CN112126713A

CN112126713A - 一种冠状病毒和流感病毒联合检测产品及其用途

Info

Publication number: CN112126713A
Application number: CN202010688088.6A
Authority: CN
Inventors: 李强; 张阳明; 雷永兴; 史艳梅; 王占坤; 张捷; 邵俊斌
Original assignee: Shanghai ZJ Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Shanghai ZJ Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2020-12-25

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种冠状病毒和流感病毒联合检测产品及其用途，所述冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测物质包括特异性识别冠状病毒核酸的引物和探针以及特异性识别流感病毒核酸的引物和探针。本发明的冠状病毒和流感病毒联合检测产品临床样本类型全面覆盖：包括鼻咽拭子、口咽拭子、唾液、痰液、粪便和血液样本；一次性联合检测冠状病毒和流感病毒：防止除新冠和甲乙流之外的其他类型冠状病毒和流感病毒造成的漏检或突变造成的漏检；单次多重联检的操作方式也会极大减少患者的就医时间和就医等待过程中的暴露风险。

Description

一种冠状病毒和流感病毒联合检测产品及其用途

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种冠状病毒和流感病毒联合检测产品及其用途。

背景技术

冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，不同型别病毒的致病力不同，引起的临床表现也不尽相同，OC43株引起的症状一般比 229E病毒严重。冠状病毒是成人普通感冒的主要病原之一，感染的潜伏期一般为2-5天。典型的冠状病毒感染呈流涕、不适等感冒症状，也可以出现发热、寒战、呕吐等症状。代表性变种主要为非典型肺炎的病原体(SARS)和新型冠状病毒(nCoV-2019)。

流行性感冒病毒(influenza virus)是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表种，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。

临床检验中常由于两者感染症状相似，造成误判和不必要的恐慌。因此，明确的鉴别区分两者意义重大，目前临床中最常使用的方法有两种：一是对疑似患者，首先检测是否为甲/ 乙型流感病毒(或新型冠状病毒)感染，若不是甲/乙型流感病毒感染，则继续筛查其他项目，如新型冠状病毒(或流感病毒)检测，这种方法耗时耗力，不但增加了患者的就医时间，而且很容易产生其他流感病毒和冠状病毒漏检的风险，比如患者发生了其他冠状病毒感染，或已选的检测基因位点发生了新型冠状病毒的突变；二是对疑似患者，一次性检测现有的甲/乙型流感病毒、新型冠状病毒等项目来筛查病原体，但这种方法对患者来说检测成本过高，且漏检的问题依旧没有解决。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种冠状病毒和流感病毒联合检测产品及其用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种冠状病毒和流感病毒荧光 PCR检测物质，所述检测物质包括特异性识别冠状病毒核酸的引物和探针以及特异性识别流感病毒核酸的引物和探针。

第二方面提供所述冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测物质在制备冠状病毒和流感病毒检测产品中的用途。

第三方面提供一种冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR检测混合物，所述PCR检测混合物中包括所述的冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测物质。

如上所述，本发明的冠状病毒和流感病毒联合检测产品及其用途，具有以下有益效果：

1)临床样本类型全面覆盖：包括鼻咽拭子、口咽拭子、唾液、痰液、粪便和血液样本；

2)一次性联合检测冠状病毒和流感病毒：防止除新冠和甲乙流之外的其他类型冠状病毒和流感病毒造成的漏检或突变造成的漏检；

3)单次多重联检的操作方式也会极大减少患者的就医时间和就医等待过程中的暴露风险；

4)具有实时检测、定性分析和检测通量高等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等优点。

附图说明

图1显示为本发明的RNA核酸提取试剂预装板示意图。

图2显示为本发明的生理盐水稀释样本RNA核酸提取效果比较的PCR扩增图。

图3显示为本发明的阴性鼻咽拭子洗液稀释样本RNA核酸提取效果比较的PCR扩增图。

图4显示为本发明的冠状病毒和流感病毒联合检测试剂盒的灵敏度分析结果图。

图5显示为本发明的冠状病毒和流感病毒联合检测试剂盒的特异性分析结果图。

具体实施方式

本发明第一方面提供冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测物质，所述检测物质包括特异性识别冠状病毒核酸的引物和探针以及特异性识别流感病毒核酸的引物和探针。

在一种实施方式中，所述特异性识别冠状病毒核酸的引物包括如SEQ ID NO：1所示的第一上游引物和如SEQ ID NO：3所示的第一下游引物。

在一种实施方式中，所述特异性识别冠状病毒核酸的探针选自如SEQ ID NO：5所示的第一探针。

在一种实施方式中，所述特异性识别流感病毒核酸的引物包括如SEQ ID NO：2所示的第二上游引物和如SEQ ID NO：4所示的第二下游引物。

在一种实施方式中，所述特异性识别流感病毒核酸的探针选自如SEQ ID NO：6所示的第二探针。

具体的，

第一上游引物：5’-GGAGTTGTTAATCCAGTAATG-3’(SEQ ID NO：1)；

第一下游引物：5’-GCAAGAATACCACGAAAG-3’(SEQ ID NO：3)；

第二上游引物：5’-CAGGGTAGATAATCACTCA-3’(SEQ ID NO：2)

第二下游引物：5’-GATGCTCTGATTTCAGTG-3’(SEQ ID NO：4)

第一探针：5’-ATGATGAACCGACGACGACTACT-3’(SEQ ID NO：5)；

第二探针：5’-TTCTCCATCAGTCTCCATCTGTTCG-3’(SEQ ID NO：6)

所述第一探针、第二探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有标记荧光淬灭基团。

较佳的，所述第一探针、第二探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有标记荧光淬灭基团。

具体的，所述第一探针和第二探针5’端标记的荧光报告基团不相同且荧光波长不相同。优选情况下，两种荧光报告基团的荧光波长相差较大、信号强度相近，保证了检测结果的准确性，避免了信号之间的相互干扰。

具体的，所述荧光报告基团选自以下中的一种：FAM、HEX、VIC、CY3、ROX、610、TEXAS RED、CY5。

所述荧光淬灭基团选自以下中的一种：BHQ1、Dabcyl、QYS-7、BHQ2。

具体的，所述流感病毒包括甲型或乙型流感病毒。

本发明第二方面提供所述的冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测物质在制备冠状病毒和流感病毒检测产品中的用途。

所述冠状病毒和流感病毒检测产品以鼻咽拭子、口咽拭子、唾液、痰液、粪便或血液中的一种或几种作为检测样本来源。所述冠状病毒和流感病毒检测产品的临床样本类型全面覆盖，不受样本种类的限制。

所述冠状病毒检测产品用于冠状病毒的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。

本发明第三方面提供冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR 检测混合物，所述PCR检测混合物中含有前述的冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测物质。

在一种实施方式中，PCR检测混合物中所述引物和探针的浓度均为20μmol/L。

较佳的，所述试剂盒中还包括内标以及特异性识别内标的试剂和内标探针。所述特异性识别内标的试剂包括特异性扩增内标的引物，所述特异性扩增内标的引物包括内标上游引物和内标下游引物。

进一步的，所述内标探针、内标上游引物和内标下游引物混合于PCR检测混合物中。在在一种实施方式中，PCR检测混合物中内标探针、内标上游引物和内标下游引物浓度分别为： 20μmol/L

在一较佳实施例中，内标上游引物的核苷酸序列为5’-CCCGGTTTCTATAAATTGAGC -3’(SEQ ID NO：7)。

在一较佳实施例中，内标下游引物的核苷酸序列为5’-GCGACGCAAAAGAAGATG-3’(SEQ ID NO：8)。

在一较佳实施例中，内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，具体的，5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGACA-3’(SEQ ID NO：9)。所述内标探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有标记荧光淬灭基团。较佳的，所述第一探针或第二探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有标记荧光淬灭基团。较佳的，内标探针标记的荧光报告基团为ROX荧光基团；所述荧光淬灭基团为BHQ1。

较佳的，所述检测混合物中还包括PCR MIX和H₂O。

在一种实施方式中，所述PCR MIX为市售产品。例如可以为Life Technologies公司生产的产品，名称为AGPATH-ID ONE-STEP RT-PCR，货号为4387291。在一种实施方式中，所述PCR MIX和H₂O的使用量为：PCR MIX 15μl/test；H₂O 6μL/test。

在一种实施方式中，检测的PCR检测混合物的总体积为25μL，所述PCR检测混合物中各物质的体积如下：

所述PCR检测混合物各组分可以按比例扩大，不影响实验效果。

较佳的，所述试剂盒中还包括以下中的一种或几种：PCR酶、阴性质控品、阳性质控品和内标。

在一种实施方式中，所述PCR酶包括Taq酶和逆转录酶。

在一种实施方式中，阴性质控品选自RNase-free H₂O。所述RNase-free H₂O可以为DEPC-H₂O。

较佳的，内标由内标质粒制备而来。

较佳的，阳性质控品由Coronavirus和influenza virus质粒或假病毒制备而来。

在一种实施方式中，所述Coronavirus和influenza virus质粒或假病毒分别为含有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11序列所示目标片段的质粒或假病毒。所述内标质粒为含有SEQ ID NO:12序列所示目标片段的质粒。

在一种实施方式中，所述试剂盒中配制50μL的反应体系时，取PCR检测混合物30μL，与0.5μL的PCR酶混合，混合后取30μL与20μL待测品再混合，即获得50μL的PCR反应体系。

较佳的，所述0.5μL的PCR酶由0.34μL Taq酶5U/μL，以及0.16μL逆转录酶混合制成。

具体的，所述待测品为样本的RNA模板溶液、阴性质控品、阳性质控品。

本申请的PCR反应阈值设定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性质控品检测荧光曲线的最高点。

本发明PCR检测结果的质量控制：阴性质控品检测结果为：FAM通道Ct栏显示Undetermined(ABI7500)或NoCt(MIC QPCR)，VIC/HEX通道Ct值Undetermined(ABI7500) 或NoCt(MIC QPCR)，TEXAS RED通道Ct值小于36。试验结果的判断标准如下：

表1检测结果的解释

较佳的，所述试剂盒还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂为本申请自带的磁珠法核酸提取试剂。

所述磁珠法核酸提取试剂包括裂解液，所述裂解液至少含有以下组分，其中，以裂解液的总量为基准计，各组分的含量为：

溶剂为水。

具体的，以裂解液的总量为基准计，所述裂解液中，

尿素的含量可以为1-3mol/L，1-1.5mol/L，1.5-2mol/L，2-2.5mol/L，2.5-3mol/L。

十二烷基硫酸钠的含量可以为0.05-0.1％(w/v)，0.05-0.06％(w/v)，0.06-0.07％(w/v)， 0.07-0.08％(w/v)，0.08-0.09％(w/v)，0.09-0.1％(w/v)。

NP40的含量可以为1-5％(w/v)，1-2％(w/v)，2-3％(w/v)，3-4％(w/v)，4-5％(w/v)。

Tris-HCl的含量可以为10-80mmol/L，10-20mmol/L，20-30mmol/L，30-40mmol/L，40-50mmol/L，50-60mmol/L，60-70mmol/L，70-80mmol/L。

EDTA的含量可以为5-15mmol/L，5-8mmol/L，8-10mmol/L，10-12mmol/L，12-15mmol/L。

所述DTT为二硫苏糖醇，DTT的体积百分比可以为0.1-0.5％，0.1-0.2％，0.2-0.3％， 0.3-0.4％，0.4-0.5％。

其中，NP40为乙基苯基聚乙二醇。

所述溶剂可为工艺用水。

在一种实施方式中，所述裂解液至少含有以下组分，其中，以裂解液的总量为基准计，各组分的含量为：

溶剂为水。

所述裂解液可用于提取的冠状病毒的核酸来源于鼻咽拭子、口咽拭子、唾液、痰液、粪便和血液样本。

所述裂解液的pH值为8.5±0.1。

磁珠法冠状病毒核酸提取用物质还包括磁珠、洗涤液、洗脱液、RNA助沉剂和蛋白酶K 中的一项或多项。

所述RNA助剂和蛋白酶K为市售产品，例如可以为：RNA助沉剂(Glycogen,20mgml)，蛋白酶K，天根生化科技(北京)有限公司，货号RT403。

在一种实施方式中，所述磁珠使用浓度为20-100mg/mL。

所述磁珠型号可为奥润SM1-050。

所述第一洗涤液用于洗涤掉样本中蛋白类的杂质。在一种实施方式中，在一种实施方式中，所述洗涤液包括第一洗涤液，所述第一洗涤液中至少含有以下组分，至少含有以下组分，其中，以第一洗涤液的总量为基准计，各组分的含量为：尿素：0.5-2mol/L，曲拉通X-100： 0.5-1％(w/v)，用NaOH溶液调pH至8.0，溶剂为水。

所述第二洗涤液用于洗涤掉盐类杂质。在一种实施方式中，所述洗涤液还包括第二洗涤液，所述第二洗涤液至少含有以下组分，其中，以第二洗涤液的总量为基准计，各组分的含量为：无水乙醇：体积百分比为75％，溶剂为水。

所述洗脱液用于洗脱核酸。所述洗脱液也可以采用市售产品。在一种实施方式中，所述洗脱液至少含有以下组分，其中，以洗脱液的总量为基准计，各组分的含量为：Tris-HCL 10-80mmol/L，用HCL溶液调pH至8.0，溶剂为水。

所述第一洗涤液的pH为8.0±0.1。

所述洗脱液的pH为8.0±0.1。

使用时，裂解液与磁珠的体积比为(300-600)μL：10μL；。

所述裂解液与磁珠可混合后预装在96孔板中。所述96孔板选自96深孔板。

在一种实施方式中，如图1所示，所述裂解液与磁珠预装在96深孔板的A行，体积控制在500μL±50μL。

所述第一洗涤液、第二洗涤液、洗脱液可分别预装在96孔板中。

在一种实施方式中，第一洗涤液预装在96深孔板的B，C行，体积控制在600μL±50μL。

在一种实施方式中，第二洗涤液预装在96深孔板的D，E行，体积控制在500μL±50μL。

在一种实施方式中，所述洗脱液预装在96深孔板的H行，体积控制在50μL～100μL。

所述试剂盒还包括一种病毒灭活剂，所述病毒灭活剂可以为市售的含氯消毒剂、过氧乙酸或氯仿等脂溶剂。

所述病毒灭活剂能灭活冠状病毒和流感病毒。

所述冠状病毒和流感病毒采集自冠状病毒或流感病毒感染或疑似感染的患者。

所述样本类型选自鼻咽拭子、口咽拭子、唾液、痰液、粪便和血液中的一种或几种。

所述试剂盒若配合冠状病毒标准品，还可以实现定量检测。

本发明第四方面提供所述试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤：

1)样本灭活；

2)提取待测样本的RNA，得到RNA模板溶液；

3)加样，制备反应体系；

4)PCR检测。

本发明的试剂盒针对冠状病毒核酸的定性检测，采用的是Taqman荧光定量PCR原理，针对冠状病毒基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示)和流感病毒基因(SEQ ID NO：11所示)设计特异性引物，扩增特异性核酸序列，同时设计Taqman探针，并标记不同的荧光报告基团，位于上下游引物之间。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1鼻咽拭子、口咽拭子、唾液、痰液、粪便和血液样本Coronavirus和influenza virus联合检测试剂盒引物探针的设计和合成

在Coronavirus和influenza virus探针的5’分别标记FAM和VIC荧光基团，内标探针的5’ 标记ROX荧光基团。合成针对Coronavirus(核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示)和influenza virus(核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示)和内标(核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示) 的PCR检测的引物、探针。

第一上游引物：5’-GGAGTTGTTAATCCAGTAATG-3’(SEQ ID NO：1)；

第一上游引物：5’-CAGGGTAGATAATCACTCA-3’(SEQ ID NO：2)

第二下游引物：5’-GCAAGAATACCACGAAAG-3’(SEQ ID NO：3)；

第二下游引物：5’-GATGCTCTGATTTCAGTG-3’(SEQ ID NO：4)

第一探针：5’-荧光报告基团-ATGATGAACCGACGACGACTACT-荧光淬灭基团-3’ (SEQID NO：5)；

第二探针：5’-荧光报告基团-TTCTCCATCAGTCTCCATCTGTTCG-荧光淬灭基团-3’(SEQ ID NO：6)

内标：

上游引物:5’-CCCGGTTTCTATAAATTGAGC-3’(SEQ ID NO：7)

下游引物:5’-GCGACGCAAAAGAAGATG-3’(SEQ ID NO：8)

探针:5’-荧光报告基团-CTCTGCTCCTCCTGTTCGACA-荧光淬灭基团-3’(SEQ ID NO：9)

实施例2本发明与其它商品化提取试剂盒提取效果比较

1.实验方法

1.1检测对象

构建高浓度Coronavirus和influenza virus模拟阳性样本，模拟阳性样本由相应病毒的基因组序列(核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示)合成产物和正常人脱落细胞的背景基质组成，取一高浓度Coronavirus和influenza virus模拟阳性样本，分别使用 Coronavirus和influenza virus阴性鼻咽拭子洗液样本和生理盐水稀释三个梯度。Coronavirus 和influenza virus阳性鼻咽拭子洗液样本稀释的三个浓度样本分别定义为XL-1，XL-2，XL-3，生理盐水稀释的三个浓度样本分别定义XN1，XN2，XN3。

1.2样本的灭活

取以上样本分别加入1.5mL或等倍体积量的病毒灭活剂，所述病毒灭活剂包括Chelex： 0.1％(w/v)，NP40：5％(w/v)，Tris-HCL：40mmol/L，pH8.5±0.1，振荡混匀后，室温静置30min。

1.3样本核酸提取

使用本发明自带核酸RNA提取试剂和市场上其它公司RNA提取试剂(Qiagen，货号52904)进行样本提取，每个提取做两个重复。其它公司提取试剂按照其说明书进行操作。提取试剂各组分已预装在96深孔版，深孔板各栏所含组分和体积见附图1，每个样本提取两个复孔。提取试剂组分如下：

以裂解液的总量为基准计，各组分的含量为：

溶剂为水。

以第一洗涤液的总量为基准计，各组分的含量为：尿素：0.5-2mol/L，曲拉通X-100： 0.5-1％(w/v)，用NaOH溶液调pH至8.0，溶剂为水。

以第二洗涤液的总量为基准计，各组分的含量为：无水乙醇：体积百分比为75％，溶剂为水。

以洗脱液的总量为基准计，各组分的含量为：Tris-HCL 10-80mmol/L，用HCL溶液调pH 至8.0，溶剂为水。

每个样本提取两个复孔。在预装板A行中先加入1μL内标，再在各孔中依次加入XL-1， XL-2，XL-3，XN1，XN2，XN3、阴性质控品和阳性质控品。深孔板放入上海之江生物医药科技有限公司的全自动核酸提取仪(型号：EX3600)，运行程序“RNA Isolation”，程序运行完成之后，用移液枪取出H行的RNA模板溶液备用。

1.4样本检测

配置PCR反应液时，取Coronavirus和influenza virus PCR检测混合液30μL，与0.5μL的 PCR酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒，取30μL置于PCR管中，然后将20μL的样本、阴性质控品或阳性质控品的RNA模板溶液加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。

循环参数设置为：50℃10min；95℃2min；95℃×15sec和60℃×60sec交替循环45次。单点荧光检测在60℃，反应体系为50μL。

荧光通道的选择如下表1。

表2荧光通道的选择

机型	通道	通道	通道
				ABI7500	FAM	VIC	ROX
MIC QPCR	通道1	通道2	通道3

注：如使用ABI Prism7500实时荧光PCR仪，则需要将passive reference和quencher 处均选择“none”。

2.实验结果

生理盐水稀释的鼻咽拭子洗液样本扩增曲线见附图2，Coronavirus和influenzavirus阴性鼻咽拭子洗液稀释的鼻咽拭子样本扩增曲线见附图2，检测结果Ct值统计见下表：

表3提取试剂比较检测结果

附图2中，浅色代表本发明自带提取试剂，深色表示其它公司提取试剂，结合表3的Ct 值数据，表明两家公司对于生理盐水稀释的样本提取效率无明显差异。

附图2中，结合表3的Ct值数据，表明本发明自带提取试剂提取鼻咽拭子洗液稀释的样本，效率要明显高于其它公司的提取试剂，Ct值提前约1～2个Ct。

以上结果说明，对于生理盐水稀释的样本，两种提取试剂提取效率并无明显差异，但是对于鼻咽拭子洗液稀释的样本，本发明提取试剂的提取效果明显优于其它商品化提取试剂。说明鼻咽拭子洗液样本中的确存在PCR抑制物，但本发明RNA核酸提取试剂能够很好地去除该抑制物，得到的RNA模板样本获得更优的PCR扩增效果。

实施例3唾液、痰液中Coronavirus和influenza virus联合检测试剂盒的应用

1.实验方法

1.1检测对象

对4例临床获得的唾液、痰液进行Coronavirus和influenza virus核酸的检测，该4例样本在医院已经培养法鉴定为Coronavirus和influenza virus阳性样本3份，Coronavirus和 influenza virus阴性样本1份，依次编号为S1，S2，S3和S4。

1.2样本灭活与核酸提取

取以上样本分别加入1.5mL的病毒灭活剂，振荡混匀后，室温静置30min。

使用本发明自带提取试剂进行4例唾液、痰液样本的提取(同实施例2中1.3)。在预装板A行中先加入1μL内标，再在各孔中依次加入S1，S2，S3，S4、阴性质控品和阳性质控品。96深孔板放入全自动核酸提取仪，运行程序“RNA Isolation”，程序运行完成之后，用移液枪取出H行的RNA模板溶液备用。

1.3样本检测

配置PCR反应液时，取Coronavirus和influenza virus PCR检测混合液30μL，与0.5μL的 PCR酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒，取前述混合液30μL置于PCR管中，然后将20μL样本、阴性质控品或阳性质控品的核酸提取产物加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。

荧光通道的选择见表2。

2.实验结果2

检测结果的Ct值见表4。由表4数据可知，样本S1，S2和S3的检测结果均为Coronavirus 和influenza virus阳性，样本S4为Coronavirus和influenza virus阴性。检测结果与临床提供的培养法检测结果一致，可见本发明试剂盒具有较好的特异性。

表4试剂盒样本定性检测结果

实施例4唾液、痰液中Coronavirus和influenza virus联合检测试剂盒性能评估

1.实验方法

1.1检测对象

(1)灵敏度分析

取Coronavirus和influenza virus模拟阳性样本1份(组成见实施例2)，用样本稀释液10 倍稀释成5个梯度，依次编号为S1，S2，S3，S4和S5，外加阴性质控品和阳性质控品后，按照实施例2的方法提取核酸并进行检测。

检测方法如下：取Coronavirus和influenza virus PCR检测混合物30μL，与0.5μL的PCR 酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒，取前述混合好的试剂30μL置于PCR管中，然后将20μL样本、阴性质控品或阳性质控品的核酸提取产物加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。

(2)特异性分析

根据“2019-nCov核酸检测试剂国家参考品”、“第二代甲型流感病毒核酸检测试剂国家参考品”以及“第二代乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品”的说明，设置副流感病毒、肺炎克雷伯菌、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒企业参考品和阴性模拟拭子样本为特异性分析时的非目标检测项。按照实施例2的方法提取核酸后进行检测。

检测方法如下：取Coronavirus和influenza virus PCR检测混合物30μL，与0.5μL的PCR 酶混合，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒，取前述混合好的液体30μL置于PCR管中，然后将20μL副流感病毒、肺炎克雷伯菌、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒企业参考品和阴性模拟拭子样本的核酸提取产物加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。

2.实验结果

2.1灵敏度分析：如图4所示，S1，S2，S3，S4和S5检测结果线性范围良好，将S5两倍稀释4个梯度，显示Coronavirus和influenza virus的最低检出限均为500copies/mL。

2.2特异性分析：如图5所示，副流感病毒、肺炎克雷伯菌、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒企业参考品和阴性模拟拭子样本的结果均为阴性，阳参正常出峰，显示该试剂特异性良好。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海之江生物科技股份有限公司

<120> 一种冠状病毒和流感病毒联合检测产品及其用途

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggagttgtta atccagtaat g 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcaagaatac cacgaaag 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagggtagat aatcactca 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatgctctga tttcagtg 18

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgatgaacc gacgacgact act 23

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttctccatca gtctccatct gttcg 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccggtttct ataaattgag c 21

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgacgcaaa agaagatg 18

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctctgctcct cctgttcgac a 21

<210> 10

<211> 395

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgtccaaat tcacacaatc gacggttcat ccggagttgt taatccagta atggaaccaa 60

tttatgatga accgacgacg actactagcg tgcctttgta agcacaagct gatgagtacg 120

aacttatgta ctcattcgtt tcggaagaga caggtacgtt aatagttaat agcgtacttc 180

tttttcttgc tttcgtggta ttcttgctag ttacactagc catccttact gcgcttcgat 240

tgtgtgcgta ctgctgcaat attgttaacg tgagtcttgt aaaaccttct ttttacgttt 300

actctcgtgt taaaaatctg aattcttcta gagttcctga tcttctggtc taaacgaact 360

aaatattata ttagtttttc tgtttggaac tttaa 395

<210> 11

<211> 254

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agcaaaagca gggtagataa tcactcactg agtgacatca aaatcatggc gtcccaaggc 60

accaaacggt cttacgaaca gatggagact gatggagaac gccagaatgc cactgaaatc 120

agagcatccg tcggaaaaat gattggtgga attggacgat tctacatcca aatgtgcaca 180

gaacttaaac tcagtgatta tgagggacgg ttgatccaaa acagcttaac aatagagaga 240

atggtgctct ctgc 254

<210> 12

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggctgagcc tggcgggagg cggggtccga gtcaccgcct gccgccgcgc ccccggtttc 60

tataaattga gcccgcagcc tcccgcttcg ctctctgctc ctcctgttcg acagtcagcc 120

gcatcttctt ttgcgtcgcc aggtgaagac gggcggagag aaacccggga ggctagggac 180

ggcctgaagg cggcaggggc gggcgcaggc 210

Claims

1.一种冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测物质，其特征在于，所述检测物质包括特异性识别冠状病毒核酸的引物和探针以及特异性识别流感病毒核酸的引物和探针。

2.根据权利要求1所述的冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测物质，其特征在于，冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测物质还包括以下特征中的一项或几项：

1)所述特异性识别冠状病毒核酸的引物包括如SEQ ID NO：1所示的第一上游引物和如SEQ ID NO：3所示的第一下游引物；

2)所述特异性识别冠状病毒核酸的探针选自如SEQ ID NO：5所示的第一探针；

3)所述特异性识别流感病毒核酸的引物包括如SEQ ID NO：2所示的第二上游引物和如SEQ ID NO：4所示的第二下游引物；

4)所述特异性识别流感病毒核酸的探针选自如SEQ ID NO：6所示的第二探针。

3.根据权利要求2所述的冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测物质，其特征在于，所述第一探针和第二探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有标记荧光淬灭基团，。

4.权利要求1-3任一所述冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测物质在制备冠状病毒和流感病毒检测产品中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1)所述冠状病毒和流感病毒检测产品以鼻咽拭子、口咽拭子、唾液、痰液、粪便或血液中的一种或几种作为检测样本来源；

2)所述冠状病毒和流感病毒检测产品用于冠状病毒和流感病毒的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。

6.一种冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR检测混合物，所述PCR检测混合物中包括权利要求1-3任一所述的冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测物质。

7.如权利要求6所述的冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1)所述PCR检测混合物中，各引物和探针的浓度均为20μmol/L；

2)所述冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测试剂盒中还包括内标以及特异性识别内标的试剂和内标探针；

3)所述冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测试剂盒中还包括以下中的一种或几种：PCR酶、阴性质控品、阳性质控品和内标。

8.如权利要求7所述的冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

a)特征2)中所述特异性识别内标的试剂包括特异性扩增内标的引物，所述特异性扩增内标的引物包括内标上游引物和内标下游引物；所述内标探针、内标上游引物和内标下游引物混合于PCR检测混合物中，内标上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，内标下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

b)特征3)中，内标由内标质粒制备获得；

c)阴性质控品选自RNase-free H₂O；

d)阳性质控品由冠状病毒质粒制备获得。

9.如权利要求6所述的冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测试剂盒还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂为磁珠法核酸提取试剂。

10.如权利要求9所述的冠状病毒和流感病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述磁珠法核酸提取试剂包括裂解液、磁珠、洗涤液、洗脱液、RNA助沉剂和蛋白酶K中的一项或多项。