CN111004867A - 一种甲型流感病毒检测引物、探针及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测甲型流感病毒的试剂盒及其应用。本发明所的试剂盒中含有用于检测流感病毒的引物组和探针，包括3条引物和1条探针，为针对甲型流感病毒NP靶标基因设计的引物、探针组合。本发明的引物和探针适用于NASBA法检测甲型流感病毒，支持高通量、快速、准确地检测流感病毒感染，能够在1小时内获得较为实时荧光定量PCR方法更为准确的检测结果，对于临床应用具有重要意义。

Description

一种甲型流感病毒检测引物、探针及其试剂盒

技术领域

本发明属于核酸扩增技术领域，涉及一种用于检测流感病毒的试剂盒及其应用。

背景技术

流行性感冒(简称流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，其特点是传染性强、传播速度快。流感是由流行性感冒病毒引起的疾病，因此，可以通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是其高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。本病具有自限性，但在婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者容易并发肺炎等严重并发症而导致死亡。一般秋冬季节是其高发期，且非常容易发生大范围流行。例如1918～1919年的世界流感大流行中，全球预估至少2000万～4000万人死于流感。

流行性感冒病毒简称流感病毒，主要分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，近年来新发现的牛流感病毒被归类为丁(D)型。流感病毒可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病，是人流感、禽流感、猪流感、马流感等人与动物疫病的病原。

人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的；丙型流感病毒虽然也能感染人类，但其抗原稳定，致病力较弱，主要侵犯幼儿和免疫力低下的人群。甲型流感病毒是最为常见的流感病毒，其亚型被称为禽流感。甲型流感病毒最容易发生抗原变异，这种变异被称为“飘变”(drift)，形象地说，“飘变”就是病毒通过细小的变化伪装自己，从而达到躲避人体免疫系统识别的目的。流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。甲型流感病毒可以进一步分为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等亚型(其中的H和N分别代表流感病毒两种表面糖蛋白)。甲型流感对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。乙型流感病毒的抗原变异较小，通常只引起流感的局部爆发。因此，在流感高发季节，甲型流感病毒的检测排查尤为重要。

早期快速诊断流感感染能够及时指导临床治疗，为合理选择抗病毒抗细菌药物提供依据；尤其是甲型流感病毒的检测，对流感疫情监测、防止新亚型出现、预防流感大流行具有重要意义。而甲型流感病毒又分为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等亚型。因此，发明一种能够同时快速准确检测大部分甲型流感病毒的方法和试剂盒显得尤为迫切。

目前检测常见流感病毒的方法较多，但都存在不足，如电镜检测方法复杂昂贵，病毒分离培养耗时极长且假阴性较多，在拿到培养结果后通常已失去临床意义，酶联免疫法检测的是病毒特异性抗体但一次仅能检测一种病毒。而基于核酸扩增的核酸检测，由于速度快(通常3小时内可完成检测)、灵敏度高、特异性好，在病毒检测领域正逐渐成为金标准。但上述方法难以做到对各不同亚型的流感病毒的统一检测。

本发明的目的即为提供一种能够同时检测大多数甲型流感病毒，且检测时间短、检测结果准确的方法及其试剂盒。具体的，本发明的试剂盒能够在1小时内完成，且操作简便，特异性强。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于检测流感病毒的引物组和探针。本发明的引物和探针是可用于NASBA(Nuclear acid sequence-based amplification，核酸依赖性扩增检测技术)检测的引物和探针。

NASBA是一项以RNA模板进行等温核酸扩增并能实时观测结果的检测方法。该技术的检测反应有赖于AMV逆转录酶、噬菌体T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、特别设计的特异性寡核苷酸引物和分子信标探针共同协作而完成。NASBA已经广泛应用于细菌、病毒等多种病原微生物的检测。

尽管RNA的扩增也可以使用反转录PCR技术(通过反转录形成单链DNA模板)，但与NASBA相比，NASBA则有自己的优势：可以在相对恒温的条件下进行(一般恒温为41摄氏度)。该技术主要用于医学诊断，相对传统的PCR技术更为稳定、准确。

本发明所提供的用于检测甲型流感病毒的引物组，由如下3条引物组成：由序列表中序列1所示的正向引物和序列2、序列3分别所示的两条反向引物组成。所述引物组基于甲型流感病毒保守NP基因序列设计，能够检测多种甲型流感病毒，但对乙型和丙型流感病毒无特异性。NP蛋白抗原稳定，不受抗原漂移的影响，通常是用来鉴定A、B和C型流感病毒的主要靶标。通过对不同甲型流感病毒NP基因序列比对，本申请发明人鉴定出基本在所有甲型流感病毒中均高度保守的一段NP基因序列，并基于该序列设计了一对引物(分别如序列1所示的正向引物和序列2所示的反向引物)和1条探针(如序列4所示)；但在实际临床应用检测中，本申请发明人发现，仍有一部分实际为甲型流感病毒患者不能使用上述引物和探针检测得出。通过对该部分患者样品中的病毒分离测序，发明人发现，这些患者中的甲型流感病毒，其NP基因序列在第1315位其发生了完全的变化，导致上述引物无法扩增该片段；而比对发现，上述新的NP基因在现有技术中并无记载。推测因为上述型甲型流感病毒相对少见，故尚未发现。基于上述发现，本发明人又设计了一条基于上述变化序列的反向引物(如序列3所示)；并将其与上述序列1和2所示引物组成3引物组合。

因此，本发明的第二个目的是提供一种用于检测流感病毒的试剂盒。本发明所提供的用于检测流感病毒的试剂盒，由所述引物组和探针组成；所述试剂盒包含3条引物和1条探针，所述3条引物由1条正向引物和2条反向引物组成；其中，所述正向引物，其序列如序列1所示；所述反向引物1，其序列如序列2所示；所述反向引物2，其序列如序列3所示；所述探针，其序列如序列4所示。

所述试剂盒中的探针的5’端标记有荧光报告基团，优选为荧光报告基团FAM；3’端标记有荧光淬灭基团，优选为荧光淬灭基团TAMRA。

任选的，所述试剂盒还含有内对照引物对和内对照探针，所述内对照引物对如序列表中序列5和序列6所示；所述内对照探针为序列表中序列7所示的探针；所述内对照探针的5’端标记有荧光报告基团，优选为荧光报告基团FAM；3’端标记有荧光淬灭基团，优选为荧光淬灭基团TAMRA。

任选的，所述试剂盒中还含有恒温扩增缓冲液；所述恒温扩增缓冲液的溶剂为无菌水，溶质及浓度如下：250mM pH 8.0的Tris-HCL，80mMDTT，15mM dNTP，15mM rNTP，60mMMgCl₂，250mM KCl，10％DMSO(V/V)，10mM DTT。

任选的，所述试剂盒中还含有恒温扩增酶溶液；所述恒温扩增酶溶液的溶剂为无菌水，溶质及浓度如下：AMV反转录酶1U/μl，T7 RNA聚合酶5U/μl，核糖核酸酶H 0.5U/μl，RNA酶抑制剂5U/μl，BSA0.5μg/μl。

本发明另一目的是提供一种检测甲型流感病毒方法，包括临床应用及非疾病诊断和治疗目的的检测，如实验室科研需要的检测。所述方法包括如下步骤：(1)核酸提取：取临床待测样本，进行病毒核酸提取；(2)恒温扩增：取15μl恒温扩增缓冲液、10μl恒温扩增酶溶液、25μl步骤(1)得到的临床样本溶液混合成50μl反应溶液，旋涡震荡均匀后注入装载有引物组和探针的扩增反应器中；将反应器至于恒温扩增仪，40℃反应50min；(3)结果判定：反应结束后，根据各反应腔中样本的扩增曲线确定所述待测样本液中是否含有相应的流感病毒的基因组；若所述待测样品产生S型扩增曲线，则所述待测样本中含有甲型流感病毒的基因组；反之，则所述待测样本中不含有相应流感病毒的基因组。

本发明提供的试剂盒支持高通量、快速、准确地检测流感甲型病毒感染；在临床使用中，能够在1小时内获得准确的检测结果，远远快于目前较为普遍采用的实时荧光定量PCR方法，对于流感监控具有非常重要的意义。

具体实施方式

为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测甲型流感病毒NASBA试剂盒的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中RNA提取试剂Trizol购自invitrogen公司；T7 RNA聚合酶、核糖核酸酶H、AMV逆转录酶、BSA购自Promega公司；dNTP、NTP购自上海生物工程有限公司。另外，购买两款商业化试剂盒A和B作为对照；试剂盒A为达安基因股份有限公司甲型流感病毒检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，试剂盒B为Alere BinaxNOW的甲型流感病毒抗原检测试剂盒(胶体金)。

实施例1、用于检测流感病毒的试剂盒的使用方法

(1)核酸提取：取临床待测样本，进行病毒核酸提取；

(2)恒温扩增：取15μl恒温扩增缓冲液、10μl恒温扩增酶溶液、25μl步骤(1)得到的临床样本溶液混合成50μl反应溶液，旋涡震荡均匀后注入装载有引物组和探针的扩增反应器中；将反应器至于恒温扩增仪，40℃反应50min；

(3)结果判定：反应结束后，根据各反应腔中样本的扩增曲线确定所述待测样本液中是否含有相应的流感病毒的基因组；若所述待测样品产生S型扩增曲线，则所述待测样本中含有甲型流感病毒的基因组；反之，则所述待测样本中不含有相应流感病毒的基因组。

实施例2、实际临床样品的检测

1.临床样本中病毒核酸的提取

临床样本病毒核酸提取选用商业化试剂盒进行，如QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)、Trizol(invitrogen公司)，并按找说明书进行病毒RNA提取；

2.扩增反应体系配制

取15μl恒温扩增缓冲液、10μl恒温扩增酶溶液、25μl上述步骤1中提取得到的RNA溶液，混合成50μl反应溶液，旋涡震荡均匀后注入装载有引物和探针的恒温扩增反应芯片；

所述恒温扩增缓冲液的溶剂为无菌水，溶质及浓度如下：250mM pH 8.0的Tris-HCL，80mMDTT，15mM dNTP，15mM rNTP，60mM MgCl₂，250mM KCl，10％DMSO(V/V)，10mM DTT。

所述恒温扩增酶溶液的溶剂为无菌水，溶质及浓度如下：AMV反转录酶1U/μl，T7RNA聚合酶5U/μl，核糖核酸酶H 0.5U/μl，RNA酶抑制剂5U/μl，BSA 0.5μg/μl。

3.恒温扩增反应和结果检测

将芯片置于恒温扩增仪中，设置40℃反应50min，并同时完成实时荧光扫描，并按照如下方法对结果进行判定：若所述待测样品产生S型扩增曲线，则所述待测样本中含有甲型流感病毒的基因组；反之，则所述待测样本中不含有相应流感病毒的基因组。

实施例3对比例设置

实验同时以购买的商业化试剂盒A和B(其中，试剂盒A为达安基因股份有限公司甲型流感病毒检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，试剂盒B为Alere BinaxNOW的甲型流感病毒抗原检测试剂盒(胶体金))用于本发明试剂盒检测结果的可靠性验证。对于本申请试剂盒检测为阳性，而其他对比例(试剂盒A或B)检测为阴性结果，后续通过对这些样本例进行重新采样后进行DNA测序鉴定。同时，对临床检测为乙型流感病毒样本同样进行本申请方法检测比较。

本申请所采用临床样本均来自于黑龙江省内医院，共783例，检测结果如下表1所示：

表1：本申请试剂盒与商业化试剂盒比较

通过对上述使用本申请试剂盒检测为阳性，而其他试剂盒检测为阴性的样本进行DNA测序鉴定，证明上述样本实际为甲型流感病毒感染；而使用引物2检测的3例阳性样品，经DNA测序鉴定也证实确实为甲型流感病毒，且其序列正是本申请发明人发现的新的NP基因型，在NP基因的第1315位后发生变化的少见类型甲型流感病毒。

也就是说，使用本发明试剂盒(正向引物+反向引物1和2)检测结果准确度更高(对于不一致结果，经多种手段验证，均为甲型流感病毒阳性)。也就是说，本申请的检测结果优于其他商业化检测试剂盒。

另外，对临床检测确认为乙型流感病毒样本108份，分别使用本申请试剂盒及商业化试剂盒A和B进行检测；检测结果如下表2所示。

表2：乙型流感病毒检测结果对比表

对于试剂盒A和B检测阳性样本进行DNA序列鉴定复核，最终确认其确实不含有甲型流感病毒。也就是说，本申请设计的引物和探针在针对甲型流感病毒的特异性上同样优于试剂盒A和B；对乙型流感病毒无特异性；而已有试剂盒对部分乙型流感病毒显示出特异性。

序列表

<110> 牡丹江医学院

<120> 一种甲型流感病毒检测引物、探针及其试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 1

ctcggtacag aggaaccttc c 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 2

actttccatc actcttatga 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 3

tgatttcgaa ttgcagtacc at 22

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)

<400> 4

cagtaggccc tgtgaacgcc gccataatag 30

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> nadh脱氢酶(nadh)

<400> 5

gctgctttta actctggtaa ag 22

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> nadh脱氢酶(nadh)

<400> 6

attctaatac gactcactat agggagaact tga 33

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> nadh脱氢酶(nadh)

<400> 7

cgtacgcttg tcatcaatgg aaatcccgta cg 32

Claims (8)

1.一种用于检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有基于甲型流感病毒NP靶标基因的引物和探针，所述引物和探针可通过NASBA法检测甲型流感病毒。

2.根据权利要求1所述的用于检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含3条引物和1条探针，所述3条引物由1条正向引物和2条反向引物组成；

其中，所述正向引物，其序列如序列1所示；

所述反向引物1，其序列如序列2所示；

所述反向引物2，其序列如序列3所示；

所述探针，其序列如序列4所示。

3.根据权利要求2所述的用于检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的用于检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA。

5.根据权利要求1-4任一项所述用于检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有内对照引物对和内对照探针，所述内对照引物对如序列表中序列5和序列6所示；所述内对照探针为序列表中序列7所示的探针；所述内对照探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA。

6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有恒温扩增缓冲液；所述恒温扩增缓冲液的溶剂为无菌水，溶质及浓度如下：250mM pH 8.0的Tris-HCL，80mMDTT，15mM dNTP，15mM rNTP，60mM MgCl₂，250mM KCl，10％DMSO(V/V)，10mM DTT。

7.根据权利要求1-7任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有恒温扩增酶溶液；所述恒温扩增酶溶液的溶剂为无菌水，溶质及浓度如下：AMV反转录酶1U/μl，T7RNA聚合酶5U/μl，核糖核酸酶H 0.5U/μl，RNA酶抑制剂5U/μl，BSA 0.5μg/μl。

8.一种使用权利要求1-7任一项所述试剂盒检测甲型流感病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)核酸提取：取临床待测样本，进行病毒核酸提取；

(2)恒温扩增：取15μl恒温扩增缓冲液、10μl恒温扩增酶溶液、25μl步骤(1)得到的临床样本溶液混合成50μl反应溶液，旋涡震荡均匀后注入装载有引物组和探针的扩增反应器中；将反应器至于恒温扩增仪，40℃反应50min；

(3)结果判定：反应结束后，根据各反应腔中样本的扩增曲线确定所述待测样本液中是否含有相应的流感病毒的基因组；若所述待测样品产生S型扩增曲线，则所述待测样本中含有甲型流感病毒的基因组；反之，则所述待测样本中不含有相应流感病毒的基因组。