CN106148506A - 一种b族链球菌荧光定量pcr产前检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种B族链球菌荧光定量PCR产前检测引物、探针、试剂盒及其应用。所述引物及对应探针包括用于扩增检测B族链球菌的sip上下游引物、sip Taqman 探针和用于扩增检测人 β-actin的人 β-actin上下游引物、人β-actin Taqman 探针。采用本发明的检测引物、探针及试剂盒，能够对更低量的DNA样本进行准确的检测，正确率为100%。

Description

一种B族链球菌荧光定量PCR产前检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种B族链球菌荧光定量PCR产前检测引物、探针、试剂盒及其应用。

背景技术

1938年Fry首次报告3例感染B族链球菌(Group B streptococci,GBS)引起产后心内膜炎的死亡，证实B族链球菌为人类的致病菌。经过几十年的研究，发现B族链球菌可引起新生儿败血症、肺炎、脑膜炎，甚至死亡。在感染后存活的新生儿，还有可能有严重的神经系统后遗症，包括脑积水、智力障碍、小头畸形、耳聋等。同时，B族链球菌还可引起孕妇感染、引起早产、胎儿发育不良(低体重儿)、胎膜早破及晚期流产。

GBS，正常寄居于阴道和直肠，它是一种条件致病菌，一般正常健康人群感染GBS并不致病。

据统计约10％～30％的孕妇有感染GBS，其中40％～70％在分娩过程中会传递给新生儿。如果新生儿带了这种菌，大约有1％～3％会出现早期侵入性感染，其中有5％会导致死亡。

孕妇感染表现为菌血症、泌尿系统感染、胎膜感染、子宫内膜感染以及创伤感染。

有报道显示，在2745例产妇中，尿中有感染GBS的胎膜早破发生率为35％。据研究报道GBS阳性的孕妇中有21％发生绒毛膜羊膜炎和产后子宫内膜炎，分析表明GBS阳性是引起绒毛膜羊膜炎的重要危险因素。

研究表明，GBS阳性孕妇早产合并低出生体重儿、极低体重儿的可能性增加20％-60％。

新生儿感染GBS能够导致败血症，肺炎和脑膜炎，发病率和死亡率较高，也可能遗留长期病理状态如耳聋、视力受损、发育障碍以及脑瘫等。

依据美国新哈芬地区10年调查统计结果，其新生儿败血症年发生率为千分之二点七。其新生儿败血症有一半左右都是因B族链球菌感染引起的。

基于GBS感染引起孕妇和新生儿相关症状、疾病的严峻性，产前筛查GBS显得尤为重要。

常规细菌分离鉴定方法(祝璟琳等,2010)检测周期长,达不到对感染样本快速诊断的要求；靶向于菌体基因组的核酸杂交技术(Rosa et al,1995；Yancey et al,1993),受操作复杂和成本昂贵等因素的制约,也很难用于对疑似感染样本的诊断；靶向于某些编码基因的PCR诊断方法(Mawn et al,1993；Ahmet et al,1999),也仅局限于对某些特定类型菌株的检测,而对其他血清型菌株或溶血型菌株的检测则极易产生假阴性结果。无乳链球菌也极易与其它链球菌属成员菌产生诊断混淆。因此,建立一种快速、准确地检测无乳链球菌,且具有良好特异性和敏感性的检测方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种B族链球菌荧光定量PCR检测引物、探针、试剂盒及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面提供了一种B族链球菌荧光定量PCR检测引物及对应探针，所述引物及对应探针包括用于扩增检测B族链球菌的sip上下游引物、sip Taqman探针和用于扩增检测人β-actin的人β-actin上下游引物、人β-actin Taqman探针，sip上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：5’-ttgacatcgacaatggcagc-3’；sip下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：5’-taacacttgccactctaggg-3’；sip Taqman探针的核苷酸序列如：SEQ ID NO：3所示，具体为：5’--aacagatacgacgtggacag-3’；人β-actin上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体为5’-atcagcaagcaggagtatgacg-3’；人β-actin下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，具体为:5’-tgtgcaatcaaagtcctcgg-3’；人β-actin Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，具体为：5’--acctaacttgcgcagaaaac-3’。

本发明探针的合成为现有技术，探针一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光淬灭基团。

优选的，所述sip Taqman探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。更优选的，所述sip Taqman探针5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。

优选的，所述人β-actin Taqman探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。更优选的，人β-actin Taqman探针5’端标记的荧光报告基团为HEX荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。

本发明的第二方面提供了前述B族链球菌荧光定量PCR检测引物、探针在制备B族链球菌检测试剂中的用途。

本发明的第三方面提供了一种B族链球菌荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液中含有前述引物和探针。

本发明的试剂盒采用高灵敏性的荧光定量PCR技术来进行B族链球菌检测。不同血清型的S.agalactiae基因组中sip基因高度保守,于是选择sip基因(登录号为DQ650634)为模板分别进行引物设计。采用所述引物进行荧光PCR,进行扩增，根据扩增情况可分析来判断B族链球菌感染情况。因此，引物组的设计是本发明试剂盒的关键。

基于试剂盒采用的是荧光PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

所述PCR扩增反应液中，引物、Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl₂、dNTPs均为常见组分，其含量亦为常规。

较优的，所述PCR扩增反应液的组成中，sip上游引物的终浓度为0.2pmol/μL，sip下游引物的终浓度为0.2pmol/μL，sip Taqman探针的终浓度为0.4pmol/μL。

较优的，所述PCR扩增反应液的组成中，人β-actin上游引物的终浓度为0.2pmol/μL，人β-actin下游引物的终浓度为0.2pmol/μL，人β-actin Taqman探针的终浓度为0.4pmol/μL。

更优的，所述PCR扩增反应液的组成及浓度为：每13.2ulPCR扩增反应液中含go TaqProbe qPCR Master 10μL，sip上游引物的终浓度为0.2pmol/μL，sip下游引物的终浓度为0.2pmol/μL，sip Taqman探针的终浓度为0.4pmol/μL，人β-actin上游引物的终浓度为0.2pmol/μL，人β-actin下游引物的终浓度为0.2pmol/μL，人β-actin Taqman探针的终浓度为0.4pmol/μL。

PCR扩增反应液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR扩增反应液加入引物及探针配置获得。

所述试剂盒中还含有阳性对照。阳性对照含有B族链球菌保守序列，可为含有B族链球菌保守序列的质粒。所述的阳性对照也可以为灭活的B族链球菌培养液。还可采用现有B族链球菌检测试剂盒中的阳性对照，也可单独市购或根据现有技术自行构建。

所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为各种不含有B族链球菌的溶液，如PCR缓冲液、无菌水(DEPC-H₂O)、生理盐水等。

本发明第三方面公开了前述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)提取样本DNA，即制备DNA模板；

2)加样：将样本DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR扩增反应液的PCR管中，获得对应的样本反应管、阳性反应管或阴性反应管；

3)PCR扩增：反应管置于定量荧光PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增；

4)PCR反应结束后，检测PCR反应体系的荧光信号值，荧光通道选用FAM、HEX。

步骤1)中，样本DNA的提取为现有技术。较优的，提取DNA样本，即制备DNA模板，包括以下步骤：(1)将试子样本放入100ul 5％chelex-100溶液中，在振荡器上反复振荡，放入56℃保温30分钟；(2)取出后振荡，100℃保温8分钟，振荡后，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增，或放4℃保存备用。

步骤2)中，各反应管中的反应体系为20ul，其中，样本反应管中含样本DNA2ul，PCR扩增反应液13.2ul，灭菌水4.8ul。

步骤3)中，PCR扩增的程序为：预变性95度5分钟；变性95度10秒；退火55度20秒；延伸72度45秒(采集荧光)；从第二步开始39个循环。

试剂盒质量控制：试剂盒各对照品须达到以下表1中的要求，否则实验视为无效。

表1 试剂盒质量标准

样本DNA提取结果的判断标准如表2所示：

表2 检测结果判断标准

本发明的有益效果为：

本发明采用的引物组和Taqman荧光探针，能特异性扩增B族链球菌sip基因和人类β-actin基因；采用不同荧光标记，能同时进行复合扩增。若没有任何DNA的存在，则就检测不到任何荧光；若只有人类β-actin基因扩增，则为B族链球菌阴性；若有两种荧光(绿色，蓝色)同时出现，才是B族链球菌阳性。我们的阴性结果，必须有人β-actin基因扩增(绿色)，因而，本发明方法的结果更可靠，准确率为100％。

附图说明

图1：只有人β-actin基因扩增而没有B族链球菌sip基因扩增的样品，为阴性(即没有B族链球菌感染)；

图2：人β-actin基因和B族链球菌sip基因二个同时能扩增的样品，为阳性(即有B族链球菌感染)。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 B族链球菌荧光定量PCR检测引物、探针的合成

在sip Taqman探针的5’标记FAM荧光基团，人β-actin Taqman探针的5’标记HEX荧光基团。合成B族链球菌荧光定量PCR检测引物、探针。

sip上游引物：5’-ttgacatcgacaatggcagc-3’(SEQ ID NO：1)

sip下游引物：5’-taacacttgccactctaggg-3’(SEQ ID NO：2)

sip Taqman探针：5’-FAM--aacagatacgacgtggacag-BHQ1-3’(SEQ ID NO：3)

人β-actin上游引物：5’-atcagcaagcaggagtatgacg-3’(SEQ ID NO：4)

人β-actin下游引物：5’-tgtgcaatcaaagtcctcgg-BHQ1-3’(SEQ ID NO：5)

人β-actin Taqman探针：5’-HEX-acctaacttgcgcagaaaac-BHQ1-3’(SEQ ID NO：6)

实施例2 B族链球菌的检测

1)提取样本DNA，即制备DNA模板，包括以下步骤：(1)将试子样本放入100ul5％chelex-100溶液中，在振荡器上反复振荡，放入56℃保温30分钟；(2)取出后振荡，100℃保温8分钟，振荡后，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增，或放4℃保存备用。

2)配置PCR扩增反应液：每13.2ulPCR扩增反应液中含go Taq Probe qPCR Maeter10μL，sip上游引物的终浓度为0.2pmol/μL，sip下游引物的终浓度为0.2pmol/μL，sip Taqman探针的终浓度为0.4pmol/μL，人β-actin上游引物的终浓度为0.2pmol/μL，人β-actin下游引物的终浓度为0.2pmol/μL，人β-actin Taqman探针的终浓度为0.4pmol/μL。

3)加样：将样本DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR扩增反应液的PCR管中，获得对应的样本反应管、阳性反应管或阴性反应管；各反应管中的反应体系为20ul，其中，样本反应管中含样本DNA2ul，PCR扩增反应液13.2ul，灭菌水4.8ul；

4)PCR扩增：反应管置于定量荧光PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增；PCR扩增的程序为：预变性95度5分钟；变性95度10秒；退火55度20秒；延伸72度45秒(采集荧光)；从第二步开始39个循环；

5)PCR反应结束后，检测PCR反应体系的荧光信号值，荧光通道选用FAM、HEX。

结果判定：如图所示1和2所示，其中：

1.如图1所示，只有人β-actin基因扩增而没有B族链球菌sip基因扩增的样品，为阴性(即没有B族链球菌感染)；

3.如图2所示，人β-actin基因和B族链球菌sip基因二个同时能扩增的样品，为阳性(即有B族链球菌感染)。

实施例3 特异性和准确性评价

本发明针对B族链球菌的sip基因，采用Taqman探针扩增。Sip基因是B族链球菌特有基因，可以避免与其他细菌的干扰，加上Taqman探针，就可以非常特异地扩增B族链球菌的sip基因。

为评价本发明方法的准确性，对采集的14例未感染B族链球菌的阴性样品，采用本发明的方法进行检测，结果如表1所示：

表1

根据本发明方法，只有人β-actin基因扩增的样品，为阴性样品，表1中的检测结果显示，样品A-N均为阴性样品，与实际结果吻合，正确率为100％。

为进一步评价本发明方法的准确性，采用本发明的方法和临床采用的荧光PCR检测方法一起对临床标本进行检测。所述临床采用的荧光PCR检测方法采用的试剂盒为TIB的B族链球菌核酸检测试剂盒。本次对比试验采用的临床标本包括1个采集未感染B族链球菌的阴性样品(9号)和16个采集的确认感染B族链球菌的阳性样品。

表2

根据本发明方法，只有人β-actin基因和sip基因能够同时扩增的样品，为阳性样品，表2中的检测结果显示，样品1-8及10-17均为阳性样品，9号样品为阴性样品，与实际结果吻合，正确率为100％。而临床上所用的荧光PCR方法却将9号样品判读成了假阳性。从上述表2结果还可以看出，本发明方法采用的样本DNA量要低于对比方法所采用的样本DNA量(ct值越小，DNA量越多)，说明本发明的方法能够对更低量的DNA样本进行正确地检测。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种B族链球菌荧光定量PCR检测引物及对应探针，其特征在于，所述引物及对应探针包括用于扩增检测B族链球菌的sip上下游引物、sip Taqman探针和用于扩增检测人β-actin的人β-actin上下游引物、人β-actin Taqman探针，sip上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；sip下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；sip Taqman探针的核苷酸序列如：SEQ ID NO：3所示；人β-actin上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示；人β-actin下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；人β-actin Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.根据权利要求1所述的引物及对应探针，其特征在于，所述sip Taqman探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；所述人β-actin Taqman探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的引物及对应探针，其特征在于，所述sip Taqman探针5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；人β-actin Taqman探针5’端标记的荧光报告基团为HEX荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。

4.如权利要求1～3任一权利要求所述的B族链球菌荧光定量PCR检测引物、探针在制备B族链球菌检测试剂中的用途。

5.一种B族链球菌荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液中含有如权利要求1～3任一权利要求所述的B族链球菌荧光定量PCR检测引物、探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应液的组成中，sip上游引物的终浓度为0.2pmol/μL，sip下游引物的终浓度为0.2pmol/μL，sip Taqman探针的终浓度为0.4pmol/μL；人β-actin上游引物的终浓度为0.2pmol/μL，人β-actin下游引物的终浓度为0.2pmol/μL，人β-actin Taqman探针的终浓度为0.4pmol/μL。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阳性对照，所述阳性对照为含有B族链球菌保守序列的质粒或灭活的B族链球菌培养液。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阴性对照，所述阴性对照为不含有B族链球菌的溶液、无菌水或生理盐水。

9.如权利要求5～8任一权利要求所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取样本DNA，即制备DNA模板；

2)加样：将样本DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR扩增反应液的PCR管中，获得对应的样本反应管、阳性反应管或阴性反应管；

3)PCR扩增：反应管置于定量荧光PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增；

4)PCR反应结束后，检测PCR反应体系的荧光信号值，荧光通道选用FAM、HEX。