CN110964854B - 用于同时检测七项呼吸道病原体核酸的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于同时检测七项呼吸道病原体核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒是基于双扩增（RNA恒温扩增+多生物素信号放大）技术，涉及甲型流感病毒的H1N1/H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒的1/2/3型、腺病毒的B/E属、肺炎支原体、肺炎衣原体。本发明无需RNA提取，在检测中不易污染，灵敏度高、特异性强，可广泛用于这七项呼吸道病原体核酸检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于双扩增(RNA恒温扩增+多生物素信号放大)技术联合检测七项呼吸道病原体核酸的试剂盒及其应用。
背景技术
流感病毒(FLU)是一种有包膜、分节段基因组的单链RNA病毒，属于正粘病毒科。根据核蛋白和包膜内侧面的M1蛋白的抗原性将流感病毒分甲、乙、丙三型。甲型流感病毒再根据包膜表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种刺突的抗原性分若干亚型，目前包括H1～H16亚型和N1～N9亚型，甲型流感病毒的亚型是把HA和NA列在一起命名的。H1N1、H3N2为较常见的季节性流感病毒。甲型流感病毒(FluA)每10年到30年会大爆发一次，而且每年都会发生甲型或乙型流感病毒(FluB)流行病。流感病毒的感染是季节性的，特别在北半球是从11月到4月容易爆发。小孩和老年人以及长期患有心血管肺炎的病人易于被感染。通过吸入空气中飞沫或者传染物仅经过1～3天潜伏期就会散播出去。
呼吸道合胞病毒(RSV)是单链RNA包膜病毒，广泛分布于世界各地，是引起婴幼儿下呼吸道感染主要的和常见的病原体，在绝大部分地区RSV所致的1岁以内婴幼儿肺炎和支气管炎远远高于其他病原微生物。成年人感染会导致普通感冒。RSV通常是季节性的，易于在冬天和早春感染并引起多达5个月的流行期。我国每年数千万住院的婴幼儿因RSV感染的占50％，且RSV的再感染率很高，成人RSV的再感染同样很常见。该病毒具有传染性强，症状与副流感病毒肺炎、轻症流感病毒肺炎及轻症腺病毒肺炎在临床上几乎无法区别，因此，实验室诊断就显得非常重要。
副流感病毒(PIV)是单链RNA包膜病毒，四种亚型各有不同的临床和流行病学特征。1型和2型的最典型的临床特征是造成儿童喉气管支气管炎，1型是儿童喉气管支气管炎的主要原因，而2型次之。1型和2型均能造成其它的上呼吸道和下呼吸道疾病。3型经常导致肺炎和细支气管炎。副流感病毒是常常引起儿童下呼吸道感染的一种病毒，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒(RSV)。人类副流感病毒的潜伏期一般在1～7天左右。
腺病毒(AdV)是一种双链DNA病毒。腺病毒感染呼吸道的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉痛等，一般潜伏期5～7天左右，容易侵犯6个月至5岁小孩，占儿童呼吸道感染5％～20％。一般秋春以呼吸道感染为多，春、初夏以合并结膜炎为多。大部份由飞沫传染，少部份由粪便接触感染。疾病的过程约5～7天，也有进入第二星期的。感染2～3星期后产生抗体，可持续一至数年，同型病毒再感染的机率很少。腺病毒引起的呼吸道、泌尿道以及胃肠道感染在临床表现方面与其他病原微生物的感染非常相似，因此，仅根据临床表现来进行疾病的诊断是比较困难的，需要进行实验室诊断加以证实。
肺炎支原体(MP)是造成人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎的病理改变以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎。主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，发病率以青少年最高。肺炎支原体是介于细菌与病毒之间的一种胸膜肺炎微生物，为已知独立生活的生物中的最小者，能耐冰冻。MP是儿童和成人社区获得性肺炎的常见病原体。
肺炎衣原体(Cpn)是一种专性细胞内寄生菌，是人类呼吸道疾病的重要病原体，可引起急慢性呼吸道疾病，社区获得性肺炎、支气管炎和鼻窦炎5～10％是由肺炎衣原体引起。肺炎衣原体的感染具有散发和流行交替出现的周期性，散发通常持续3～4年，有2～3年的流行期，在流行期间可有数月的短暂爆发发生。病人之间传播间隔期平均为30天，在密集人群中流行可持续6个月。肺炎衣原体引起的吸道感染临床表现不典型，通常以咽痛和音哑起病，数日至7天后出现咳嗽，与其他呼吸道疾病相比，自起病至就医的时间以肺炎衣原体感染为最长。
现在常用的呼吸道病原体核酸检测都是基于RT-PCR的方法，这些方法需要复杂的RNA提取过程，特殊的PCR扩增条件，专门的实验室和荧光定量PCR仪，而且在检测过程中极易产生污染。因此在RNA恒温扩增技术的基础上，结合多生物素信号放大技术，建立单管联合检测多种呼吸道病原体核酸的方法具有非常重要的意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测七项呼吸道病原体核酸的试剂盒及其应用，所述七项呼吸道病原体为甲型流感病毒的H1N1/H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒的1/2/3型、腺病毒的B/E属、肺炎支原体、肺炎衣原体。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物加入到包被有包被探针的微孔中进行杂交，同时加入的还有该包被探针对应的特异探针及放大探针。其中包被探针可以和每个指标的CES系列探针一端序列互补配对结合，CES系列探针的另一端可结合到RNA产物上，使RNA产物锚定到微孔中；每个指标的LES系列探针的一端可结合到RNA产物上，另一端与放大探针结合，实现信号放大过程。标记有多生物素的放大探针随后与链霉亲和素-HRP酶联物结合，最终形成包被探针-特异探针-RNA扩增产物-特异探针-放大探针-链霉亲和素-HRP酶联物复合体，最后加入HRP酶化学发光底物，在化学发光仪上进行检测。实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的RNA提取过程，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，基于RNA分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使这七项呼吸道病原体核酸检测得到广泛应用成为一种可能。
为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测七项呼吸道病原体核酸的试剂盒，所述七项呼吸道病原体为甲型流感病毒的H1N1/H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒的1/2/3型、腺病毒的B/E属、肺炎支原体、肺炎衣原体，所述试剂盒包括：
1)扩增反应液：含40mM Tris-HCl(pH 8.0)，12mM MgCl2，70mM KCl，15％DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM，其中扩增引物包括十对：甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体和人内参基因，具体的：
(1)甲型流感病毒(NP基因一段保守区序列)的扩增引物：
FluA-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCAGCACTACAGCTAAGGC；
FluA-F引物(5’-3’)：ACTTGAATCGTTGCATCTGC；
(2)乙型流感病毒(M基因一段保守区序列)的扩增引物：
FluB-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACTGTTGGTTCGGTGG；
FluB-F引物(5’-3’)：ACGTCTTCTCCTTTTCCCA；
(3)呼吸道合胞病毒
RSV-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGGTGTATCTATYACACC；
注：本发明中的简并碱基Y代表T/C；
RSV-F引物(5’-3’)：AGAATTCAGTGTCAATGCAGGT；
(4)副流感病毒1型：
PIV1-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGAACCCCTACTGAGCAACAAC；
PIV1-F引物(5’-3’)：CCTGTTGTCGTTGATGTCATA；
(5)副流感病毒2型：
PIV2-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGATTACACTCACAATGTAATACTTG；
PIV2-F引物(5’-3’)：AAGCAAGTCTCAGTTCAGCTAG；
(6)副流感病毒3型：
PIV3-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGATGCACGTCTGGCCTTC；
PIV3-F引物(5’-3’)：GAGGTATAAGCATAAATCAGATCAT；
(7)腺病毒：
ADV-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGATTCCACATACTGAAGTATCTGG；
ADV-F引物(5’-3’)：GCCTAACAGACCCAATTACATTG；
(8)肺炎支原体：
MP-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACCATGCCTGAGAACAGTAAGG；
MP-F引物(5’-3’)：GCCATGTTACCAAGTCGGCC；
(9)肺炎衣原体：
CP-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGATTCATCCCAGTCATCAGCCTC；
CP-F引物(5’-3’)：GCGTGTCAGCCATAACGCCGT；
(10)内参基因(人18SrRNA一段保守区序列)的扩增引物：
内参-R引物(5’-3’)TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCAACTAAGAACGGCCATGC；
内参-F引物(5’-3’)：CCAAAGTCTTTGGGTTCCG；
本发明在设计引物时，在保证单对引物扩增效率的同时，避免引物间二聚体的形成，影响多重扩增。十对引物的R引物5’端都引入了T7 RNA聚合酶启动子序列。
2)扩增酶：包含三种，逆转录酶(如AMV或M-MLV)、T7 RNA聚合酶和RnaseH；
3)细胞裂解液：购至美国Signosis公司，货号CL-0001，可以裂解细胞，释放核酸；
4)放大探针：一种标有生物素的核酸序列，该探针可以和特异探针的LES系列的一端结合，具体序列(5’-3’)为:AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA-Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG-biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG；
5)特异探针：每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：
(1)甲型流感病毒特异探针(5’-3’)
FluA-CES1：TCTCATTGCYTGCACCTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
FluA-CES2：ATYTGCCTRGCCTGACTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
注：本发明中的简并碱基R代表A/G；
FluA-LES1：TAGCAACCTYCATGGCTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
FluA-LES2：CTCNRCTGCYTGYTCRTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
注：本发明中的简并碱基N代表A/T/C/G；
FluA-LES3：CTYGATCCAGCCATTTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
(2)乙型流感病毒特异探针(5’-3’)
FluB-CES1 TCATAGCTGAGACCATTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
FluB-CES2 CTGCATTTCTCGTCTCTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
FluB-LES1 ACTCCGGGCACTGAAGTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
FluB-LES2 ATCTCGCTGCTCTGCTTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
FluB-LES3 ATGAGCCCTGTGTGAATTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
(3)呼吸道合胞病毒特异探针(5’-3’)
RSV-CES1：TTTGTTGCCTTACTATTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
RSV-CES2：GACATGATAGARTAACTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
RSV-LES1：CTGAACATTGCTTGACTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
RSV-LES2：ATTAAYTTTTTCTGATTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
RSV-LES3：CATTTGTTATAGGCATTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
(4)副流感病毒特异探针(1型、2型、3型)(5’-3’)
PIV1-CES1：AAGGATATGTAACCTATTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
PIV1-CES2：ATTGTAAAACCTGATATTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
PIV1-LES1：GCACATCCTTGAGTGATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV1-LES2：TTAAGTTTGATGAATATTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV1-LES3：CGCATATATTGCATCATTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV2-CES1：ACAAGACACAACCTCCTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
PIV2-CES2：TGGTATAGCAGTGACTTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
PIV2-LES1：GAACAGCTTTTGCGATTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV2-LES2：TGATTCCATCACTTAGTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV2-LES3：GTAAATGGTTTTCATATTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV3-CES1：AACTAAGGACGGAGTTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
PIV3-CES2：CTGACACAGCCATCAATTTTCTGTAGGAATGAATGT；
PIV3-LES1：CAGTCGTTGGCATAGCTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV3-LES2：TAATAATCCCGGCCCTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV3-LES3；GGCATTAACCTTATTTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
(5)腺病毒特异探针(5’-3’)
AdV-CES1：ACAGTACTGGAAATATTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
AdV-CES2：GGGAGTTTTGGCTGGCTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
AdV-LES1：CAAGCATCACAACTGATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
AdV-LES2：ATGCAGTGGTTGACTTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
AdV-LES3：GCAGGACAGAAACACTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
(6)肺炎支原体特异探针(5’-3’)
MP-CES1：ACACCGCGCCTTTGAGTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
MP-CES2：TATAGGTGTCTTTAGGTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
MP-LES1：GTGCGCTATAATGCAATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
MP-LES2：CTGGTACCAGTGCTACTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
MP-LES3：TGTAACTGGTTGACCATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
(7)肺炎衣原体探针(5’-3’)
Cpn-CES1：CGGGCCTTGTACACACTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
Cpn-CES2：CGCCCGTCACATCATGTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
Cpn-LES1：GGAGTTGGTTTTACCTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
Cpn-LES2：TAAGTCGTTGACTCAATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
Cpn-LES3：CCTATTTATAGGAGAGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
(8)内质控特异探针(5’-3’)
18SrRNA-CES1：AGTGGAGCCTGCGGCTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
18SrRNA-CES2：TAATTTGACTCAACACTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
18SrRNA-LES1：GGGAAACCTCACCCGGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
18SrRNA-LES2：CCCGGACACGGACAGGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
18SrRNA-LES3：ATTGACAGATTGATAGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
6)微孔板：每个微孔中包被包被探针，该包被探针可以和每个指标的CES系列探针一端序列互补配对结合，具体序列为：ACATTCATTCCTACAG；
7)HRP-链霉亲和素酶联物：标记有链霉亲和素的HRP酶联物，该酶联物可以和放大探针上生物素结合；
8)配制杂交液、洗液A(5×)、洗液B(5×)、封闭液、底物稀释液，杂交液：含0.1％SDS的5×SSC；洗液A(5×)：含0.5％SDS的5×SSC；洗液B(5×)：含0.5％SDS的5×PBS；封闭液：含0.5％BSA、1×PBS；底物稀释液：50mM pH 8.5Tris-HCl。
9)底物：鲁米诺化学发光底物(购至Thermo Fisher，货号37075)，遇到HRP酶催化后能够产生化学发光信号，被仪器检测到。
本发明提供利用上述基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测七项呼吸道病原体核酸的试剂盒检测七项呼吸道病原体核酸的方法，包括如下步骤：
(1)RNA恒温扩增
本发明检测指标有八个：甲型流感病毒的H1N1/H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒的1/2/3型(作为一个指标检测)、腺病毒的B/E属、肺炎支原体、肺炎衣原体和人内参基因(可区分样本中不同病原体，但无法区分同一病原体的不同型别)。针对每个指标设计扩增引物，其中R引物5’端带有T7 RNA聚合酶启动子。本发明在同一扩增管内实现各个指标核酸的扩增，具体如下：扩增时，在带有T7启动子的R引物和逆转录酶的作用下，将待测RNA转化为RNA:cDNA杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；在F引物和反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有T7启动子的双链DNA；带有T7启动子的双链DNA在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成RNA分子产物。转录的RNA分子产物可以进入循环扩增过程，首先F引物会结合转录的RNA分子产物，在逆转录酶的作用下将转录的RNA转化为RNA:cDNA杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；接着R引物会结合到单链cDNA上，在反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，再次富集合成更多的带有T7启动子的双链DNA分子，为T7 RNA聚合酶提供更多的转录模板，进而在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成大量的RNA分子产物(如图1)。
本发明设计人内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、扩增体系的有效性。当样本采集合格时样本中一定会含有人脱落细胞，在检测时一定会被检测到，样本检测阴性时内参应该为阳性，否则整个检测需要重新采样进行重测。
(2)多生物素信号放大
a，设计特异探针、放大探针和包被探针
特异探针：每个指标特异探针包括在两种：CES系列和LES系列，每种探针可以设计多条。其中CES探针包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和包被在微孔板中的包被探针集合，起到固定扩增产物RNA的作用，这两个部分用4～5个T链接。每条LES探针也包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和放大探针结合，起到链接放大探针的作用，这两个部分用4～5个T链接。
放大探针：放大探针为含有多个生物素的探针，该探针可以和特异探针LES的一端结合，探针上的生物素可以和HRP-链霉亲和素酶联物结合。
包被探针：包被探针被固定在微孔板中，可以和特异探针CES的一端结合，起到固定的作用。
所诉特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉，CES系列同放大探针以及包被探针无交叉，以保证检测的特异性。
所诉特异探针的CES系列和LES系列设计多条的目的是为了提高多生物素放大步骤的灵敏度，从而增加检测体系的灵敏度。
b，检测结果判断
扩增检测时同时设置阴性对照，即在检测样本的同时也扩增阴性质控物(细胞裂解液，购至美国Signosis公司，货号CL-0001)。每管扩增产物会被均分到1纵列八个微孔板微孔中(微孔布板图如图3)，其中FluA微孔在杂交时会加入甲型流感病毒特异探针；FluB微孔在杂交时会加入乙型流感病毒特异探针、RSV微孔在杂交时会加入呼吸道合胞病毒特异探针、PIV微孔在杂交时会加入副流感病毒1/2/3特异探针、ADV微孔在杂交时会加入腺病毒特异探针、MP微孔在杂交时会加入肺炎支原体特异探针、CP微孔在杂交时会加入肺炎衣原体特异探针、内质控微孔在杂交时会加入内质控特异探针。杂交洗涤后加入化学发光底物，并进行化学发光值测定，对样本检测指标的比值R进行计算，其中R＝待测样本检测指标相对光单位(RLU)/(5×阴性质控物检测指标相对光单位(RLU)值)；根据比值R对样本进行定性判断，比值R大于1.0则判断为阳性，小于等于1.0则为阴性。
结合上述原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：
(1)核酸提取
采集患者的咽拭子样本，使用细胞裂解液裂解的方法释放病毒RNA分子。
(2)RNA恒温扩增
向17μL的含有各检测指标引物的扩增反应液中加入2μL核酸提取物，95℃加热两分钟，42℃预热2分钟，加入1μL扩增酶，42℃恒温扩增1小时。待测样本中若有流感病毒核酸，扩增时会对指标RNA分子进行大量扩增富集。
(3)多生物素信号放大
a，将RNA恒温扩增产物与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)、放大探针及杂交液同时加入到微孔板中，50℃恒温孵育1小时。
扩增出的RNA分子与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)互补配对结合。CES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端同微孔板中的包被探针结合，可以将RNA分子固定在微孔板中；LES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端可以与放大探针互补配对，形成CES探针-RNA分子-LES探针-放大探针复合物，该复合物被固定在微孔板上(如图2)。
b，用洗液A洗去未结合于微孔板上的RNA分子、特异探针和放大探针。
c，加入封闭液，室温封闭1～2分钟，封闭非特异性位点。
d，将HRP-链霉亲和素酶联物加入微孔板孵育，该酶联物可以和放大探针上的生物素结合，最终形成CES探针-RNA分子-LES探针-放大探针-HRP-链霉亲和素酶联物，并被固定在微孔板上。
e，用洗液B洗去游离的HRP-链霉亲和素酶联物。
f，按照底物A:底物B:底物稀释液＝1:1:8的比例配置底物，向每个微孔加入底物，并进行化学发光值测定(测试仪器：厦门天众达科技股份有限公司的化学发光免疫分析仪，型号TZD-CL-200G)。
g，计算待测样本各个标的比值R。
R＝待测样本检测指标相对光单位(RLU)/(5×阴性质控物检测指标相对光单位(RLU)值)。
比值R大于1.0则判断为阳性，小于等于1.0则为阴性。
第二方面，提供上述基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测七项呼吸道病原体核酸的试剂盒在制备七项呼吸道病原体检测试剂中的应用。
本发明和现有技术相比较，具有如下有益效果：
1、本发明通过RNA恒温扩增的方法在同一管内能够同时扩增甲型流感病毒的H1N1/H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒的1/2/3型、腺病毒的B/E属、肺炎支原体、肺炎衣原体和内质控基因八个指标，所扩增出的核酸产物为RNA，RNA在自然环境中容易降解，相比较于PCR的方法扩增出DNA更容易起到防止污染的效果。RNA恒温扩增是在42℃环境中进行，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，最大限度的降低了实验仪器的要求。
2、本发明在设计引物时通过序列分析避免引物二聚体的形成，同时经过多伦测试，保证了各单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰，整体扩增效果好。由表29可知本发明试剂盒对29株不同来源的甲型流感病毒的H1N1/H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒RSV-A/RSV-B、人副流感病毒的1/2/3型、腺病毒的B/E属、肺炎支原体、肺炎衣原体具有很好的检出能力。
3、本发明在设计时引入的特异探针CES系列和特异探针LES系列有桥分子成分的作用，两种探针成功的将放大探针和RNA核酸扩增片段串联结合到一块，实现指标RNA核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和指标核酸扩增片段杂交失败，都不能够被成功的固定在微孔板上，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。本发明试剂盒对表28所列的20种其它微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其它微生物之间没有交叉反应。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高检测的灵敏度。本发明试剂盒对H1N1(ATCC VR-1469)的最低检测限为4×10TCID50/mL、H3N2(ATCC VR-1680D)的最低检测限为1×10TCID50/mL、FluB(ATCC VR-1735)的最低检测限为0.5TCID50/mL、RSVA(ATCC VR-26)的最低检测限为1×10TCID50/mL、RSVB(ATCC VR-1580)的最低检测限为2TCID50/mL、PIV1(ATCC VR-94)的最低检测限为1×10TCID50/mL、PIV2(ATCC VR-92)的最低检测限为5×10TCID50/mL、PIV3(ATCC VR-93)的最低检测限为5TCID50/mL、AdV3(ATCC VR-3)的最低检测限为1×10TCID50/mL、AdV4(ATCC VR-1572)的最低检测限为1×10TCID50/mL、MP(ATCC 29342)的最低检测限为50cfu/mL、Cpn(ATCC VR-1310)的最低检测限为2.5TCID50/mL。“金标准”测序方法测定的样本1716例，包含甲型流感阳性样本共181例，甲型流感病毒H1N1亚型和H3N2亚型阳性样本分别为45例和136例；乙型流感病毒阳性样本184例；副流感病毒阳性样本150例，副流感病毒阳性样本中PIV1型、2型、3型分别为44例、27例、79例；呼吸道合胞病毒阳性样本153例，呼吸道合胞病毒A亚型和B亚型阳性样本分别为29例和124例；腺病毒阳性样本160例，腺病毒B亚型和E亚型阳性样本分别为106例和54例；肺炎支原体阳性样本156例；肺炎支原体阳性样本147例，本发明试剂盒检测上述临床样本，与金标准测序方法比较，无明显差异，但是在多重检测、操作时间短、操作简单等方面具有明显的优势。
附图说明
图1RNA恒温扩增原理图；
图2多生物素信号放大原理图；
图3 96孔微孔板布板示意图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。实施例中所用的化学发光检测仪器为厦门天众达科技股份有限公司的化学发光免疫分析仪，型号TZD-CL-200G。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版(New York:Cold Spring Harbor laboratory Press,2005)中所述的条件进行。
【实施例1】灵敏度测试
将ATCC来源的病毒原液进行梯度稀释液进行最低检测限确定，每个梯度的病毒稀释液重复3～5份，每份进行20次的重复检测，将具有90％～95％阳性检出率的病毒水平作为最低检测限，
病原体信息如下：
表1病原体信息
| 亚型 | ATCC编号 | 相应单位 |
| H1N1 | VR-1469 | 8.89×10<sup>7</sup>TCID<sub>50</sub>/mL |
| H3N2 | VR-1680D | 3.1x 10<sup>6</sup>TCID<sub>50</sub>/mL |
| FluB | VR-1735 | 2.81×10<sup>7</sup>TCID<sub>50</sub>/mL |
| RSVA | VR-26 | 1.58×10<sup>7</sup>TCID<sub>50</sub>/mL |
| RSVB | VR-1580 | 8.89×10<sup>5</sup>TCID<sub>50</sub>/mL |
| PIV1 | VR-94 | 1.58×10<sup>4</sup>TCID<sub>50</sub>/mL |
| PIV2 | VR-92 | 2.8×10<sup>6</sup>TCID<sub>50</sub>/mL |
| PIV3 | VR93 | 1.58×10<sup>7</sup>TCID<sub>50</sub>/mL |
| AdVB | VR-3 | 1.58×10<sup>8</sup>TCID<sub>50</sub>/mL |
| AdVE | VR-1572 | 2.8×10<sup>6</sup>TCID<sub>50</sub>/mL |
| MP | 29342 | ＞10<sup>6</sup>cfu/mL |
| Cpn | VR-1310 | 2.8×10<sup>6</sup>TCID<sub>50</sub>/mL |
检出结果如下：
H1N1最低检测限检测
表2不同滴度H1N1的检测实验数据
表3 H1N1最低检测限实验数据
H3N2最低检测限检测
表4不同滴度H3N2的检测实验数据
表5 H3N2最低检测限实验数据
FluB最低检测限检测
表6不同滴度FluB的检测实验数据
表7 FluB最低检测限实验数据
RSV-A最低检测限检测
表8不同滴度RSV-A的检测实验数据
表9 RSV-A最低检测限实验数据
RSV-B最低检测限检测
表10不同滴度RSV-B的检测实验数据
表11 RSV-B最低检测限实验数据
AdV-3最低检测限检测
表12不同滴度AdV-3的检测实验数据
表13 AdV-3最低检测限实验数据
AdV-4最低检测限检测
表14不同滴度AdV-4的检测实验数据
表15 AdV-4最低检测限实验数据
PIV-1最低检测限检测
表16不同滴度PIV-1的检测实验数据
表17PIV-1最低检测限实验数据
PIV-2最低检测限检测
表18不同滴度PIV-2的检测实验数据
表19 PIV-2最低检测限实验数据
PIV-3最低检测限检测
表20不同滴度PIV-3的检测实验数据
表21 PIV-3最低检测限实验数据
MP最低检测限检测
表22不同滴度MP的检测实验数据
表23 MP最低检测限实验数据
Cpn最低检测限检测
表24不同滴度Cpn的检测实验数据
表25 Cpn最低检测限实验数据
最终确定本发明试剂盒的检测灵敏度为：
表26测试灵敏度
【实施例2】特异性验证
1，测试菌株
将不同的微生物提取核酸后检测，验证本发明试剂盒引物及探针设计的特异性。相关病原体及滴度如下：
表27特异性验证测试菌株信息
2，测试结果
测试结果如下：
表28特异性验证测测试结果
3，结论
从以上数据可以看出，本发明试剂盒对这些微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，体现试剂盒检测病原体的特异性强。
【实施例3】病原体检出力验证
使用本发明试剂盒对29株病原体株进行检测，验证本试剂盒对不同病原体株的检出能力。检测结果如下：
表29不同病原体株检测结果
从以上结果可以看出，本试剂盒对不同的病原体株具有很好的检出能力。
【实施例4】临床样本的验证
1、临床样本信息
在湖北省妇幼保健院、武汉大学人民医院和福建省立医院应用本发明试剂和“金标准”测序方法测定的样本1716例，包含甲型流感阳性样本共181例，甲型流感病毒H1N1亚型和H3N2亚型阳性样本分别为45例和136例；乙型流感病毒阳性样本184例；副流感病毒阳性样本150例，副流感病毒阳性样本中PIV1型、2型、3型分别为44例、27例、79例；呼吸道合胞病毒阳性样本153例，呼吸道合胞病毒A亚型和B亚型阳性样本分别为29例和124例；腺病毒阳性样本160例，腺病毒B亚型和E亚型阳性样本分别为106例和54例；肺炎支原体阳性样本156例；肺炎支原体阳性样本147例。
2、检测结果
湖北省妇幼保健院、武汉大学人民医院和福建省立医院与测序方法进行比对，
(1)甲型流感病毒：计数资料的χ2检验，P＞0.05，四格表分析阳性符合率99.4％，阴性符合率99.7％，总符合率99.7％，一致性Kappa值0.98。
(2)乙型流感病毒：计数资料的χ2检验，P＞0.05，四格表分析阳性符合率99.5％，阴性符合率99.7％，总符合率99.7％，一致性Kappa值0.98。
(3)副流感病毒：计数资料的χ2检验，P＞0.05，四格表分析阳性符合率99.3％，阴性符合率99.9％，总符合率99.8％，一致性Kappa值0.99，副流感病毒1、2、3亚型样本的检出率分别为100％，100％，98.6％。
(4)呼吸道合胞病毒：计数资料的χ2检验，P＞0.05，四格表分析阳性符合率98.7％，阴性符合率99.7％，总符合率99.7％，一致性Kappa值0.98，呼吸道合胞病毒A、B亚型临床样本的检出比率分别为100％，98.3％。
(5)腺病毒：计数资料的χ2检验，P＞0.05，四格表分析阳性符合率100％，阴性符合率99.9％，总符合率99.9％，一致性Kappa值0.99，腺病毒B、E亚型临床样本的检出比率分别为100％，100％
(6)肺炎支原体：计数资料的χ2检验，P＞0.05，四格表分析阳性符合率99.4％，阴性符合率99.7％，总符合率99.7％，一致性Kappa值0.98。
(7)肺炎衣原体：计数资料的χ2检验，P＞0.05，四格表分析阳性符合率100％，阴性符合率99.9％，总符合率99.9％，一致性Kappa值0.99。
本发明专利试剂盒检测临床样本与金标准测序方法比较，无明显差异，但是在多重检测、操作时间短、操作简单等方面具有明显的优势。
序列表
<110> 武汉中帜生物科技股份有限公司
<120> 用于同时检测七项呼吸道病原体核酸的试剂盒及其应用
<160> 72
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taatacgact cactataggg agagccagca ctacagctaa ggc 43
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acttgaatcg ttgcatctgc 20
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taatacgact cactataggg agacactgtt ggttcggtgg 40
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgtcttctc cttttccca 19
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)
<223> y=t或c
<400> 5
taatacgact cactataggg agacaaggtg tatctatyac acc 43
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agaattcagt gtcaatgcag gt 22
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taatacgact cactataggg agagaacccc tactgagcaa caac 44
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctgttgtcg ttgatgtcat a 21
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taatacgact cactataggg agattacact cacaatgtaa tacttg 46
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagcaagtct cagttcagct ag 22
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
taatacgact cactataggg agaggagatg cacgtctggc cttc 44
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaggtataag cataaatcag atcat 25
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
taatacgact cactataggg agattccaca tactgaagta tctgg 45
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcctaacaga cccaattaca ttg 23
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
taatacgact cactataggg agaccatgcc tgagaacagt aagg 44
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gccatgttac caagtcggcc 20
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
taatacgact cactataggg agattcatcc cagtcatcag cctc 44
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcgtgtcagc cataacgccg t 21
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
taatacgact cactataggg agaccaccaa ctaagaacgg ccatgc 46
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccaaagtctt tgggttccg 19
<210> 21
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(24)
<223> 两个碱基之间用biotin连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(46)
<223> 两个碱基之间用biotin连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(68)
<223> 两个碱基之间用biotin连接
<400> 21
agaaggcgtc cgtctttgag gcacccgatg gataggtcgg tgaataagca tcgtgccctt 60
tcgcagacca cgttcgcgtt ctcacatg 88
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> y=t或c
<400> 22
tctcattgcy tgcacctttt ctgtaggaat gaatgt 36
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> y=t或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> r=a或g
<400> 23
atytgcctrg cctgactttt ctgtaggaat gaatgt 36
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> y=t或c
<400> 24
tagcaaccty catggctttt gcctcaaaga cggacgcctt c 41
<210> 25
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)
<223> n=a或t或c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> r=a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> y=t或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)
<223> y=t或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)
<223> r=a或g
<400> 25
ctcnrctgcy tgytcrtttt gcctcaaaga cggacgcctt c 41
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> y=t或c
<400> 26
ctygatccag ccattttttt gcctcaaaga cggacgcctt c 41
<210> 27
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcatagctga gaccattttt tctgtaggaa tgaatgt 37
<210> 28
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ctgcatttct cgtctctttt tctgtaggaa tgaatgt 37
<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
actccgggca ctgaagtttt tgcctcaaag acggacgcct tc 42
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atctcgctgc tctgcttttt tgcctcaaag acggacgcct tc 42
<210> 31
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atgagccctg tgtgaatttt tgcctcaaag acggacgcct tc 42
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tttgttgcct tactattttt tctgtaggaa tgaatgt 37
<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> r=a或g
<400> 33
gacatgatag artaactttt tctgtaggaa tgaatgt 37
<210> 34
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ctgaacattg cttgactttt tgcctcaaag acggacgcct tc 42
<210> 35
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> y=t或c
<400> 35
attaaytttt tctgattttt tgcctcaaag acggacgcct tc 42
<210> 36
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
catttgttat aggcattttt tgcctcaaag acggacgcct tc 42
<210> 37
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aaggatatgt aacctatttt tctgtaggaa tgaatgt 37
<210> 38
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
attgtaaaac ctgatatttt tctgtaggaa tgaatgt 37
<210> 39
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gcacatcctt gagtgatttt gcctcaaaga cggacgcctt c 41
<210> 40
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ttaagtttga tgaatatttt tgcctcaaag acggacgcct tc 42
<210> 41
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cgcatatatt gcatcatttt tgcctcaaag acggacgcct tc 42
<210> 42
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
acaagacaca acctcctttt tctgtaggaa tgaatgt 37
<210> 43
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tggtatagca gtgacttttt tctgtaggaa tgaatgt 37
<210> 44
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gaacagcttt tgcgattttt tgcctcaaag acggacgcct tc 42
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tgattccatc acttagtttt tgcctcaaag acggacgcct tc 42
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gtaaatggtt ttcatatttt tgcctcaaag acggacgcct tc 42
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aactaaggac ggagtttttt ctgtaggaat gaatgt 36
<210> 48
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ctgacacagc catcaatttt ctgtaggaat gaatgt 36
<210> 49
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cagtcgttgg catagctttt gcctcaaaga cggacgcctt c 41
<210> 50
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taataatccc ggcccttttt gcctcaaaga cggacgcctt c 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcattaacc ttattttttt gcctcaaaga cggacgcctt c 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acagtactgg aaatattttt ctgtaggaat gaatgt 36
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gggagttttg gctggctttt ctgtaggaat gaatgt 36
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caagcatcac aactgatttt gcctcaaaga cggacgcctt c 41
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atgcagtggt tgactttttt gcctcaaaga cggacgcctt c 41
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gcaggacaga aacacttttt gcctcaaaga cggacgcctt c 41
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acatacatac gtacag 16
Claims (2)
1.一种基于RNA恒温扩增-多生物素信号放大技术联合检测七项呼吸道病原体核酸的试剂盒，所述七项呼吸道病原体为甲型流感病毒的H1N1/H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒的1/2/3型、腺病毒的B/E属、肺炎支原体、肺炎衣原体，其特征在于，所述试剂盒包括：
1）扩增反应液：含40 mM pH 8.0 Tris-HCl，12 mM MgCl2，70 mM KCl，15% DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1 mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2 µM，其中扩增引物包括十对：甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体和人内参基因，具体的：
（1）甲型流感病毒H1N1/H3N2型的扩增引物：
FluA-R引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCAGCACTACAGCTAAGGC；
FluA-F引物： ACTTGAATCGTTGCATCTGC；
（2）乙型流感病毒的扩增引物：
FluB-R引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACTGTTGGTTCGGTGG；
FluB-F引物： ACGTCTTCTCCTTTTCCCA；
（3）呼吸道合胞病毒的扩增引物：
RSV-R引物： TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGGTGTATCTATYACACC；
所述简并碱基Y代表T/C；
RSV-F引物： AGAATTCAGTGTCAATGCAGGT；
（4）副流感病毒1型的扩增引物：
PIV1-R引物： TAATACGACTCACTATAGGGAGAGAACCCCTACTGAGCAACAAC；
PIV1-F引物： CCTGTTGTCGTTGATGTCATA；
（5）副流感病毒2型的扩增引物：
PIV2-R引物： TAATACGACTCACTATAGGGAGATTACACTCACAATGTAATACTTG；
PIV2-F引物： AAGCAAGTCTCAGTTCAGCTAG；
（6）副流感病毒3型的扩增引物：
PIV3-R引物： TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGATGCACGTCTGGCCTTC；
PIV3-F引物： GAGGTATAAGCATAAATCAGATCAT；
（7）腺病毒B/E属的扩增引物：
ADV-R引物： TAATACGACTCACTATAGGGAGATTCCACATACTGAAGTATCTGG；
ADV-F引物： GCCTAACAGACCCAATTACATTG；
（8）肺炎支原体的扩增引物：
MP-R引物： TAATACGACTCACTATAGGGAGACCATGCCTGAGAACAGTAAGG；
MP-F引物： GCCATGTTACCAAGTCGGCC；
（9）肺炎衣原体的扩增引物：
CP-R引物： TAATACGACTCACTATAGGGAGATTCATCCCAGTCATCAGCCTC；
CP-F引物： GCGTGTCAGCCATAACGCCGT；
（10）内参基因的扩增引物：
内参-R引物：TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCAACTAAGAACGGCCATGC；
内参-F引物： CCAAAGTCTTTGGGTTCCG；
2）扩增酶：包含三种，逆转录酶AMV或M-MLV、T7 RNA聚合酶和RnaseH；
3）细胞裂解液：购至美国Signosis公司，货号CL-0001，可以裂解细胞，释放核酸；
4）放大探针：一种标有生物素的核酸序列，该探针可以和特异探针的LES系列的一端结合，具体序列为: AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA-Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG-biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG；
5）特异探针：每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：
（1）甲型流感病毒H1N1/H3N2型特异探针FluA-CES1：TCTCATTGCYTGCACCTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
FluA-CES2：ATYTGCCTRGCCTGACTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
FluA-LES1：TAGCAACCTYCATGGCTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
FluA-LES2：CTCNRCTGCYTGYTCRTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
FluA-LES3：CTYGATCCAGCCATTTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
（2）乙型流感病毒特异探针FluB-CES1 :TCATAGCTGAGACCATTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
FluB-CES2:CTGCATTTCTCGTCTCTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
FluB-LES1:ACTCCGGGCACTGAAGTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
FluB-LES2:ATCTCGCTGCTCTGCTTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
FluB-LES3:ATGAGCCCTGTGTGAATTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
（3）呼吸道合胞病毒特异探针RSV-CES1：TTTGTTGCCTTACTATTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
RSV-CES2：GACATGATAGARTAACTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
RSV-LES1：CTGAACATTGCTTGACTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
RSV-LES2：ATTAAYTTTTTCTGATTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
RSV-LES3：CATTTGTTATAGGCATTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
（4）1型、2型、3型副流感病毒特异探针PIV1-CES1：AAGGATATGTAACCTATTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
PIV1-CES2：ATTGTAAAACCTGATATTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
PIV1-LES1：GCACATCCTTGAGTGATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV1-LES2：TTAAGTTTGATGAATATTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV1-LES3：CGCATATATTGCATCATTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV2-CES1：ACAAGACACAACCTCCTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
PIV2-CES2：TGGTATAGCAGTGACTTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
PIV2-LES1：GAACAGCTTTTGCGATTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV2-LES2：TGATTCCATCACTTAGTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV2-LES3：GTAAATGGTTTTCATATTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV3-CES1：AACTAAGGACGGAGTTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
PIV3-CES2：CTGACACAGCCATCAATTTTCTGTAGGAATGAATGT；
PIV3-LES1：CAGTCGTTGGCATAGCTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV3-LES2：TAATAATCCCGGCCCTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
PIV3-LES3：GGCATTAACCTTATTTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
（5）腺病毒B/E属特异探针AdV-CES1：ACAGTACTGGAAATATTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
AdV-CES2：GGGAGTTTTGGCTGGCTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
AdV-LES1：CAAGCATCACAACTGATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
AdV-LES2：ATGCAGTGGTTGACTTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
AdV-LES3：GCAGGACAGAAACACTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
（6）肺炎支原体特异探针MP-CES1：ACACCGCGCCTTTGAGTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
MP-CES2：TATAGGTGTCTTTAGGTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
MP-LES1：GTGCGCTATAATGCAATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
MP-LES2：CTGGTACCAGTGCTACTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
MP-LES3：TGTAACTGGTTGACCATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
（7）肺炎衣原体探针Cpn-CES1：CGGGCCTTGTACACACTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
Cpn-CES2：CGCCCGTCACATCATGTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
Cpn-LES1：GGAGTTGGTTTTACCTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
Cpn-LES2：TAAGTCGTTGACTCAATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
Cpn-LES3：CCTATTTATAGGAGAGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
（8）内质控特异探针18SrRNA-CES1：AGTGGAGCCTGCGGCTTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
18SrRNA-CES2：TAATTTGACTCAACACTTTTCTGTAGGAATGAATGT；
18SrRNA-LES1：GGGAAACCTCACCCGGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
18SrRNA-LES2：CCCGGACACGGACAGGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
18SrRNA-LES3：ATTGACAGATTGATAGTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTC；
6）微孔板：每个微孔中包被包被探针，该包被探针可以和每个指标的CES系列探针一端序列互补配对结合，所述包被探针具体序列为：ACATTCATTCCTACAG；
7）HRP-链霉亲和素酶联物：标记有链霉亲和素的HRP酶联物，该酶联物可以和放大探针上生物素结合；
8）配制杂交液、5×洗液A、5×洗液B、封闭液、底物稀释液，杂交液：含0.1% SDS的5×SSC；5×洗液A：含0.5% SDS的5×SSC；5×洗液B：含0.5% SDS的5×PBS；封闭液：含0.5%BSA、1 × PBS；底物稀释液：50mM pH 8.5 Tris-HCl；
9）底物：购至Thermo Fisher，货号37075的鲁米诺化学发光底物，遇到HRP酶催化后能够产生化学发光信号，被仪器检测到。
2.权利要求1所述的试剂盒在制备七项呼吸道病原体检测试剂中的应用，其特征在于，所述七项呼吸道病原体为甲型流感病毒的H1N1/H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒的1/2/3型、腺病毒的B/E属、肺炎支原体、肺炎衣原体。
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