CN104694623A - 一种用于肺癌诊断的血浆miRNA标志物及应用 - Google Patents

一种用于肺癌诊断的血浆miRNA标志物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于肺癌诊断的血浆miRNA标志物及应用。本发明提供了用于肺癌诊断的血浆miRNA标志物，包括miRNA-486、miRNA-150、miRNA-205和miRNA-210；本发明还提供了序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物探针及其在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。本发明的有益效果在于发现了对肺癌具有较高诊断价值的生物标记物，对肺癌具有较高诊断价值(AUC为0.975，敏感度和特异度分别为90.9％和100％)。

Description

一种用于肺癌诊断的血浆miRNA标志物及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于肺癌诊断的血浆miRNA标志物及应用。
背景技术
肺癌目前是全球范围内最常见、致死人数最多的恶性肿瘤之一，也是我国第一大癌症，其发病率及死亡率增长最为迅速。由于肺癌起病隐匿，其诊治情况远不令人满意，咎其原因主要在于缺乏早期诊断的手段和有效治疗方法。患者出现症状时多为晚期，预后较差，总的五年生存率不超过15％，有症状者≤10％。但早期确诊的肺癌患者，手术治疗的预后较中晚期肺癌明显改善，其生存率可达70％。由此可见，要降低肺癌病人的死亡率除了在病因预防上降低发病率外，提高早期诊断水平和药物治疗的疗效是两个重要方面。然而，肺癌的早期诊断一直是一个世界性难题，目前影像诊断(X线、CT和MRI)，化学诊断(癌反应，血清学和免疫学指标)及组织细胞学诊断是肿瘤诊断的三大支柱，前者在亚临床期诊断上有很大局限性，后二者均以肿瘤标志物作为观察指标，可以比影像诊断更早发现肿瘤的存在，具有高效、高灵敏性、方便、标本易获取及创伤小等优点，因此，在肺癌早期诊治研究中，筛选及鉴定高特异性的肺癌肿瘤标志物一直是研究的重点和难点。
所谓肿瘤标志物，是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞生物合成、释放或者是肿瘤与宿主相互作用而产生的一类物质，反映着肿瘤的存在和生长。我们可通过利用化学、免疫、分子生物学等技术对血液或分泌物进行定性或者定量的检测，通过对其分析，帮助我们从正常组织中区别肿瘤或者测定肿瘤细胞核、细胞质以及对细胞膜上的特性进行分析，以此作为辨别肿瘤细胞的标志。肺癌的发生与发展具有十分复杂的机制，其发病的最初阶段涉及到许多肺癌相关基因及其表达的改变，在致癌因素的作用下患者体内可表达多种粘附分子及其受体或配体，在肿瘤发展的不同时期其释放标志物含量也不一样，从外周血和痰液中检测肺癌特异性分子标志物的变化，具有简便、快捷、痛苦小、易复查等优点，容易为病人接受，对肺癌的临床诊治具有重要意义。
由于肺癌组织病理的多样性、同种病理肿瘤细胞的异质性和肿瘤生物学行为的复杂性及多态性，造成单一标志物检测对肺癌的诊断价值有限，只能反映了疾病某些侧面的变化，国内外众多学者倾向于筛选多种有价值的肿瘤标志物进行联合检测，以提高肺癌诊断的阳性率。虽然联合检测优于单项检测已成共识，但并非任意一种组合均能提高临床诊断的阳性率，在最佳组合上结论颇不一致，甚至出现相反的结果。因此，寻找一种高灵敏度、高特异性、可实际应用于肺癌临床诊治的生物标志物已成为肺癌研究中亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种用于肺癌诊断的血浆miRNA标志物。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于肺癌诊断的血浆miRNA标志物，所述标记物包括miRNA-486、miRNA-150、miRNA-205和miRNA-210。
在本发明的第二方面，提供了上述血浆miRNA标志物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。
在本发明的第三方面，提供了一种肺癌诊断试剂盒，其能够测定血浆中的miRNA-486、miRNA-150、miRNA-205和miRNA-210的含量。
在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有miRNA-486、miRNA-150、miRNA-205和miRNA-210的引物探针。
在本发明的一个优选例中，上述引物探针的序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
在本发明的第四方面，提供了核苷序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的一种或多种组合物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。
在本发明的一个优选例中，提供了序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物探针的用途，其用于制备肺癌诊断试剂盒。
所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2和DEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品。
本发明的有益效果在于：首次发现了对肺癌具有较高诊断价值的生物标记物miR-486、miR-150、miR-205和miR-210四种miRNA；通过血浆miRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可以使得肺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1为健康组与肺癌组血浆miRNA表达水平比较。
图2为健康组与肺癌组血浆miRNA表达水平ROC曲线。
具体实施方式
一、研究对象
病例组为2012年11月至2014年3月在常州市第二人民医院收集的11例病例，均经病理组织学确诊，采血前未经过手术和放化疗。对照组为同期进行社区疾病筛查的健康个体11例，按性别和年龄(±5岁)与病例进行频数匹配。用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一，通过对样品资料的整理。
二、研究方法
(1)使用EDTA抗凝管采肘静脉血5ml，采血后轻轻摇动抗凝管使抗凝剂与血液混匀，所有血样在采血后2小时内进行RNA提取。先将Ficoll-Paque PLUS液室温(15-20℃)放置，所有离心过程也应在室温完成。取2mlEDTA抗凝血与等体积平衡液在15ml离心管中用移液管(或移液器)充分混匀(总体积4ml)。用针管抽取3mlFicollPaque PLUS溶液到新的15ml离心管中，轻轻用移液管(或移液器)沿管壁缓慢滴加准备好的样品(4ml)于分层液面上，注意保持清楚的液面。室温(18-20℃)以400×g离心30-40分钟。用新移液管(或移液器)吸取最上层的血浆与血小板。将血浆置于冻存管中，-80℃保存备用。由实验员每天定时记录冰箱温度。
(2)按照血液总RNA快速提取试剂盒(miRNeasy血浆提取试剂盒，货号NO.217184,德国Qiagen公司)说明书从血浆中提取总RNA。为了避免由于抽提步骤导致RNA含量的误差，加入线虫合成miR-39(血浆外参试剂盒，货号NO.219610,德国Qiagen公司)作为外参进行正太化校正。
(3)按照miRNA逆转录试剂盒(TaqMan microRNA反转录试剂盒，货号NO.1302146R，美国ABI公司)说明书进行逆转录反应。反应总体积为15ul(总RNA5ul，TaqMan MicroRNA Assay 3ul,核酸酶自由水4.16ul，RNase抑制剂0.19ul，缓冲液1.5ul，Multiscribe逆转录酶1.00ul和dNTP0.15ul)，在不同温度下(16℃，42℃，85℃，4℃)进行不同时长(30mins，30mins，5mins，10mins)反应。
(4)实时荧光定量PCR按照TaqMan试剂盒(TaqMan通用混合试剂盒II，货号NO.121207，美国ABI公司)说明书进行。PCR扩增体系总体积为10ul，反应共40个循环。PCR反应Ct值通过7900实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)测定，每个反应重复三次。
三、研究结果
病例组血浆miR-486、miR-150、miR-210表达水平较对照组显著上调；而miR-205表达水平较对照组显著下降。具体数据如表1和图1所示：
表1：对照组与病例组血浆miRNA水平比较(ΔCT)(X±S)
表2：miRNA引物探针信息及目标序列
ROC曲线分析显示，miR-486,miR-150,miR-205,miR-2104种miRNA作为生物标记物对肺癌具有较高诊断价值(AUC为0.975，敏感度和特异度分别为90.9％和100％)，详细分析结果见表3。
表3:ROC分析结果
a.在非参数假设下
b.零假设：实面积＝0.5
分析方法说明：使用SPSS 19.0软件包进行数据分析，对于两组之间的比较，首先进行方差齐性检测，对于方差齐性的两组数据，采用Student’s t-test进行比较分析；对于方差不齐的两组数据，采用Welch校正分析。P<0.05被认为差异具有统计学意义。将具有统计学差异的数据进行二元logistic回归，得出预测概率值，并将预测概率值用于后续ROC曲线分析。ROC曲线分析用于评价miRNA在肺癌早期诊断中的价值，曲线下面积(AUC)越接近1，则说明该指标作为肺癌早期诊断的价值越高。
用于肺癌诊断的试剂盒包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQIDNO.3和SEQ ID NO.4所示的引物探针，可由Life Technologies公司购得；还可以有可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2和DEPC水等，这些都是本领域技术人员熟知的；另外还可以含有标准品和/或对照品。
本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
序列表
 

Claims (6)

1.一种用于肺癌诊断的血浆miRNA标志物，其特征在于所述标记物包括miRNA-486、miRNA-150、miRNA-205和miRNA-210。
2.一种如权利要求1所述的用于肺癌诊断的血浆miRNA标志物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。
3.一种肺癌诊断试剂盒，其特征在于能够测定血浆中的miRNA-486、miRNA-150、miRNA-205和miRNA-210的含量。
4.如权利要求3所述的肺癌诊断试剂盒，其特征在于含有miRNA-486、miRNA-150、miRNA-205和miRNA-210的引物探针。
5.一种如权利要求4所述的肺癌诊断试剂盒，其特征在于引物探针的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。
6.核苷序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQID NO.4中的一种或多种组合物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。
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