CN110904194A - 一种肺炎支原体和肺炎衣原体核酸联合检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种肺炎支原体和肺炎衣原体核酸联合检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明肺炎支原体和肺炎衣原体核酸联合检测试剂盒及其应用。将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物加入到包被有包被探针的微孔中，同时加入特异探针及放大探针，其中包被探针可与特异探针CES的一端结合固定扩增产物RNA；特异探针LES的一端结合到RNA产物上，另一端与放大探针结合，实现信号放大。标记有多生物素的放大探针随后与链霉亲和素‑HRP酶联物结合，最后加入HRP酶化学发光底物，在化学发光仪上进行检测。本发明无需RNA提取，在检测中不易污染，灵敏度高、特异性强，可广泛用于肺炎支原体和肺炎衣原体核酸联合检测核酸检测。

Description

一种肺炎支原体和肺炎衣原体核酸联合检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于双扩增(RNA恒温扩增+多生物素信号放大)技术联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体核酸的试剂盒及其应用。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasmal pneumonia，MP)是社区获得性肺炎(CAP)的主要病原体，近年来，其感染呈上升趋势。肺炎支原体是一种可以通过无菌滤器、但无法在标准细菌培养基中进行体外培养、介于病毒和细菌之间的无细胞壁型微生物。MP可以引起上呼吸道和下呼吸道感染，是引起非典型性肺炎的重要病原体之一。MP由于体积极小，其通常通过飞沫传播，疾病流行因季节、性别、年龄、地区的不同而不同，但其感染在全球呈上升趋势。MP所引起的肺炎支原体肺炎(myeoplasmapneumoniaepneumonia，MPP)占所有社区获得性肺炎的比例高达40％，且容易在儿童中引起暴发流行。研究表明，MP不仅可以引起发热、咳嗽等急、慢性呼吸道感染症状，部分患者可因感染肺炎支原体而患哮喘，此外，其亦可引起中枢神经系统、关节等一系列肺外系统疾病，严重的可导致死亡。MP可引起儿童或成人上呼吸道和下呼吸道感染。在国内，大量病例见于初级医疗保健机构，而有关MP感染流行病学的报道又极少基于社区人群，因此文献中关于MP感染发病率差异颇大(9.6％-66.7％)。
肺炎衣原体(Cpn)是一种专性细胞内寄生菌，是人类呼吸道疾病的重要病原体，可引起急慢性呼吸道疾病，社区获得性肺炎、支气管炎和鼻窦炎5％～10％是由肺炎衣原体引起。肺炎衣原体的感染具有散发和流行交替出现的周期性，散发通常持续3～4年，有2～3年的流行期，在流行期间可有数月的短暂爆发发生。病人之间传播间隔期平均为30天，在密集人群中流行可持续6个月。肺炎衣原体呼引起的吸道感染临床表现不典型，通常以咽痛和音哑起病，数日至7天后出现咳嗽，与其他呼吸道疾病相比，自起病至就医的时间以肺炎衣原体感染为最长。
MP及Cpn常用检测方法：(1)病原体的分离和培养，从临床标本中分离培养出肺炎支原体和肺炎衣原体可获得可靠的诊断。但到目前为止，这两种病原体很难通过培养获得，一方面是由于这些病人多为干性咳嗽，痰标本难以获得；另一方面是支原体和衣原体的培养要求很高，一般实验室难以开展。(2)血清学检查，传统的血清学检查方法为补体结合试验(CFTs)，是一种敏感和常用的检查方法。但此法存在许多缺点，如支原体CFTs的假阳性可以出现在炎症反应过程中；CFTs不能用于鉴别肺炎衣原体与鹦鹉热衣原体感染，因为两者有共同抗原。抗原检测如应用单克隆直接或间接荧光抗体对标本(体液和组织)进行染色检测致病原抗原，有高度特异性，但敏感性都不高，所以临床已很少应用。(3)分子生物学检测，应用分子生物学技术对临床标本进行肺炎支原体和肺炎衣原体DNA检测，对早期快速诊断有重要意义。如应用DNA探针和多聚酯链反应(PCR)技术检测痰、呼吸道分泌物、血清、BAL液中的肺炎支原体和肺炎衣原体DNA，其敏感性和特异性均很高。但须注意质量控制，否则可能出现较多的假阳性结果。这些方法需要特殊的PCR扩增条件，专门的实验室和PCR仪，而且在检测过程中极易产生污染。因此在RNA恒温扩增技术的基础上，结合多生物素信号放大技术，建立单管联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体核酸的方法具有非常重要的意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物加入到包被有包被探针的微孔中进行杂交，同时加入的还有该包被探针对应的特异探针及放大探针。其中包被探针可以和每个指标的CES系列探针一端序列互补配对结合，CES系列探针的另一端可结合到RNA产物上，使RNA产物锚定到微孔中；每个指标的LES系列探针的一端可结合到RNA产物上，另一端与放大探针结合，实现信号放大过程。标记有多生物素的放大探针随后与链霉亲和素-HRP酶联物结合，最终形成包被探针-特异探针-RNA扩增产物-特异探针-放大探针-链霉亲和素-HRP酶联物复合体，最后加入HRP酶化学发光底物，在化学发光仪上进行检测。实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的RNA提取过程，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，基于RNA分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使肺炎支原体和肺炎衣原体核酸检测得到广泛应用成为一种可能。
为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体核酸的试剂盒，包括：
1)扩增反应液：含40mM Tris-HCl(pH 8.0)，12mM MgCl2，70mM KCl，15％DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM。其中扩增引物包括三对：肺炎支原体、肺炎衣原体和人内参基因，具体如下：
(1)肺炎支原体(P1基因一段保守区序列)的扩增引物：
MP-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACAATTTGGTCAGGAGACT；
MP-F引物(5’-3’)：CGCAAAGATGAATGACGA；
(2)肺炎衣原体(16SrRNA基因一段保守区序列)的扩增引物：
Cpn-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGAACAGCTCCTTTCAAGT；
Cpn-F引物(5’-3’)：GAAGGTCCCAAGGGTTTG；
(3)内参基因(人18SrRNA一段保守区序列)的扩增引物：
内参-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGACTTGCCCTCCA；
内参-F引物(5’-3’)：AGAAACGGCTACCACATCC；
在设计引物时同时要保证各自单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰。三对引物的R引物5’端都引入了T7 RNA聚合酶启动子序列。
2)扩增酶：包含三种，逆转录酶(如AMV或M-MLV)、T7 RNA聚合酶和RnaseH。
3)细胞裂解液：购至美国Signosis公司，货号CL-0001，可以裂解细胞，释放核酸；
4)放大探针：一种标有生物素的核酸序列，该探针可以和特异探针的LES系列的一端结合，具体序列(5’-3’)为:AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA-Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG-biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG；
5)特异探针：每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体(5’-3’)如下：
(1)肺炎支原体特异探针
MP-CES1：TGTTGATGGTATTGTAttttCTGTACGTATGTATGT；
MP-CES2：CGCACCCCACTCGCTGttttCTGTACGTATGTATGT；
MP-LES1：AACTGTTAGATGGGGAttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
MP-LES2：AGGACAAACAGCTGACttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
MP-LES3：ACTGGTCCACAAAGCGttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
(2)肺炎衣原体特异探针
Cpn-CES1：GCTGTTCGCCAATTAAttttCTGTACGTATGTATGT；
Cpn-CES2：AGCGGTACGCGAGCTGttttCTGTACGTATGTATGT；
Cpn-LES1：GGTTCAAAACGTCGTGttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
Cpn-LES2：AGACAGTTTGGTCTCTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
Cpn-LES3：ATCCTTTGTGGGCGCAttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
(3)内参特异探针
内参CES1：AAGGAAGGCAGCAGGCttttCTGTACGTATGTATGT；
内参CES2：GCGCAAATTACCCACTttttCTGTACGATTGTATGT；
内参LES1：CCCGACCCGGGGAGGTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
内参LES2：AGTGACGAAAAATAACttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
内参LES3：AGTGACGAAAAATAACttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
6)微孔板：每个微孔中包被有包被探针，该包被探针可以和每个指标的CES系列探针一端序列互补配对结合，具体序列(5’-3’)为：ACATACATACGTACAG；
7)HRP-链霉亲和素酶联物：标记有链霉亲和素的HRP酶联物，该酶联物可以和放大探针上生物素结合；
8)配制杂交液、洗液A(5×)、洗液B(5×)、封闭液、底物稀释液，杂交液：含0.1％SDS的5×SSC；洗液A(5×)：含0.5％SDS的5×SSC；洗液B(5×)：含0.5％SDS的5×PBS；封闭液：含0.5％BSA、1×PBS；底物稀释液：50mM pH 8.5Tris-HCl。
9)底物：鲁米诺化学发光底物(购至Thermo Fisher，货号37075)，遇到HRP酶催化后能够产生化学发光信号，被仪器检测到。
本发明提供利用上述基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体核酸的试剂盒检测肺炎支原体和肺炎衣原体核酸的方法，包括如下步骤：
(1)RNA恒温扩增
本发明检测指标有三个：肺炎支原体、肺炎衣原体和人内参基因。针对每个指标设计一对(F/R引物)扩增引物，其中R引物5’端带有T7 RNA聚合酶启动子。本发明在同一扩增管内实现各个指标核酸的扩增，具体如下：扩增时，在带有T7启动子的R引物和逆转录酶的作用下，将待测RNA转化为RNA:cDNA杂合体；扩增酶中的RNaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；在F引物和反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有T7启动子的双链DNA；带有T7启动子的双链DNA在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成RNA分子产物。转录的RNA分子产物可以进入循环扩增过程，首先F引物会结合转录的RNA分子产物，在逆转录酶的作用下将转录的RNA转化为RNA:cDNA杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；接着R引物会结合到单链cDNA上，在反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，再次富集合成更多的带有T7启动子的双链DNA分子，为T7 RNA聚合酶提供更多的转录模板，进而在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成大量的RNA分子产物(如图1)。
本发明设计人内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、扩增体系的有效性。当样本采集合格时样本中一定会含有人脱落细胞，在检测时一定会被检测到，样本检测阴性时内参应该为阳性，否则整个检测需要重新采样进行重测。
(2)多生物素信号放大
a，设计特异探针、放大探针和包被探针
特异探针：每个指标特异探针包括在两种：CES系列和LES系列，每种探针可以设计多条。其中CES探针包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和包被在微孔板中的包被探针集合，起到固定扩增产物RNA的作用，这两个部分用4～5个T链接。每条LES探针也包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和放大探针结合，起到链接放大探针的作用，这两个部分用4～5个T链接。
放大探针：放大探针为含有多个生物素的探针，该探针可以和特异探针LES的一端结合，探针上的生物素可以和HRP-链霉亲和素酶联物结合。
包被探针：包被探针被固定在微孔板中，可以和特异探针CES的一端结合，起到固定的作用。
所诉特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉，CES系列同放大探针以及包被探针无交叉，以保证检测的特异性。
所诉特异探针的CES系列和LES系列设计多条的目的是为了提高多生物素放大步骤的灵敏度，从而增加检测体系的灵敏度。
b，检测结果判断
扩增检测时同时设置阴性对照，即在检测样本的同时也扩增阴性质控物(细胞裂解液，购至美国Signosis公司，货号CL-0001)。每管扩增产物会被均分到三个微孔板微孔中，其中MP微孔在杂交时会加入肺炎支原体特异探针；Cpn微孔在杂交时会加入肺炎衣原体特异探针、内质控微孔在杂交时会加入内参特异探针。杂交洗涤后加入化学发光底物，并进行化学发光值测定，对样本检测指标的比值R进行计算，其中R＝待测样本检测指标相对光单位(RLU)/(5×阴性质控物检测指标相对光单位(RLU)值)；根据比值R对样本进行定性判断，比值R大于1.0则判断为阳性，小于等于1.0则为阴性。
结合上述原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：
(1)核酸提取
采集疑似肺炎支原体或肺炎衣原体感染患者的咽拭子样本，使用细胞裂解液裂解的方法释放病原体RNA分子。
(2)RNA恒温扩增
向17μL的含有肺炎支原体、肺炎衣原体和人内参基因扩增引物的扩增反应液中加入2μL核酸提取物，95℃加热2min，42℃预热2min，加入1μL扩增酶，42℃恒温扩增1小时。待测样本中若有肺炎支原体、肺炎衣原体核酸，扩增时会对指标RNA分子进行大量扩增富集。
(3)多生物素信号放大
a，将RNA恒温扩增产物与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)、放大探针及杂交液同时加入到微孔板中，50℃恒温孵育1小时。
扩增出的RNA分子与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)互补配对结合。CES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端同微孔板中的包被探针结合，可以将RNA分子固定在微孔板中；LES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端可以与放大探针互补配对，形成CES探针-RNA分子-LES探针-放大探针复合物，该复合物被固定在微孔板上。(如图2)
b，用洗液A洗去未结合于微孔板上的RNA分子、特异探针和放大探针。
c，加入封闭液，室温封闭1～2分钟，封闭非特异性位点。
d，将HRP-链霉亲和素酶联物加入微孔板孵育，该酶联物可以和放大探针上的生物素结合，最终形成CES探针-RNA分子-LES探针-放大探针-HRP-链霉亲和素酶联物，并被固定在微孔板上。
e，用洗液B洗去游离的HRP-链霉亲和素酶联物。
f，按照底物A:底物B:底物稀释液＝1:1:8的比例配置底物，向每个微孔加入底物，并进行化学发光值测定。
g，计算待测样本各个标的比值R。
R＝待测样本检测指标相对光单位(RLU)/(5×阴性质控物检测指标相对光单位(RLU)值)。
比值R大于1.0则判断为阳性，小于等于1.0则为阴性。
第二方面，提供上述基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒在制备肺炎支原体和肺炎衣原体检测试剂中的应用。
本发明和现有技术相比较，具有如下有益效果：
1、本发明通过RNA恒温扩增的方法在同一管内能够同时扩增肺炎支原体、肺炎衣原体和人内参基因三种指标，所扩增出的核酸产物为RNA，RNA在自然环境中容易降解，相比较于PCR的方法扩增出DNA更容易起到防止污染的效果。RNA恒温扩增是在42℃环境中进行，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，最大限度的降低了实验仪器的要求。
2、本发明在设计引物时所选基因区域较为保守，可以对常见流行株进行全覆盖。同时本发明在设计引物时同时经过多轮测试，保证了各单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰，整体扩增效果好。
3、本发明在设计时引入的特异探针CES系列和特异探针LES系列有桥分子成分的作用，两种探针成功的将放大探针和RNA核酸扩增片段串联结合到一块，实现指标RNA核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和指标核酸扩增片段杂交失败，都不能够被成功的固定在微孔板上，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。本发明试剂盒对表3所列的20种其它微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其它微生物之间没有交叉反应。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度。本发明试剂盒对MP的最低检测限为1×102cfu/mL、Cpn的最低检测限为0.5TCID50/mL。对于359份诊断结果均与呼吸道感染相关临床样本的肺炎支原体和肺炎衣原体检测灵敏度、特异性高于某商品化检测肺炎支原体和肺炎衣原体荧光定量PCR试剂盒。
附图说明
图1 RNA恒温扩增原理图；
图2多生物素信号放大原理图；
图3 96孔微孔板布板示意图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。实施例中所用的化学发光检测仪器为厦门天众达科技股份有限公司的化学发光免疫分析仪，型号TZD-CL-200G。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版(New York:Cold Spring Harbor laboratory Press,2005)中所述的条件进行。
【实施例1】灵敏度测试
将已知浓度的肺炎支原体、肺炎衣原体按十倍浓度梯度稀释。用试剂盒中的裂解液(病原体：裂解液＝1:1)裂解各稀释浓度的病原体。双扩增检测每个稀释浓度的病原体，测定结果。检测时每个梯度的病原体稀释液单独重复5份。将具有90％-95％阳性检出率的病原体滴度值初步作为最低检测限。检测限初值确定后，将每个病原体亚型原液稀释到初值滴度附近，用本试剂盒对不同浓度的病原体进行检测，每个滴度检测20次，以对最低检测限值进行进一步精确确定(选阳性率在95％以上的)。具体结果如下：
MP最低检测限检测
表1.1 MP滴度实验数据
Figure BDA0002325829700000091
表1.2 MP最低检测限实验数据
Figure BDA0002325829700000092
Figure BDA0002325829700000101
Cpn最低检测限检测
表2.1 Cpn滴度实验数据
Figure BDA0002325829700000102
表2.2 Cpn最低检测限实验数据
Figure BDA0002325829700000103
Figure BDA0002325829700000111
最终确定本发明试剂盒的最低检测限为：
病原体 最低检测限
MP 1×10<sup>2</sup>cfu/mL
Cpn 0.5TCID<sub>50</sub>/mL
【实施例2】特异性验证
将不同的微生物用细胞裂解液裂解后双扩增检测，验证试剂盒探针设计的特异性，其结果见下表：
表3其他病原微生物之间的交叉反应验证数据
Figure BDA0002325829700000112
结果显示，本试剂盒所检测的病原体没有涉及到与其他病原体进行交叉反应。
【实施例3】临床样本的验证
1，临床样本信息
在湖北省妇幼保健院共检测样本359份，其中男性标本和女性标本分别为196例和163例，分别占比为54.60％和45.40％。452例标本中，患者年龄最大为62岁，最小为1个月，平均年龄为10.63岁，标准差为11.2岁，中位数为6岁。入组患者的诊断结果均与呼吸道感染相关，具体分布情况如下：疑似肺炎196例，(急性、喘息性)支气管炎69例，(急性)上呼吸道感染37例，(感染性)发热20例，流行性感冒19例，其他18例。
2，检测结果
1)肺炎支原体检测结果
检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测肺炎支原/体肺炎衣原体荧光定量PCR试剂盒同时对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：
Figure BDA0002325829700000121
对于不一致的3例样本采用“基因测序法”进行复测，结果1例阳性，为本发明试剂盒检测阳性某商品化检测肺炎支原体/肺炎衣原体荧光定量PCR试剂盒检测阴性样本，由测序结果可知，某商品化检测肺炎支原体/肺炎衣原体荧光定量PCR试剂盒漏检一例，假阳2例，显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本MP检测灵敏度更高，特异性更强。
2)肺炎衣原体检测结果
检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测肺炎支原/体肺炎衣原体荧光定量PCR试剂盒同时对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：
Figure BDA0002325829700000122
对于不一致的5例样本采用“基因测序法”进行复测，结果3例阳性，为本发明试剂盒检测阳性某商品化检测肺炎支原体/肺炎衣原体荧光定量PCR试剂盒检测阴性样本，由测序结果可知，某商品化检测肺炎支原体/肺炎衣原体荧光定量PCR试剂盒漏检3例，假阳2例，显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本CP检测灵敏度更高，特异性更强。
序列表
<110> 武汉中帜生物科技股份有限公司
<120> 一种肺炎支原体和肺炎衣原体核酸联合检测试剂盒及其应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taatacgact cactataggg agacaatttg gtcaggagac t 41
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcaaagatg aatgacga 18
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taatacgact cactataggg agagaacagc tcctttcaag t 41
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtccca agggtttg 18
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taatacgact cactataggg agacaccaga cttgccctcc a 41
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agaaacggct accacatcc 19
<210> 7
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> 两个碱基之间用biotin连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(45)
<223> 两个碱基之间用biotin连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(67)
<223> 两个碱基之间用biotin连接
<400> 7
agaaggcgtc cgtctttgag gcacccgatg gataggtcgg tgaataagca tcgtgccctt 60
tcgcagacca cgttcgcgtt ctcacatg 88
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgttgatggt attgtatttt ctgtacgtat gtatgt 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcaccccac tcgctgtttt ctgtacgtat gtatgt 36
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aactgttaga tggggatttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aggacaaaca gctgactttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
actggtccac aaagcgtttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctgttcgcc aattaatttt ctgtacgtat gtatgt 36
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agcggtacgc gagctgtttt ctgtacgtat gtatgt 36
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggttcaaaac gtcgtgtttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agacagtttg gtctcttttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atcctttgtg ggcgcatttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaggaaggca gcaggctttt ctgtacgtat gtatgt 36
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcgcaaatta cccacttttt ctgtacgatt gtatgt 36
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cccgacccgg ggaggttttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agtgacgaaa aataactttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agtgacgaaa aataactttt catgagaacg cgaacgtggt 40
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acatacatac gtacag 16

Claims (2)

1.一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
1）扩增反应液：含40 mM Tris-HCl (pH 8.0)，12 mM MgCl2，70 mM KCl，15% DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1 mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2 µM；其中扩增引物包括三对：肺炎支原体、肺炎衣原体和人内参基因，具体如下：
（1）肺炎支原体的扩增引物：
MP-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGACAATTTGGTCA
GGAGACT；
MP-F引物（5’-3’）：CGCAAAGATGAATGACGA；
（2）肺炎衣原体的扩增引物：
Cpn-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGAACAGCTCCT
TTCAAGT；
Cpn-F引物（5’-3’）：GAAGGTCCCAAGGGTTTG；
（3）内参基因的扩增引物：
内参-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGACTT
GCCCTCCA；
内参-F引物（5’-3’）：AGAAACGGCTACCACATCC；
2）扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RnaseH；优选地，所述逆转录酶为AMV或M-MLV；
3）细胞裂解液：购至美国Signosis公司，货号CL-0001；
4）放大探针：一种标有生物素的核酸序列，该探针可以和特异探针的LES系列的一端结合，具体序列（5’-3’）为: AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA-Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG-biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG；
5）特异探针：每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体（5’-3’）如下：
（1）肺炎支原体特异探针
MP-CES1：TGTTGATGGTATTGTAttttCTGTACGTATGTATGT；
MP-CES2：CGCACCCCACTCGCTGttttCTGTACGTATGTATGT；
MP-LES1：AACTGTTAGATGGGGAttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
MP-LES2：AGGACAAACAGCTGACttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
MP-LES3：ACTGGTCCACAAAGCGttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
（2）肺炎衣原体特异探针
Cpn-CES1：GCTGTTCGCCAATTAAttttCTGTACGTATGTATGT；
Cpn-CES2：AGCGGTACGCGAGCTGttttCTGTACGTATGTATGT；
Cpn-LES1：GGTTCAAAACGTCGTGttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
Cpn-LES2：AGACAGTTTGGTCTCTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
Cpn-LES3：ATCCTTTGTGGGCGCAttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
（3）内参特异探针
内参CES1：AAGGAAGGCAGCAGGCttttCTGTACGTATGTATGT；
内参CES2：GCGCAAATTACCCACTttttCTGTACGATTGTATGT；
内参LES1：CCCGACCCGGGGAGGTttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
内参LES2：AGTGACGAAAAATAACttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
内参LES3：AGTGACGAAAAATAACttttCATGAGAACGCGAACGTGGT；
6）微孔板：每个微孔中包被有包被探针，该包被探针可以和每个指标的CES系列探针一端序列互补配对结合，具体序列（5’-3’）为：ACATACATACGTACAG；
7）HRP-链霉亲和素酶联物：标记有链霉亲和素的HRP酶联物，该酶联物可以和放大探针上生物素结合；
8）配制杂交液、洗液A（5×）、洗液B（5×）、封闭液、底物稀释液，杂交液：含0.1% SDS的5×SSC；洗液A（5×）：含0.5% SDS的5×SSC；洗液B（5×）：含0.5% SDS的5×PBS；封闭液：含0.5% BSA、1 × PBS；底物稀释液：50mM pH 8.5 Tris-HCl；
9）底物：购至Thermo Fisher，货号37075的鲁米诺化学发光底物，遇到HRP酶催化后能够产生化学发光信号，被仪器检测到。
2.权利要求1所述的试剂盒在制备肺炎支原体和肺炎衣原体检测试剂中的应用。
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