全级别要求很高，在资源匮乏的国家或地区尚不能普及，此外，由于MTB生长缓慢导致MTB培养所需时间较长(4-8周)，仅采用MTB培养诊断结核病可能延误治疗，难以满足临床需求。近年来作为直接检测分枝杆菌、种系鉴定和药敏实验的许多分子生物学方法得到长足发展，其中实时荧光定量PCR技术由于具备较高的灵敏度和特异性，已逐渐应用于临床。并且利用荧光定量PCR技术使定性检测迈上了可以量化的台阶，达到实时检测、绝对定量和快速检测的目的，它与核酸分子杂交等技术一起领导着基因诊断的发展趋势，目前已经广泛应用于临床检验的多项指标中。开发结核分枝杆菌的荧光定量PCR试剂盒，将能定量检测结核分枝杆菌DNA的拷贝数，不但可以为临床提供更准确和有价值的诊断信息，还可以为临床上的疗效观察、用药剂量和用药时间等提供依据。由美国Cepheid公司开发基于实时荧光定量PCR技术的XpertMTB/RIF检测方法，可以实现快速的检测诊断结核分枝杆菌以及利福平耐药情况，目前该检测方法检测成本比较贵，在发展中国家尚未推广使用。国内市场上存在的有利用Roche公司Taqman探针技术开发的荧光定量PCR诊断试剂盒，但在特异性检测上尚存在缺陷，因此，开发一种具有较高诊断灵敏度和特异性的试剂盒，是目前亟待解决的重要问题。

发明内容

为此，本发明要解决的技术问题在于提供一种简单方便的、高灵敏性、特异性和准确性的结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的引物，所述引物为根据结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列设计，所述结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列如序列表中SEQ NO.1所示。所述groEL2基因在GeneBank中的Gene ID为：886354。

优选的，所述引物包括正向引物groEL2-F和反向引物groEL2-R，所述正向引物groEL2-F碱基序列如序列表中SEQ NO.2所示，所述反向引物groEL2-R碱基序列如序列表中SEQ NO.3所示。

所述的引物扩增的目的片段的大小为134bp。

本发明提供了基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的探针，所述探针为根据结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列设计，所述结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列如序列表中SEQ NO.1所示。

优选的，所述探针groEL2-P序列如序列表中SEQ NO.4所示，所述探针groEL2-P的5’端连接有荧光物质，3’端连接有淬灭物质

优选的，所述荧光物质为FAM，所述淬灭物质为TAMRA。

本发明提供了一种用于对结核分枝杆菌进行荧光定量PCR检测的试剂盒，包括所述的基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的引物和/或所述的基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的探针。

所述的试剂盒，包括荧光定量PCR扩增体系混合物：

2×Taqman mix，10μL；

groEL2-F，5μmol，1μL；

groEL2-R，5μmol，1μL；

groEL2-P，5μmol，1μL；

Taq酶，0.3μL；

ddH₂O，5.7μL。

所述的试剂盒，荧光定量PCR扩增反应程序设定如下：94℃预变性2分钟，94℃保持15秒，60℃保持40s并收集荧光信号，40个循环。

所述的试剂盒，还包括结核分枝杆菌阳性定量参考品和阴性对照、临界阳性对照以及强阳性对照。所述的试剂盒，以具有groEL2基因保守序列片段的pMD18-T-groEL2质粒为标准品，采用基因克隆技术，将结核分枝杆菌groEL2基因的保守片段插入到载体pMD18-T中，获得含有groEL2基因片段的重组质粒pMD18-T-GroEL2，以此作为标准品。所述groEL2基因片段的获得方法为：提取结核分枝杆菌(标准菌株)的基因组DNA作为模板，用所述正向引物groEL2-F和反向引物groEL2-R进行扩增，所得扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后得到目的片段。

所述的试剂盒，所述阳性定量参考品为上述pMD18-T-groEL2质粒标准品按照10倍梯度进行稀释，选取拷贝数为1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml和1.00×10⁴copies/ml的质粒作为所述阳性定量参考品；阴性对照：双蒸水；强阳性对照：拷贝数为10⁷-10⁸copies/ml的pMD18-T-groEL2质粒；临界阳性对照：拷贝数为10³-10⁴copies/ml的pMD18-T-groEL2质粒。

质粒拷贝数copies/ml＝质粒浓度g/ml×6.02×10²³copies/mol÷(质粒所含碱基数×660g/bp·mol)。

优选的，荧光定量PCR扩增反应条件：94℃预变性2分钟，94℃保持15秒，60℃保持40s并收集荧光信号，40个循环。

本发明提供一种对结核分枝杆菌的检测方法，使用本发明提供的试剂盒对待测样品的基因组DNA为模板进行荧光定量PCR检测，荧光定量PCR扩增反应程序如下：94℃预变性2分钟，94℃保持15秒，60℃保持40s并收集荧光信号，40个循环。优选的，所述基因组DNA的加入量1μL。

所述的对结核分枝杆菌的检测方法，通过荧光定量PCR检测可同时得到样品的Ct值以及扩增曲线，若所述扩增曲线呈现S型且Ct≤31，判定结果为结核分枝杆菌阳性；若无Ct值或者Ct值>35，则判定结果为结核分枝杆菌阴性；若31<Ct≤35，则此样本重测，当重新检测得到的Ct值≤35时，则判定为阳性，否则判定为阴性。同时，根据标准曲线可以对样品中结核分枝杆菌的拷贝数进行测定。

所述检测方法，所述标准曲线的绘制方法：对所述pMD18-T-groEL2质粒标准品稀释得到1.00×10⁸copies/ml、1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、1.00×10⁴copies/ml、1.00×10³copies/ml、1.00×10²copies/ml作为梯度模板，经荧光定量PCR检测，选择判定结果为结核分枝杆菌阳性的梯度模板作为阳性模板，以不同拷贝数的阳性模板的拷贝数的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到结核分枝杆菌的标准曲线。在所述标准曲线中，不同浓度梯度的标准品间线性关系(R²)达0.995，将荧光定量PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳，特异性条带亮度随模板拷贝数梯度降低而下降。

本发明相对现有技术具有如下优点：

(1)本发明以结核分枝杆菌groEL2基因作为检测的靶目标，经分析得到如SEQNO.1所示碱基序列的groEL2基因的保守序列，经NCBI-Blast分析，groEL2基因的保守序列在结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex)中具有高度同源性，而与其他微生物无同源性序列。根据结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列设计引物和探针，以该引物和探针对结核分枝杆菌的检测具有良好的准确性、特异性和灵敏度。通过实验证实，以本发明提供的引物对和探针对结核分枝杆菌的检测准确率可达100％，对其他标准菌种进行检测，未见荧光活性。

(2)本发明所述的用于对结核分枝杆菌进行荧光定量PCR检测的试剂盒，对临床结核痰样标本进行检测，可得97％的阳性检出率，具有较高的特异性和准确性，克服了现有结核杆菌检测方法的检测周期长和准确上存在的不足，可以对结核分枝杆菌复合群进行定量分析，在临床医学检测领域有较好的应用前景。

(3)本发明所述的用于对结核分枝杆菌进行荧光定量PCR检测的试剂盒，所述试剂盒中的所述阳性定量参考品、强阳性对照和临界阳性对照是根据在结核分枝杆菌复合群中高度同源的保守序列设计构建的质粒，使检测结果更可靠有效，如通过所述阳性定量参考品进行荧光定量PCR检测，确定了所述引物和探针的灵敏度可达1.00×10³copies/ml，该引物对和探针具有良好的灵敏性。

附图说明

图1为本发明实施例2中琼脂糖凝胶电泳检测目的基因的扩增变化图；泳道从左至右依次为：DNA分子标记物、扩增产物、扩增产物、阴性对照；

图2为本发明实施例4中标准品的扩增曲线图；

图3为本发明实施例4中标准曲线图；

图4为本发明实施例4中荧光定量PCR琼脂糖凝胶电泳结果图，泳道从左至右依次为：阴性对照、DNA分子标记、模板拷贝数为1.00×10⁸copies/ml扩增产物、模板拷贝数为1.00×10⁷copies/ml扩增产物、模板拷贝数为1.00×10⁶copies/ml扩增产物、模板拷贝数为1.00×10⁵copies/ml扩增产物、模板拷贝数为1.00×10⁴copies/ml扩增产物、模板拷贝数为1.00×10³copies/ml扩增产物、模板拷贝数为1.00×10²copies/ml扩增产物。

具体实施方式

下述实验例中的所有方法如无特别说明均为常规方法，所有引物、探针和测序工作由上海生工完成，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。

实施例1引物和探针的产生

通过NCBI管理的GeneBank(Gene ID为：886354)可得到groEL2基因序列，分析groEL2基因的保守序列，得到所述groEL2基因的保守序列如序列表中SEQ NO.1。根据groEL2基因的保守序列，使用Primer Premier5.0软件设计引物序列与探针序列，并经过Primer ExprssV3分析，确定了SEQ NO.2所示核苷酸序列的正向引物groEL2-F、具有SEQNO.3所示核苷酸序列的反向引物groEL2-R和具有SEQ NO.4所示核苷酸序列的探针groEL2-P。所述探针groEL2-P的5’端连接有荧光物质FAM，3’端连接有淬灭物质TAMRA。

在NCBI-Blast中分析序列的同源性(如下表1所示)，证实了本发明的引物和探针只能特异性扩增结合分枝杆菌复合群的碱基序列。

表1groEL2基因的保守序列的同源性

实施例2 groEL2基因标准品的制备

本实施提供了所述groEL2基因标准品的制备方法，包括如下步骤：

一、模板DNA的制备

1、提取结核分枝杆菌(标准菌株，ATCC27294)基因组DNA，作为roEL2基因的PCR扩增模板：

(1)取所述结核分枝杆菌(ATCC27294)的菌悬液600μL于试管中；用0.01M的EDTA(PH8.0)洗涤细菌，12000r/min离心10min，弃上清；

(2)向步骤(1)中得到的沉淀中加入PH＝8.0的TES至600μL，然后加入120μL的5％(w/v)SDS，溶解2-4h，冰上放置5min；

(3)向步骤(2)中得到的溶解液中加入500μL PH＝4.8的NaAc和100μL浓度为0.05mol/L的葡萄糖，颠倒混匀，冰上放置15min,12000r/min离心5min，分装到两个试管中；

(4)分别向上述的两个试管中加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合液，所述混合液中各组分的体积比为苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，将所述试管颠倒混匀，12000r/min离心10min，取上层水相至新的离心管；

(5)向上述的离心管中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，所述混合液中各组分的体积比为氯仿：异戊醇＝24：1，取上层水相至另一离心管；

(6)向步骤(5)中的离心管中加入1ml无水乙醇震荡并离心，倒去上清，晾干，加入20μL的TE缓冲液，完全溶解DNA，即为模板DNA，待用。

2、groEL2序列片段的PCR扩增：

(1)引物的设计与合成：根据实施例1中设计的引物序列，由上海生物工程有限公司合成，扩增预期片段大小为134bp；

(2)PCR反应体系和条件见下表2，

表2 PCR反应体系

成分	体积
		10×PCR buffer	5μl
dNTP(2.5μM)	1.5μl
		groEL2-F(5μM)	1μl
groEL2-R(5μM)	1μl
		模板DNA	2μl
Taq酶(5U)	1μl
			38.5μl
总体积	50μl

Taq酶采用Power Taq Plus DNA Polymerse，PCR扩增仪为西安天隆PCR modelMG96+；

扩增反应条件：94℃预变性5min，94℃保持30s，55℃保持30s，72℃保持30s，35个循环；72℃保持10min；

PCR扩增结束之后，取5μL扩增产物进行1％琼脂糖电泳(如图1所示)，检测PCR产物大小，然后采用Axygen公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的PCR扩增产物。

3、重组质粒pMD18-T-groEL2的构建和转化

(1)连接反应：将上述纯化得到的PCR扩增产物与pMD18-T(大连宝生物公司)进行连接，采用如下表3中的连接体系进行配制；

表3连接体系

成分	体积
		pMD18-T vector	1μL
回收DNA	2μL
		Solution 1	5μL
	2μL
		总体积	10μL

配制完成后置于16℃进行过夜连接反应，即得连接产物pMD18-T-groEL2质粒；

(2)pMD18-T-groEL2质粒的转化以及PCR鉴定：

①从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞(购于宝生物工程有限公司)，置于冰盒上使其自然解冻；

②取所述连接产物10μL加入含50μL的DH5α感受态细胞的1.5ml EP管中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟；

③42℃水浴中热休克90秒，热休克后立即置冰上冷却2min；

④向所述1.5ml EP管中加入预冷的400ml的LB液体培养基(不含氨苄青霉素)混匀后，37℃，200转轻摇培养1h；

⑤将上述培养液摇匀后取100μL涂布于含Amp、IPTG、X-gal的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；

⑥次日观察，从平板上挑取白色单克隆菌落稀释于50μL无菌水中，吸取2μL作为PCR模板，剩余的稀释菌液加入到20ml的LB培养基中进行扩摇；

⑦用载体通用引物RV-M/M13-47扩增上述稀释菌液，PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物大小鉴定阳性转化子。

引物RV-M/M13-47序列如下：

引物RV-M：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

引物M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

反应体系如下表4所示。

表4反应体系

成分	体积
		10×PCR buffer	2.5μL
dNTP(2.5μM)	0.5μL
		引物RV-M(5μM)	0.5μL
引物M13-47(5μM)	0.5μL
		模板	2μL
Taq酶(5U)	0.5μL
		ddH2O	18.5μL

扩增程序/反应条件为：94℃预变性5min，94℃保持30s，55℃保持30s，72℃保持1min，35个循环；72℃保持10min；

⑧采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。

实施例3 pMD18-T-groEL2质粒标准品的定量

本实施例提供了pMD18-T-groEL2质粒标准品的定量方法，包括如下步骤：

1、取将冻存的含有重组质粒pMD18-T-GroEL2的大肠杆菌DH5α100μL转种于5mL的LB液体培养基，37℃200rpm过夜摇培；

2、取1ml培养过夜的菌液转种于30mL的LB液体培养基，200rpm增菌培养2-3小时，然后采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒；

3、利用超微量紫外可见分光光度计对提取的质粒进行测定，测定A260、A280，根据A260/A280判断质粒的纯度，根据A260的吸光度值可计算出样品中质粒DNA的含量，即1OD值相当于50μg/ml双链DNA；

4、质粒pMD18-T-GroEL2浓度(拷贝数)计算：

(1)质粒的分子量＝2826bp(134bp+2692bp)×660(每对碱基的平均分子量)；

(2)测得质粒浓度为90.23μg/mL，因在进行实时荧光定量PCR时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/ml；

质粒copies/mL＝阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数，

其中阿伏伽德罗常数＝6.02×10²³copies/mol。

提取的质粒浓度copies/ml＝90.23×10^-9g/mL×6.02×10²³copies/mol÷(2826bp×660g/bp·mol)＝2.91×10¹⁰copies/mL。

10μL质粒+19μL的无菌水就得到浓度为1.00×10¹⁰copies/mL的质粒，再将该质粒进行10倍比稀释就可得到一系列浓度的pMD18-T-groEL2质粒标准品，并于-20℃保存备用。

实施例4实时荧光定量PCR标准曲线的建立和灵敏度检测

1、由实施例3中得到的按10倍比稀释的pMD18-T-groEL2质粒标准品，选取拷贝数为1.00×10⁸copies/mL、1.00×10⁷copies/mL、1.00×10⁶copies/mL、1.00×10⁵copies/mL、1.00×10⁴copies/mL、1.00×10³copies/mL、1.00×10²copies/mL等作为梯度模板；

2、荧光定量PCR反应混合液：

2×Taqman mix，10μL；

groEL2-F，5μmol，1μL；

groEL2-R，5μmol，1μL；

groEL2-P，5μmol，1μL；

Taq酶，0.3μL；

ddH2O，5.7μL；

3、将上述荧光定量PCR反应混合液分至96孔的0.2ml PCR反应管(Fast Optical96-well RXN plate,ABI公司)，每管加入不同浓度pMD18-T-groEL2质粒标准品1μL，贴上光化学反应盖膜；

4、按照以下荧光定量PCR程序进行反应：94℃预变性2分钟，94℃保持15秒，60℃保持40s并收集荧光信号，40个循环。荧光信号收集设定为F1(FAM)F2(TAMRA)，可使用ABIPrism7000、ABI Prism7500和Bio-rad option2等仪器参照上述步骤操作。

根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得上述梯度模板的Ct值以及扩增曲线，观察所述扩增曲线的信号，如图2所示，数据显示当所述pMD18-T-groEL2质粒拷贝数达到1.00×10³copies/mL时依然有荧光信号，但质粒拷贝数达到1.00×10²copies/ml时未检测到荧光信号，因此该方法的灵敏度为1.00×10³copies/ml。拷贝数在1.00×10³copies/ml和1.00×10⁸copies/ml范围内的增长曲线呈S型，将荧光定量PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳，特异性条带的亮度随样本梯度降低而下降(如图4所示)。可知，本发明提供试剂盒检测的线性范围为10³—10⁸copies/ml。

同时根据得到的上述梯度模板的Ct值以及扩增曲线(图2)判定所述梯度模板，若所述扩增曲线呈现S型且Ct≤31，判定结果为结核分枝杆菌阳性；若无Ct值或者Ct值>35，则判定结果为结核分枝杆菌阴性；若31<Ct≤35，则此样本重测，当重新检测得到的Ct值≤35时，则判定为阳性，否则判定为阴性。

5、标准曲线制备

选择上述判定结果为结核分枝杆菌阳性的梯度模板作为阳性模板，以不同拷贝数的阳性模板的拷贝数的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到结核分枝杆菌的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准，结果如图3所示，不同梯度标准样品间线性关系(R²)达0.9952，该反应检测结果可靠性高。通过所述标准曲线和待测样品的Ct值可对待检测样品中结核分枝杆菌快速定量检测。

实施例5试剂盒的制备和应用

本实施例提供用于对结核分枝杆菌进行荧光定量PCR检测的试剂盒，包括如下组分：荧光定量PCR反应混合液、阳性定量参考品、阳性对照、强阳性对照和阴性对照。各组分的成分如下：

所述荧光定量PCR反应混合液：

2×Taqman mix，10μL；

groEL2-F，5μmol，1μL；

groEL2-R，5μmol，1μL；

groEL2-P，5μmol，1μL；

Taq酶，0.3μL；

ddH2O，5.7μL。

阳性定量参考品：将实施例3制备得到的pMD18-T-groEL2质粒标准品按10倍比稀释，选取拷贝数为1.00×10⁷copies/mL、1.00×10⁶copies/mL、1.00×10⁵copies/mL和1.00×10⁴copies/mL的梯度样品作为阳性定量参考品。

阴性对照：双蒸水；强阳性对照：拷贝数为10⁷-10⁸copies/ml的pMD18-T-groEL2质粒；临界阳性对照：拷贝数为10³-10⁴copies/ml的pMD18-T-groEL2质粒。

荧光定量PCR的反应程序设定如下：

94℃预变性2分钟，94℃保持15秒，60℃保持40s并收集荧光信号，40个循环；荧光信号收集设定为F1(FAM)F2(TAMRA)，可使用ABI Prism7000、ABI Prism7500和Bio-radoption2等仪器参照上述步骤操作。

本实施例还提供一种对结核分枝杆菌的检测方法，利用上述用于对结核分枝杆菌进行荧光定量PCR检测的试剂盒对待测样品进行荧光定量PCR检测，取待测样品按照常规方法提取基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，所述模板加入量为1μL，按照如下荧光定量PCR的反应程序进行扩增：

在FAM荧光通道下对待侧样品中的结核分枝杆菌的结果进行判断：根据仪器要求设置好基线和阈值，仪器会自动分析计算出每个样本的Ct值和扩增曲线，若其扩增曲线呈现S型且Ct≤31，判定结果为结核分枝杆菌阳性；无Ct值或者Ct值>35，则判定结果为结核分枝杆菌阴性；如31<Ct≤35，则将此样本重测，当重新检测Ct值≤35时，则判定为阳性，否则判定为阴性。将待测样品的Ct值代入上述标准曲线中，对待检测样品中结核分枝杆菌快速定量检测

实施例6本发明试剂盒的特异性检测

用包括结核分枝杆菌在内的12种菌株的DNA提取出作为模板，采用实施例5中的试剂盒进行荧光定量PCR检测，结果只有结核分枝杆菌的DNA提取物检测到荧光信号，实验结果如表5所示，

表5、12种菌株的荧光定量PCR检测结果

结果显示，本发明的试剂盒对非结核分枝杆菌的检测未出现一例假阳性，表明本发明提供的试剂盒中的引物有良好的准确性和特异性。

实施例7本发明试剂盒对临床病人痰样的检测

从医院传染科收集诊断为结核分枝杆菌阳性的患者痰样共35例。

使用痰液DNA提取试剂盒(购自北京百奥莱博科技有限公司)获得基因组DNA，用本发明实施例5提供的试剂盒进行检测，检测得结核分枝杆菌阳性34例，检测阳性率达97％。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州百源基因技术有限公司

<120> 结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒及引物、探针

<130> SHA201700106

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 134

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcaccgaggg tatgcggttc gacaagggct acatctcggg gtacttcgtg accgacccgg 60

agcgtcagga ggcggtcctg gaggacccct acatcctgct ggtcagctcc aaggtgtcca 120

ctgtcaagga tctg 134

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcaccgaggg tatgcgg 17

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cagatccttg acagtgg 17

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcgacaaggg ctacatctc 19

Claims

1.基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的引物，其特征在于，所述引物为根据结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列设计，所述结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列如序列表中SEQ NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的引物，其特征在于，所述引物包括正向引物groEL2-F和反向引物groEL2-R，所述正向引物groEL2-F碱基序列如序列表中SEQ NO.2所示，所述反向引物groEL2-R碱基序列如序列表中SEQ NO.3所示。

3.基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的探针，其特征在于，所述探针为根据结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列设计，所述结核分枝杆菌groEL2基因的保守序列如序列表中SEQ NO.1所示。

4.根据权利要求3所述的基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的探针，其特征在于，所述探针groEL2-P序列如序列表中SEQ NO.4所示，所述探针groEL2-P的5’端连接有荧光物质，3’端连接有淬灭物质。

5.根据权利要求4所述的基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的探针，其特征在于，所述荧光物质为FAM，所述淬灭物质为TAMRA。

6.一种用于对结核分枝杆菌进行荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的引物和/或权利要求3-5任一项所述的基于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的探针。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，包括荧光定量PCR扩增体系混合物：

2×Taqman mix，10μL；

groEL2-F，5μmol，1μL；

groEL2-R，5μmol，1μL；

groEL2-P，5μmol，1μL；

Taq酶，0.3μL；

ddH₂O，5.7μL。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括结核分枝杆菌阳性定量参考品和阴性对照、临界阳性对照以及强阳性对照。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性定量参考品为按照10倍梯度进行稀释的具有groEL2基因保守序列片段的质粒，选取拷贝数为1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml和1.00×10⁴copies/ml的质粒作为所述阳性定量参考品。

10.一种对结核分枝杆菌的检测方法，其特征在于，利用权利要求6-9任一项所述的用于对结核分枝杆菌进行荧光定量PCR检测的试剂盒对待测样品进行荧光定量PCR检测，以提取的待测样品的基因组DNA为模板，按照如下荧光定量PCR扩增程序进行扩增：94℃预变性2分钟，94℃保持15秒，60℃保持40s并收集荧光信号，40个循环。