CN104846125A - 一种用于检测mers的荧光rt-pcr引物、探针和试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于检测mers的荧光rt-pcr引物、探针和试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测中东呼吸综合征冠状病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其包括第一对和第二对引物和探针，所述第一对和第二对引物和荧光探针为分别针对中东呼吸综合征冠状病毒两个不同基因的保守序列设计的第一对和第二对特异性正反向引物和荧光探针。本发明还公开了用于检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒及检测方法。本发明对中东呼吸综合征冠状病毒两个不同基因的保守序列设计两对特异性探针和引物，双靶标PCR检测为阳性时即可确诊临床样本感染中东呼吸综合征冠状病毒，具有简便、快速、特异性高、灵敏度高的特点，可用于中东呼吸综合征冠状病毒的辅助诊断和疫情监控。

Description

一种用于检测MERS的荧光RT-PCR引物、探针和试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于体外核酸检测领域，本发明提供了一种用于检测临床样品中中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome，MERS)的荧光RT-PCRRT-PCR引物和探针和试剂盒及检测方法，可用于中东呼吸综合征冠状病毒的临床早期诊断。
技术背景
2012年9月首次报告了2例临床表现类似于SARS的新型冠状病毒感染病例。2013 年5月23日，世界卫生组织（WHO）将这种新型冠状病毒感染疾病命名为“中东呼吸综合征”(Middle East Respiratory Syndrome，MERS)。自2012年9月至2015年5月25日，全球共有24个国家累计报告MERS确诊病例1139例，431人死亡，病死率37.8%。其中，沙特病例集中地区，截至当日，沙特累计报告MERS确诊病例1005例，死亡440人，占全球累计报告病例数的88.2%，病死率43.8%。2015年5月28日，我国发现并确诊了首例输入性中东呼吸综合征感染病例，之前的研究表明，MERS的传染性很有限，但是随着近期韩国国内方面首次确诊了三次感染患者，表明该病毒可能已经具备了持续的人传人能力，疫情风险进一步加大，同时由于我国与中东地区存在商务、宗教交流、旅游等一定规模人员往来，存在疫情进一步的输入风险。
中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）属于冠状病毒科,β类冠状病毒的2c亚群，是一种具有包膜、基因组为线性非节段单股正链的RNA病毒。病毒粒子呈球形，直径为120-160 nm。基因组全长约30kb。目前已经完成多株MERS-CoV的全基因组序列测定，从基因组序列分析， MERS-CoV与SARS基因组相似性为55%左右。2014年分别从沙特地区一个MERS-CoV感染病人及其发病前接触过的单峰骆驼体内分离出基因序列完全相同的MERS-CoV，同时在埃及、卡塔尔和沙特其他地区的骆驼中也分离到和人感染病例分离病毒株相匹配的病毒，并在非洲和中东的骆驼中发现MERS-CoV抗体，因而骆驼可能是人类感染来源。但不排除蝙蝠或其他动物也可能是中东呼吸综合征冠状病毒的自然宿主。
目前尚无明确有效的抗中东呼吸综合征冠状病毒药物，因此控制疫情的进一步发展主要靠及时的发现和隔离。
实时荧光PCR技术，通过引入特异性探针和荧光信号的动态监测使PCR产物的扩增及分析的全过程可以在单管内封闭完成，并且可以对PCR扩增产物进行实时动态监测及自动分析结果，具有实时、准确、快速、简便等特点，是一种先进的分子检测技术。
发明内容
本发明目的是提供一种用于多重实时荧光RT-PCR技术检测中东呼吸综合征冠状病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，及包括该荧光RT-PCR引物和荧光探针的试剂盒和使用该荧光RT-PCR引物和荧光探针对中东呼吸综合征冠状病毒的检测方法，该检测方法可以快速、定性检测临床样本中的中东呼吸综合征冠状病毒。
为实现上述目的，本发明的技术方案是针对于中东呼吸综合征冠状病毒两个不同的基因编码区的特异保守区域为靶标区域，设计两对特异性引物及荧光探针，同时设置了内标质控系统，用于整的核酸提取和反应体系的质量控制。内标靶区选取与中东呼吸综合征冠状病毒第一对保守目标区域一致，并在探针位置人工合成一段寡核苷酸，再根据该寡核苷酸设计特异性荧光探针，与任何物种均无交叉反应。
一种用于检测中东呼吸综合征冠状病毒(MERS)的荧光RT-PCR引物和荧光探针，引物和荧光探针包括第一对和第二对引物和荧光探针，所述第一对和第二对引物和荧光探针为分别针对中东呼吸综合征冠状病毒两个不同基因的保守序列设计的第一对和第二对特异性正反向引物和荧光探针。
作为本发明的进一步改进，所述第一对正向、反向引物和荧光探针序列分别是：
正向引物：5'-CCAACTAAGAAACTGCGCTACGT-3'
反向引物：5'-TGTAACCCTGACATAGTGTGTTGGT-3'
寡核苷酸探针：5'-AGCGTAGATTTTCTCTTCTGCGCCCTGAA-3'；
所述第二对正向、反向引物和荧光探针序列如下：
正向引物：5'-TTGCGTGATTATTTAGCTGACTATGAC-3'
反向引物：5'-TCCTGTACCACCAACATTAATAGCA-3'
寡核苷酸探针：5'-TCACTGCCGGCCCATTCATGG-3'；
上述第一对荧光探针和第二对荧光探针的3'端标记有荧光淬灭基团，5' 端分别标记有不同的荧光报告基团。
上述引物和探针的衍生序列也为本发明的保护范围，所述衍生序列包括引物序列的互补链序列，同时还可以向5' 端和3' 端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
一种Taqman探针法荧光RT-PCR检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒，其包含RT-PCR反应液、酶混合液、内标溶液、阴性质控品、阳性质控品、弱阳性质控品, 其中RT-PCR反应液主要是dATP、dUTP、dGTP、dCTP等四种核苷酸、用于检测中东呼吸综合征冠状病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针以及内标探针、含有镁离子的缓冲液组成。其中试剂盒内标寡核苷酸探针序列如下：
寡核苷酸探针：5'-ACGACTCCTCGCCTTCGGCTCATC-3'，该探针的5' 端标记有与第一对荧光探针和第二对荧光探针5' 端标记的荧光报告基团均不同的荧光报告基团，3' 端标记有荧光淬灭基团；
作为本发明的进一步改进，所述荧光报告基团选自FAM、JOE 或ROX；所述荧光淬灭基团为BHQ。
作为本发明的进一步改进，所述荧光报告基团选自TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ或Lowa BlackTM FQ。
其中所述的酶混合液为包含有热启动的Taq DNA 聚合酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂（RNasin）的缓冲液。
其中所述的内标溶液为含有内标区域选取与中东呼吸综合征冠状病毒第一对保守目标区域一致，并在探针位置人工合成一段多核苷酸的内标质粒。
其中所述的阳性质控品为含插入中东呼吸综合征冠状病毒特异性保守序列的质粒载体，该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中增殖后经提取纯化用分光光度计测定浓度和纯度后用无菌TE缓冲液稀释。其中阳性质控品的浓度为1.0×106copies/ml。
其中所述的阴性质控品为无菌TE缓冲液，该缓冲液采用DEPC水配制。
本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
一种用于检测中东呼吸综合征冠状病毒的荧光RT-PCR方法，包括以下步骤：
1)        样本RNA的提取：所述样本RNA可以采用深圳市易瑞生物技术有限公司生产病毒RNA磁珠提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取，所要注意的是在提取前要将内标溶液加入到样本中一起提取。
2)        以待检测样本RNA为模板，加入RT-PCR反应液、酶混合液等配成RT-PCR反应体系，进行扩增反应，其中反应体系如下：RT-PCR反应液19μl、酶混合液1μl、RNA模板5μl。其中，RT-PCR反应液中的用于检测中东呼吸综合征冠状病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针以及内标探针具体如下：
第一对中东呼吸综合征冠状病毒特异性的正向、反向引物和探针序列分别是：
正向引物：5'-CCAACTAAGAAACTGCGCTACGT-3'
反向引物：5'-TGTAACCCTGACATAGTGTGTTGGT-3'
寡核苷酸探针：5'-FAM-AGCGTAGATTTTCTCTTCTGCGCCCTGAA-BHQ1-3'，
第二对中东呼吸综合征冠状病毒特异性的正向、反向引物和探针序列如下：
正向引物：5'-TTGCGTGATTATTTAGCTGACTATGAC-3'
反向引物：5'-TCCTGTACCACCAACATTAATAGCA-3'
寡核苷酸探针：5'-JOE-TCACTGCCGGCCCATTCATGG-BHQ2-3'，
内标寡核苷酸探针序列如下：
寡核苷酸探针：5'-ROX-ACGACTCCTCGCCTTCGGCTCATC-BHQ2-3'。
3)        RT-PCR扩增按照以下程序进行RT-PCR扩增：
                                                
4)        结果分析：
4.1  实验结束后保存检测数据文件。
4.2  分析条件设置：根据分析后图像调节基线（Baseline）的Start值、Stop值以及阈值（Threshold）的Value值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3~15、end值可以在5~20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），使仪器给出正确的结果。
5)        质量控制
5.1 阴性对照：FAM通道、JOE通道和ROX通道均无扩增曲线，Ct值显示为Undet或No Ct；
5.2阳性对照：FAM通道和JOE通道均有扩增曲线，Ct值均≤32；ROX通道无扩增曲线，Ct值显示为Undet 或No Ct；
以上两个要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。
6)        结果判读
6.1  当FAM通道和JOE通道均有扩增曲线，且Ct值均≤37，ROX通道有和无扩增曲线时均可判定MERS阳性；
6.2  当FAM通道和JOE通道均无扩增曲线，且Ct值显示为Undet或No Ct，ROX通道有扩增曲线时可判定MERS阴性；
6.3  当FAM通道和JOE通道其中一个通道有扩增曲线，且Ct值均≤37，另一个通道无扩增曲线或Ct值＞37，ROX通道有或无扩增曲线时，建议重新进行实验，或对扩增产物进行测序鉴定。
需要说明的是，上述采用的荧光报告基团符合两对荧光探针和内标探针具有不同的荧光报告基团的条件，不仅仅是上述的FAM、JOE、ROX，还可以是其他具有相同作用的荧光报告基团。
Ct 值（cycle threshold，Ct）的定义为 ：每个反应管内荧光信号达到设定阈值时 所经历的循环数。阈值的设定一般是将其设定为恰好可以覆盖住阴性对照和空白对照的荧 光值处，因此可以很好的去除反应管荧光值即背景。
本发明可以实现单管同时中东呼吸综合征冠状病毒两个不同的靶基因区域，其它检测技术相比具有以下优点：
1、全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；2、采用双靶标RT-PCR设计，确保检测结果的准确性，同时满足国卫办发布的《中东呼吸综合征病例诊疗方案-2014年版》确诊病例要求，3个小时即可出诊断结果，大大缩短检测时间；3、实现单管三重检测，同时引入了内标质控，提高了检测人员的检测效率，监控抽提效率和排除抑制剂干扰；4、探针法荧光定量PCR技术特有的优势，即特异性更强、灵敏度更高，完全满足疫情快速诊断和全程监控，为疫情早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。
附图说明
图1：中东呼吸综合征冠状病毒检测试剂盒的FAM通道线性实验数据。图中S1-S9表示浓度为1.0×1010copies/ml、1.0×109copies/ml、1.0×108copies/ml、1.0×107copies/ml、1.0×106copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×103copies/ml、5.0×102copies/ml的阳性质控品扩增曲线，各1个重复数据，CK为阴性质控品，横坐标cycle表示扩增循环数，纵坐标△Rn表示荧光强度。通过该图可以说明该试剂盒的在1.0×1010copies/ml至1.0×103copies/ml之间具有很好的线性关系。
图2：中东呼吸综合征冠状病毒检测试剂盒的检测限实验示意图。其中S6-S8分别为1.0×105copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×103copies/ml，各20次重复数据，该图说明该试剂盒的检测限达到5copies/反应。
图3：中东呼吸综合征冠状病毒检测试剂盒的特异性实验数据。图中横坐标cycle表示扩增循环数，纵坐标△Rn表示荧光强度，CK代表阴性质控品，A代表MERS阳性质控品FAM通道扩增曲线，B代表MERS阳性质控品JOE通道扩增曲线，C代表MERS阳性质控品ROX通道扩增曲线，特异性参考品分别为甲型H1N1流感病毒、H7N9禽流感病毒、甲型H3N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、冠状病毒229E、肠道腺病毒、流行性感冒病毒A型。这8种特异性参考品均未有典型的“S”型扩增曲线，说明该试剂盒特异性良好。
图4：中东呼吸综合征冠状病毒检测试剂盒的阳性参考品实验数据。图中A代表MERS阳性质控品FAM通道扩增曲线，B代表MERS阳性质控品JOE通道扩增曲线，C代表MERS阳性质控品ROX通道扩增曲线，各3次重复数据，CK代表阴性质控品，横坐标cycle表示扩增循环数，纵坐标△Rn表示荧光强度。
具体实施方式
本发明具有用于检测中东呼吸综合征冠状病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针的试剂盒及检测方法采用Taqman探针法荧光PCR检测技术，快速检测临床样品中中东呼吸综合征冠状病毒特有序列，从而判断样品中是否存在中东呼吸综合征冠状病毒。下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特色将会随着描述而更加清楚。这些实施例仅是示范性，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，凡是利用本发明内容所做的等效结构或等效流程变换，直接或间接运用于其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。试剂盒在检测中东呼吸综合征冠状病毒的使用方法即检测方法，下面以试剂盒为例进行线性实验、最低检测限实验、特异性实验和阳性质控品实验。
实施例1试剂盒第一对探针的线性实验
第一对靶标探针标记为FAM荧光基团，该试剂盒的FAM通道的线性参比品，由含有第一对靶目的片段的质粒组成，采用TE缓冲液将阳性质粒进行10倍的梯度稀释得到下列梯度溶液（S1：1.0×1010copies/ml、S2：1.0×109copies/ml、S3：1.0×108copies/ml、S4：1.0×107copies/ml、S5：1.0×106copies/ml、S6：1.0×105copies/ml、S7：1.0×104copies/ml、S8：1.0×103copies/ml、S9：1.0×102copies/ml、）作为FAM通道的线性参比品，通过该实验表明该试剂盒的在1.0×1010copies/ml至1.0×103copies/ml之间具有很好的线性关系，实验结果参考图1。
实施例2试剂盒的最低检测限实验
该实验验证试剂盒的最低检测限，采用FAM通道的线性参比品中的S6：1.0×105copies/ml、S7：1.0×104copies/ml、S8：1.0×103copies/ml等浓度的阳性质粒作为第一对探针的检测限参比品，通过该实验表明该试剂盒的检测限达到5copies/反应，实验结果参考图2。
实施例3 试剂盒的特异性实验
该实验选择与中东呼吸综合征冠状病毒具有相同感染感染部位的常见病原体作为特异性参考品，采用的是灭活临床阳性样本。特异性参考品分别为甲型H1N1流感病毒、H7N9禽流感病毒、甲型H3N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、冠状病毒229E、肠道腺病毒、流行性感冒病毒A型。利用深圳市易瑞生物技术有限公司研发的通用性病毒RNA提取试剂盒提取以上灭活样本中的RNA作为模板进行实验，实验数据表明这8种特异性参考品均未有典型的“S”型扩增曲线，说明该试剂盒特异性良好，实验结果参考图3。
实施例4 试剂盒的阳性质控品实验
该试剂盒的阳性质控品为含有中东呼吸综合征冠状病毒特异型保守目标序列的pUC57载体质粒。第一对靶标目的质粒和第二对靶标目的质粒浓度相同，均为1×106copies/ml为验证试剂盒的内标的有效性，加入了浓度为2×104copies/ml包含内标引物扩增的目标片段的载体质粒。通过实验数据表明该试剂盒阳性质控品和内标溶液扩增效果优异，实验结果参考图4。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测中东呼吸综合征冠状病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其特征在于，引物和荧光探针包括第一对和第二对引物和探针，所述第一对和第二对引物和荧光探针为分别针对中东呼吸综合征冠状病毒两个不同基因的保守序列设计的第一对和第二对特异性正反向引物和荧光探针。
2.如权利要求1所述的用于检测中东呼吸综合征冠状病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其特征在于，
所述第一对正向、反向引物和荧光探针序列分别是：
正向引物：5'-CCAACTAAGAAACTGCGCTACGT-3'
反向引物：5'-TGTAACCCTGACATAGTGTGTTGGT-3'
寡核苷酸探针：5'-AGCGTAGATTTTCTCTTCTGCGCCCTGAA-3'；
所述第二对正向、反向引物和荧光探针序列如下：
正向引物：5'-TTGCGTGATTATTTAGCTGACTATGAC-3'
反向引物：5'-TCCTGTACCACCAACATTAATAGCA-3'
寡核苷酸探针：5'-TCACTGCCGGCCCATTCATGG-3'；
上述第一对荧光探针和第二对荧光探针的3' 端标记有荧光淬灭基团，5' 端分别标记有不同的荧光报告基团。
3.如权利要求1所述的用于检测中东呼吸综合征冠状病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、JOE 或ROX；所述荧光淬灭基团为BHQ。
4.如权利要求1所述的用于检测中东呼吸综合征冠状病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其特征在于，所述荧光报告基团选自TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ或Lowa BlackTM FQ。
5.一种Taqman探针法荧光RT-PCR检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括RT-PCR反应液、酶混合液、内标溶液、阳性质控品、阴性质控品；其中所述RT-PCR反应液含有内标探针和如权利要求1至4任一所述的荧光RT-PCR引物和荧光探针。
6.如权利要求5所述的荧光RT-PCR检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述内标探针序列如下：
寡核苷酸探针：5'-ACGACTCCTCGCCTTCGGCTCATC-3'；
该探针的5' 端标记有荧光报告基团，3' 端标记有荧光淬灭基团。
7.如权利要求5所述的荧光RT-PCR检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有插入中东呼吸综合征冠状病毒特异型保守序列的pUC57载体质粒。
8.如权利要求5所述的荧光RT-PCR检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为无菌TE缓冲液。
9.如权利要求5所述的荧光RT-PCR检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述内标溶液为含有内标区域选取与中东呼吸综合征冠状病毒第一对保守目标区域一致，并在探针位置人工合成一段多核苷酸的内标质粒。
10.一种用于检测中东呼吸综合征冠状病毒的荧光RT-PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）检测样品RNA模板的制备；
2）配制含有内标探针和权利要求1至4任一所述的荧光RT-PCR引物和荧光探针的反应体系，对RNA模板进行扩增，反应条件为：第一阶段：50℃ 15min，95℃ 2min，1个循环；第二阶段：95℃ 10s，60℃ 40s，40个循环；第二阶段每个循环结束后收集荧光信号；所述荧光探针和内标探针分别对应三个荧光检测通道，分别为第一荧光探针通道、第二荧光探针通道和内标探针通道；
3）反应结束后，读取并记录三个检测通道扩增曲线及扩增循环数Ct，根据扩增曲线和扩增循环数进行检测结果的判断：当第一和第二荧光探针通道均有扩增曲线，且Ct值均≤37，可判定MERS阳性；当第一和第二荧光探针通道均无扩增曲线，且Ct值显示为Undet或No Ct，内标探针通道有扩增曲线时可判定MERS阴性；当第一和第二荧光探针通道其中一个通道有扩增曲线，且Ct值均≤37，另一个通道无扩增曲线或Ct值＞37，本次实验无效或对扩增产物进行测序鉴定。
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