CN101760518A

CN101760518A - 一种结核分支杆菌活菌rna提取方法及其检测试剂盒

Info

Publication number: CN101760518A
Application number: CN200810201635A
Authority: CN
Inventors: 沈维祥; 吴大治; 夏懿
Original assignee: Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd; Shanghai Huatuo Medical Science Co Ltd
Priority date: 2008-10-23
Filing date: 2008-10-23
Publication date: 2010-06-30

Abstract

本发明涉及一种结核分支杆菌活菌RNA提取方法及其检测试剂盒，具体是，本发明提供结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)活菌RNA提取方法，以及运用该方法结合荧光定量PCR技术获得的结核分支杆菌活菌检测试剂盒；该试剂盒能够准确、灵敏、快速鉴别结核分支杆菌的死活菌，而且能够降低成本及缩短检测时间，更为重要的是还是结核病的诊断、药物敏感性实验、化疗反应监测、新抗结核药物筛选及结核病预防等研究的基础。

Description

一种结核分支杆菌活菌RNA提取方法及其检测试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种用于定量检测结核分支杆菌活菌的荧光定量RT-PCR试剂盒，通过对从临床痰液中提取的结核分支杆菌活菌RNA逆转录成cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以精确定量待测标本中的结核分支杆菌活菌。

背景技术

自1882年Koch发现结核分枝杆菌是结核病的病原菌以来的100余年，人类对结核分枝杆菌的生物学特性、致病机制、耐药机制、诊断方法、抗结核药物的研制等方面都取得了巨大的成就。而如今，结核病仍然是影响人类健康流行性最广，病死率最高的感染性疾病之一。寻求快速、准确的诊断方法一直是结核病学首要研究的领域。

近10年来，随着分子生物学的发展，对结核分支杆菌的DNA研究颇多，它们的高敏感、高特异和快速性给结核病的诊断带来新的期望。但DNA是稳定的核酸分子，但DNA是稳定的核酸分子，半衰期长，在接受标准有效化疗的肺结核患者的痰标本，培养转阴后180天仍有25％的标本DNA检测阳性。可能的解释有死菌及DNA裂解的延滞和L型培养以及持留菌、休眠菌的存在等。可见，以DNA为基础的检测，存在平台效应，不能用于结核分支杆菌的活菌诊断。

rRNA是核糖体内的遗传物质，在原核生物中有多个拷贝存在，结核分支杆菌的rRNA有近5000个拷贝。有学者在观察分支杆菌体内外死亡降解的过程时发现，核糖体是第一个伴随细菌活力消失而降解的超微结构，因而认为rRNA可作为结核分支杆菌的活菌标志。Van der Vliet等通过体外扩增16SrRNA进行分支杆菌活菌检测和药敏试验时发现，该方法能在3～7天内获得药敏试验结果，可计算出各药的药效学参数。但Hellyer等的研究结果显示结核分支杆菌的rRNA水平在含药培养基中72h内无明显变化。Moore等通过临床观察发现，rRNA也显示平台效应。所以，rRNA在用于结核分支杆菌药敏试验和化疗监测时仍存在很大的局限性，也不能用于结核分支杆菌的活菌诊断。

原核生物的mRNA分子，半衰期很短(仅有3～5min)，仅存在于活的、有代谢活性的菌体中，一般认为mRNA是一活性增殖细胞的很好的分子标记物。所以，以mRNA为靶点的检测只能是活菌，是监测药物敏感性和化疗反应的很好的分子指标。结核分支杆菌的85-B mRNA编码结核分支杆菌85-B蛋白，85-B蛋白是结核分支杆菌的主要分泌性蛋白抗原85-B复合物的成分之一，85-B复合物是结核分支杆菌的特异性分泌蛋白，是在液体培养基和巨噬细胞系统中表达最丰富的蛋白之一，所以活菌细胞内存在丰富的85-B mRNA分子。因此，确定以85-B mRNA为靶点可检测结核分支杆菌的活菌。

荧光定量PCR技术的出现，为我们提供了一个定量检测85-B mRNA的准确方法。1966年美国Applied Biosystems公司推出了实量荧光定量PCR技术，该技术融汇了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量结果，不需要PCR后处理或电泳检测，完全闭管操作，一举克服了常规PCR技术的诸多难题。与常规PCR相比，有以下优点：1、可以进行准确的定量检测，可用于适用基因诊断的各种疾病。以HBV-DNA为例，它不仅能检测出乙肝病毒在病人体内的复制、传染的情况，更重要的是能作为一个量化指标，能定量检测出病人体内的病数，可以动态地观察病情病程，观察治疗效果，作为临床治疗的一个指标，可判断药物疗效，指导临床医师选择有效药物，确定药剂、药量和疗程以及分析治疗效果，确定进一步治疗方案等方面，有着重要而现实的意义。2、特异性极强，克服了假阳性的主要来源。3、定量范围宽，样品无需梯度稀释。4、操作迅速，无需PCR后处理，自动化程度高。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中，通常以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是6-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，而将每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数设为Ct值。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的参考品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵横标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时荧光定量PCR扩增过程中加入一对引物的同时也加入一条特异的荧光探针，目前常用的为TaqMan荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR扩增过程中，Taq酶的5’-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每个循环过程结束检测一次荧光强度，反应结束后，便可得一条工作曲线。

由于荧光定量PCR具有重复性好，灵敏度高，定量结果准确可靠的特点，所以医学检测方面，一些常规检测方法所不能解决的问题得到了解决。例如，细胞形态学检查可直接观测到肿瘤细胞，但由于肿瘤脱落至血循环中的数目微小，这种检查的敏感性和特异性均较差，阳性率低。免疫组织化学方法提高了血循环中肿瘤细胞染色的特异性，特别是单克隆抗体的应用使染色的特异性和敏感性有了较大的改善，可查出10⁴-10⁵个有核细胞中的一个肿瘤细胞。但该技术则需要特异性的抗体，生产相对复杂。同时，假阳性限制了此项技术的广泛应用。与这些技术相比，荧光定量PCR技术有着明显的优点，荧光定量PCR简便易行，只要知道待测基因序列，即可设计合成引物进行逆转录及扩增；该方法具有较高的灵敏度及可重复性，也保证了医学检测结果的准确性。

发明内容

所要解决的技术问题

技术方案

本发明提供一种结核分支杆菌活菌检测方法，其特征在于，它具有快速、高质量提取RNA的方法和检测试剂盒。

本发明提供RNA提取方法，其操作步骤包括：

①在痰液标本中加入2倍体积的4％NaOH溶液(自备)，吹打均匀后室温放置30分钟使之液化。取约1ml液化痰液，15,000rpm离心10min，吸弃上清，保留50μl左右沉淀，在沉淀中加入1×TE溶液1ml，旋涡振荡10sec，15,000rpm离心10min，吸弃上清，保留50μl左右沉淀，在沉淀中加入1×TE溶液1ml，旋涡振荡10sec，15,000rpm离心10min，吸弃上清，保留5μl左右沉淀。

②在沉淀中加入0.5ml Trizol试剂，旋涡振荡10sec，室温放置5min。

③加入0.1ml氯仿，振荡混匀充分乳化、不分层，4℃15,000rmp离心10min。吸取上清到另一无RNA酶的1.5ml离子管。

④加入等体积的异丙醇，振荡混匀后室温放置10min，4℃15,000rmp离心10min后小心弃去上清。

⑤加入75％冰乙醇500μl，振荡悬起沉淀后于4℃、15,000rmp离心10min，小心弃去上清。干燥5～10min后使乙醇挥发。

⑥沉淀中加入10μl DNase I处理缓冲液(1μl 10×DNase I Buffer、2U的DNase I(RNase-free)和DEPC水)，室温(37℃)孵育15min后；加入1μl的20mM EDTA(RNase-free)，70℃放置5min，4℃13,000rmp离心1min即可进行RT-PCR，或-70℃保存1周左右。

本发明提供检测试剂盒的特异性引物探针，包括如下序列：

上游引物SEQ ID NO1：5’-CGC GCC CAA GAC GAC TAC A -3’

下游引物SEQ ID NO2：5’-AGG CCG GGC TGTACC AGT-3’

检测探针SEQ ID NO3：5’-MAR-TCG GCG GGC AGT CCA GCT TCT-MAR-3’

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

上述的一组结核分支杆菌(MTB)活菌荧光定量RT-PCR引物和探针的优选技术方案。

本发明提供检测试剂盒组成包括：细胞裂解液、水、含有权利要求3所述引物序列SEQ ID NO1-2的RT-PCR反应液、含有权利要求3所述探针序列SEQID NO3的检测探针、逆转录酶、DNA聚合酶、参考品、阳性对照和阴性对照。

所说的RT-PCR反应液组成为：RT-PCR缓冲液、MgCl₂、特异引物对、dNTPs、无RNA酶的水。

上述检测试剂盒的参考品为如下DNA序列SEQ ID NO4：

5’-CGCGCCCAAG ACGACTACAA CGGCTGGGAT ATCAACACCCCGGCGTTCGA GTGGTACTAC CAGTCGGGAC TGTCGATAGTCATGCCGGTC GGCGGGCAGT CCAGCTTCTA CAGCGACTGGTACAGCCCGG CCT-3’。

作为特例，参考品是含有插入结核分支杆菌(MTB)特异性保守序列的T载体，该载体可在大肠杆菌DH5a中增殖。

上述检测试剂盒所说的水为无RNA酶的水。

一般，无RNA酶的水获得方法为：向去离子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至终浓度为0.01％(V/V)，室温(22-25℃)放置10-12小时后，121℃，20分钟高压，室温放置备用；

上述检测试剂盒所说的阴性对照为无结核分支杆菌(MTB)活菌的正常人痰液样本。

上述检测试剂盒所说的阳性对照为含有结核分支杆菌(MTB)活菌的患者痰液样本。

上述检测试剂盒所说的细胞裂解液由细胞裂解液I和细胞裂解液II组成。

作为特例，细胞裂解液I组成为：320mM蔗糖、5mM MgCl2、1％TritonX-100，10mM Tris-HCl[pH7.5]、水；

作为特例，细胞裂解液II组成为：4M硫氰酸胍、0.75M柠檬酸钠(pH7.0)和10％月桂酰基肌氨酸钠(Sarcosyl 1g/10mL)、14.3M β-巯基乙醇、2M醋酸钠(pH4.0)和水饱和酚；

上述各方案中所说的逆转录酶和DNA聚合酶在试剂盒中的形式可以为混合两种酶的混合液。一般而言，DNA聚合酶选用耐热Taq DNA聚合酶。

上述检测试剂盒各组分的量为：细胞裂解液I 1瓶24mL、细胞裂解液II 1瓶6mL、无RNA酶的水1瓶2mL、RT-PCR反应液1管210μl、检测探针1管30μL、参考品1管10μL、和阴性对照品1管10μL。

本试剂盒中的细胞裂解液(即RNA总提取试剂)应于4℃保存，RT-PCR试剂保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

本发明还提供所说的试剂盒的使用方法如下：

首先，每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。

【样品要求】

1～2ml结核病患者痰液样本。

采集结核病患者痰液1～2ml，倒入15ml刻度离心管(血痰加等量细胞裂解液I混匀静置3～5min)，加入等量1g/dl胰酶Hanks液，置37℃水浴消化，直至痰液被完全消化为止，混匀，分别吸500μl到1.5ml离心管中，再加入4g/dlNaOH处理3～5min离心留沉淀。样本处理后应立即使用，若不能立即使用，可以4℃保存1-2小时，但时间不宜再过长，否则将影响检测结果。

【操作步骤】

一、总RNA提取

1.在处理好的痰液标本(沉淀)中加入500μL细胞裂解液II，用移液器反复吹打混匀，室温放置5分钟。

2.加200μL三氯甲烷，用手来回振荡混匀15秒，室温放置5分钟，4℃15,000rpm离心10分钟，将上清移入新的离心管。

3.加入等体积异丙醇，旋涡振荡5秒，室温沉淀10分钟，4℃15,000rpm离心5分钟，弃上清。

4.加入500μL预冷的75％乙醇洗涤，上下颠倒10次，4℃10,000rpm离心5分钟，吸干上清，沉淀室温干燥10-20分钟，加入20μL无RNA酶水稀释混匀，立即使用或-70℃保存。

二、RT-PCR

将装有RT-PCR反应液、MTB检测探针、混合酶、参考品、对照品的离心管从-20℃中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，低速离心，用移液器将上述试剂RT-PCR反应液，混匀，低速离心，置于冰盒上备有。

按下列组成配制RT-PCR反应体系(30μL体系)：

RT-PCR反应条件：37℃30分钟；95℃5分钟；(95℃10秒，60℃45秒，40个循环)。

三、标准曲线的制作

将参考品贮存液(6×10⁷copies/μL)梯度稀释为6×10⁶，6×10⁵，6×10⁴，6×10³，6×10²，6×10¹，取4μL为模板，同待测样品一同进行RT-PCR扩增，制作标准定量曲线。

【结果判断】

1.使用实时荧光定量PCR仪的随机软件进行文件保存及阈值的设定。

2.选中不同浓度参考品，应用相应软件进行分析，得出标准曲线及相关信息。

3.选中所有样品检测测孔，应用相应软件进行分析，得出待测样品的起始模板数(M)。

有益效果

本发明建立了利用TaqMan技术检测结核分支杆菌活菌的方法，并且经过对结核病患者痰液标本进行检测，表明该法切实可行。由于本方法采用了荧光定量PCR，使得结核分支杆菌活菌的检测敏感性和特异性大大的提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，从而使得本发明可以在极少量的标本中获得足够的信息。

在本检测项目中，本发明采用了目前最为先进的实时荧光定量PCR检测技术，在保持高敏感性的前提下，尽量减少假阳性的干扰。在实量荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的高度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测出起始模板的量，但这些方法实际上都有属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果的分析带来影响，从而影响定量这一目的。随着本发明实时荧光定量PCR技术的应用，可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高敏灵性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被子检测基因的特异性大大提高。

本发明的引物、探针和试剂盒采用荧光定量RT-PCR方法，该方法灵敏、特异、重复性好，结果用拷贝数表示，准确可靠，利于统一标准。方法灵敏，重组质粒定量模板，按10倍梯度稀释，可检出10个拷贝，并由此制出标准曲线，线性范围宽(0～10⁷拷贝)，方法的稳定性、重复性、相关性好，相关系数为0.997。荧光定量RT-PCR方法是结核分支杆活菌的诊断、药物敏感性实验、化疗反应监测、新抗结核药物筛选及结核病预防等研究基础。结核分支杆菌的药物敏感性试验，特别是化疗疗效的评价对活菌的存在有严格的依赖性。因此，结核分支杆菌活菌的检测具有临床意义及广泛的应用价值。

附图说明

图1为样本标准检测图。

图2为样品标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，Trizol试剂购自上海生工公司，限制性内切酶购自上海申能博彩生物公司，MMLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Oligo(dT_)15-18均购自美国Promega公司，引物和探针均由上海生工公司合成。Eppendorf梯度式PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司，PE7500荧光PCR仪为ABI公司产品。

实施例1

实时荧光定量RT-PCR法检测结核分支杆菌活及其应用

一、引物及探针设计与合成：

以结核分支杆菌全长cDNA序列(GenBank登录号NC_000962)为模板，使用Oligo软件分析TaqMan引物和探针的位点，并根据同时考虑结核分支杆菌基因组DNA序列的情况，从中选择最佳组合。

参考品PCR上游引物序列为：5’-CTG CGG TTT ATC TGC TCG AC-3’；下游引物序列为：5’-GAC AGC GAG CCG GCG TAG A-3’；

检测用PCR上游引物序列为：5’-CGC GCC CAA GAC GAC TAC A-3’；下游引物序列为：5’-AGG CCG GGC TGT ACC AGT-3’；

荧光探针序列为：5’-MAR-TCG GCG GGC AGT CCA GCT TCT-MAR-3’；

二、检测参考品制备：

采集结核病患者痰液1～2ml，倒入15ml刻度离心管(血痰加等量细胞裂解液I混匀静置3～5min)，加入等量1g/dl胰酶Hanks液，置37℃水浴消化，直至痰液被完全消化为止，混匀，分别吸500μl到1.5ml离心管中，再加入4g/dlNaOH处理3～5min离心留沉淀。采用TRIzol试剂提取总RNA，取1μgRNA，在25μL总反应体系中用Oligo(dT_)15-18为引物对其进行逆转录后，用参考品上、下游引物在Eppendorf梯度式PCR扩增仪上进行PCR扩增，反应条件为95℃变性5分钟，再按95℃20秒、56℃20秒、72℃45秒进行35个循环扩增，最后于72℃延伸7分钟后置于4℃。

PCR扩增产物经电泳检测后送上海超世生物公司进行克隆(质粒由应公司提供)，并将阳性克隆经测序验证(由上海英骏公司测序)。提取阳性克隆质粒，即为参考品，测定其浓度并换算成(拷贝数/体积)。

三、标本检测：

取5例经确定的结核病患者和2例正常人痰液标本1.5ml，加入等量1g/dl胰酶Hanks液，置37℃水浴消化，直至痰液被完全消化为止，混匀，分别吸500μl到1.5ml离心管中，再加入4g/dlNaOH处理3～5min离心留沉淀，用TRIzol试剂提取总RNA，取4μL RNA提取液，在30μL总反应体系中，用检测用上、下游引物在PE7500荧光PCR仪上进行PCR扩增，反应条件均为37℃保温30分钟，95℃变性5分钟，再按95℃10秒、60℃45秒进行40个循环扩增，同时加入参考品检测作标准曲线，测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测标本的拷贝数。

五、结果：

(一)参考品的制备

经测序，上述设计的参考品完全与预期相符，回收的参考品片段序列如下：

5’-CTGCGGTTTA TCTGCTCGAC GGCCTGCGCG CCCAAGACGACTACAACGGC TGGGATATCA ACACCCCGGC GTTCGAGTGGTACTACCAGT CGGGACTGTC GATAGTCATG CCGGTCGGCGGGCAGTCCAG CTTCTACAGC GACTGGTACA GCCCGGCCTGCGGTAAGGCT GGCTGCCAGA CTTACAAGTG GGAAACCTTCCTGACCAGCG AGCTGCCGCA ATGGTTGTCC GCCAACAGGGCCGTGAAGCC CACCGGCAGC GCTGCAATCG GCTTGTCGATGGCCGGCTCG TCGGCAATGA TCTTGGCCGC CTACCACCCCCAGCAGTTCA TCTACGCCGG CTCGCTGTCG-3’

(二)样品检测

参考品检测结果见图1，标准曲线见图2。

5例患者(其中一例已治愈)和5例正常人痰液标本荧光定量RT-PCR检测结果如下：

编号性别年龄标本拷贝数

(copies/mL)

1 男 64 痰液 2.11×10²

2 女 40 痰液 5.18×10⁵

3 女 33 痰液 1.90×10³

4 男 56 痰液 5.44×10²

5 女 49 痰液 -

6 男 52 痰液 -

7 男 46 痰液 -

8 女 29 痰液 -

9 女 58 痰液 -

10 男 66 痰液 -

同样的10例样本，采用以DNA为检测模板的试剂盒进行检测。

实验方案如下：

试剂盒采用上海复星医学科技发展有限公司的结核分支杆菌(TB)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒(检测方法详见使用说明书)。

5例患者(其中一例已治愈)和5例正常人外周血标本原位RT-PCR检测结果如下：

编号性别年龄标本拷贝数

(copies/mL)

1 男 64 痰液 4.38×10⁴

2 女 40 痰液 7.417×10⁶

3 女 33 痰液 3.88×10⁴

4 男 56 痰液 3.75×10⁴

5 女 49 痰液 6.620×10³

6 男 52 痰液 -

7 男 46 痰液 -

8 女 29 痰液 -

9 女 58 痰液 -

10 男 66 痰液 -

可见，结核分支杆菌荧光检测试剂盒检测结果拷贝数高于以mRNA为模板的结核分支杆菌活菌荧光定量RT-PCR检测试剂盒，但其中一例已治愈患者仍然被检测出为阳性，说明可能有死菌及DNA裂解的延滞和L型培养以及持留菌、休眠菌的存在等，因此不能为结核分支杆活菌的诊断、药物敏感性实验、化疗反应监测、新抗结核药物筛选及结核病预防等提供基础性研究。

核苷酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110>上海复星医药(集团)股份有限公司

上海复星医学科技发展有限公司

<120>一种结核分支杆菌活菌RNA提取方法及其检测试剂盒

<130>081010

<140>CN

<141>2008-10-10

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221>SEQ ID NO1

<222>(1)..(19)

<400>1

cgcgcccaag acgactaca 19

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221>SEQ ID NO2

<222>(1)..(18)

<400>2

aggccgggct gtaccagt 18

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221>SEQ ID NO3

<222>(1)..(21)

<223>“n＝MAR”，“y＝MAR”

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<400>3

ntcggcgggc agtccagctt cty 23

<210>4

<211>133

<212>DNA

<213>Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221>SEQ ID NO4

<222>(1)..(133)

<400>4

cgcgcccaag acgactacaa cggctgggat atcaacaccc cggcgttcga gtggtactac 60

cagtcgggac tgtcgatagt catgccggtc ggcgggcagt ccagcttcta cagcgactgg 120

tacagcccgg cct 133

Claims

1.一种结核分支杆菌活菌检测方法，其特征在于，它具有快速、高质量提取RNA的方法和检测试剂盒。

2.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其操作步骤包括：

①在痰液标本中加入2倍体积的4％NaOH溶液(自备)，吹打均匀后室温放置30分钟使之液化。取约1ml液化痰液，15,000rpm离心10min，吸弃上清，保留50μl左右沉淀，在沉淀中加入1×TE溶液1ml，旋涡振荡10sec，15，000rpm离心10min，吸弃上清，保留50μl左右沉淀，在沉淀中加入1×TE溶液1ml，旋涡振荡10sec，15,000rpm离心10min，吸弃上清，保留5μl左右沉淀。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，它具有特异性引物和探针，包括如下序列：

上游引物SEQ ID NO1：5’-CGC GCC CAA GAC GAC TAC A -3’

下游引物SEQ ID NO2：5’-AGG CCG GGC TGT ACC AGT-3’

检测探针SEQ ID NO3：5’-MAR-TCG GCG GGC AGT CCA GCTTCT-MAR-3’

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，其组成包括：细胞裂解液、水、含有权利要求3所述引物序列SEQ ID NO1-2的RT-PCR反应液、含有权利要求3所述探针序列SEQ ID NO3的检测探针、逆转录酶、DNA聚合酶、参考品、阳性对照和阴性对照。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒的组成，其特征在于，所说的参考品为如下DNA序列SEQ ID NO4：

6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所说的水为无RNA酶的水。

7.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所说的阴性对照为无结核分支杆菌活菌的正常人痰液样本。

8.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所说的阳性对照为含有结核分支杆菌活菌的患者痰液样本。

9.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所说的细胞裂解液由细胞裂解液I和细胞裂解液II组成。

10.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，每盒中各组分的量为：细胞裂解液I 1瓶24mL、细胞裂解液II 1瓶6mL、无RNA酶的水1瓶2mL、RT-PCR反应液1管210μL、检测探针1管30μL、参考品1管10μL、和阴性对照品1管10μL。